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A doença de Chagas (tripanosomíse americana), é uma infecção causada pelo protozoário flagelado Trypanosoma cruzi.¹ Diferentes métodos têm sido utilizados no diagnóstico da doença de Chagas na fase crônica. Os testes sorológicos como hemaglutinação, ELISA, imunofluorescência e fixação do complemento, detectam anticorpos anti T. cruzi, tendo alta sensibilidade, mas baixa especificidade, resultando em reações cruzadas com gêneros de Leishmania e Trypanosoma rangeli. No entanto, os testes parasitológicos como hemocultura e xenodiagnóstico têm alta especificidade, mas baixa sensibilidade, principalmente nos casos crônicos, onde a parasitemia é baixa.² A PCR, utilizada como diagnóstico molecular, representa especificidade e sensibilidade necessárias ao diagnóstico da doença de Chagas em pacientes com sorologia duvidosa para tal enfermidade.³
A reação em cadeia da polimerase (PCR)⁴ tem como princípio amplificar fragmentos específicos de DNA a partir de substratos complexos e em concentrações diminutas. A PCR é capaz de aumentar o fragmento gênico escolhido, por meio da síntese enzimática de numerosas cópias (10⁵ a 10⁶) do fragmento original. O procedimento consiste em repetidos ciclos de síntese de DNA por meio de dois oligonucleotídeos (iniciadores) com orientações opostas, isto é, dois segmentos de aproximadamente 20 nucleotídeos com seqüências complementares às duas extremidades do fragmento alvo, e levados a efeito por uma reação enzimática mediada pela polimerase de atividade em altas temperaturas (Taq DNA polimerase). Cada ciclo de reação de amplificação é constituído por três fases distintas; a primeira consiste na separação das hélices do DNA a ser amplificado; a segunda consiste na ligação complementar entre os iniciadores e o DNA e, por último, a síntese do DNA pela Taq DNA polimerase.⁵
O produto de extensão de um iniciador é utilizado como substrato para o outro, resultando, em cada ciclo, na duplicação da quantidade de DNA sintetizada no ciclo precedente. Com isso, o número de cópias de fragmento alvo tem um aumento exponencial e, no final de 30 ciclos ocorre um aumento da ordem de 10⁶ cópias, tendo-se partido de uma única célula. A seguir, pode-se visualizar o produto amplificado após o fracionamento em gel, por coloração direta e/ou hibridização com sondas específicas marcadas.^6-9
A "nested" PCR ou PCR dupla, utiliza iniciadores internos aos da primeira reação, aumentando com isso a sensibilidade e especificidade da técnica, sendo menos complexa que a hibridização com sondas marcadas, no que diz respeito ao tempo de realização e à utilização de isótopos radioativos. É utilizada em casos onde o número de cópias alvo é extremamente baixo, ou a especificidade absoluta é essencial, demonstrando ser o mais eficiente método de otimização da PCR.^10,11
Tal reação tem sido utilizada em nosso laboratório, como técnica de rotina em pacientes imunossuprimidos, transplantados de medula óssea e transplantados renais, no controle da doença causada pelo citomegalovírus (CMV).^11,12 Esta técnica, também é empregada para identificar o HIV em crianças recém nascidas, filhas de mães soropositivas.¹³ Além disso, em pacientes HIV positivos, identificou-se o herpesvírus humano do tipo 8 (HHV8) em lesões de sarcoma de Kaposi.¹⁴
Baseando-se nos trabalhos anteriores,^7,15 padronizamos a PCR dupla para identificar o T. cruzi em amostras de pacientes chagásicos crônicos e aplicamos essa técnica nos pacientes com sorologia duvidosa. Como DNA alvo, utilizamos um fragmento do genoma nuclear do parasita, chamado de DNA satélite, de aproximadamente 149 pares de base, após a segunda reação. Obtivemos uma sensibilidade de 86% em comparação às sorologias convencionais em pacientes chagásicos crônicos. Ainda nesse trabalho esclarecemos onze casos em um grupo de vinte e oito pacientes com sorologia duvidosa que seguem tratamento no HC/UNICAMP, pelo grupo GEDoCh.³
No presente relato, iremos comparar os dados obtidos com as sorologias e PCR dupla nos pacientes com sorologias consideradas duvidosas pelas técnicas convencionais.
Para tal estudo, analisamos um grupo de 29 pacientes encaminhados ao GEDOCH/UNICAMP, portadores de sorologia duvidosa para a doença de Chagas e um paciente com sorologias negativas e epidemilogia positiva. Foi considerado com sorologia duvidosa, aquele paciente que apresentou apenas um dos testes positivos dos realizados (imunofluorescência indireta e/ou ELISA e/ou hemaglutinação e/ou fixação do complemento), e os que apresentaram sorologias limítrofes ao nível considerado. Além disso, estudamos amostras de dez pessoas com dois exames sorológicos negativos (IFI e ELISA), como controle negativo da investigação. As sorologias foram realizadas pelo Laboratório de Patologia Clínica do Hospital das Clínicas e pelo laboratório de sorologia do Hemocentro, ambos da UNICAMP, conforme as normas de tais laboratórios. A pesquisa foi aprovada pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade de Ciências Médicas / UNICAMP, e a autorização por parte dos pacientes foi feita através de um termo de consentimento pós-informação.
Para obtenção do DNA, foram coletadas amostras de sangue periférico (cerca de 10 ml) dos pacientes a serem estudados, e este sangue foi submetido à extração do material genético conforme o protocolo descrito.¹⁶ A partir disso realizamos a PCR dupla para o gene da β-globina humana, para verificação da qualidade do DNA obtida. Para tal reação, foram utilizadas as seqüências nucleotídicas para a primeira reação P3 – 5'AGACAGAGAAGACTCTTG 3' (sense) e P5 - 5'TCATTCGTCTGTTTCCCATTC 3' (antisense). Para a segunda reação, foram utilizados os iniciadores P3 e 109 - 5'CCCTTCCTATGACATGAACTTAACCAT 3' (antisense), que amplificam um produto final de 365 pares de base.
Para a PCR, em tubo tipo "eppendorf" foi adicionado 0.8 a 1.0 μl do DNA a ser estudado (extraído das amostras de sangue periférico); 50 mM de cloreto de potássio; 10 mM de Tris-HCl (pH 8,4); 2,5 mM de cloreto de magnésio; 0.1 mM de cada oligonucleotídeo (P3, P5 e 109), mistura desoxirribonucléica (1 mM) - dNTPs (dATP, dGTP, dCTP; dTTP) e 2.0 U de Taq DNA polimerase (Gibco – BRL). A esta mistura de reação, foi adicionada água completando um volume final de reação de 20 μl. Adicionou-se a esta mistura, 50 μl de óleo mineral para prevenir a evaporação dos reagentes.Trinta e cinco ciclos foram realizados em termociclador automático, que foram precedidos de uma desnaturação inicial a 94C por 5 minutos, e no final uma extensão a 72C por 7 minutos. Os 35 ciclos de amplificação para a primeira e para a segunda PCR foram padronizados com as seguintes temperaturas: desnaturação a 94°C por 1 minuto; anelamento a 55°C por 1 minuto; extensão: 72C por 1 minuto.
Após a verificação da qualidade do DNA extraído, as amostras foram então submetidas a PCR dupla para investigação do DNA do T. cruzi, onde um fragmento alvo do DNA satélite de 195 pares de base, e de 149 pares de base foram gerados a partir da primeira e segunda reação, respectivamente. Para tal reação, foram utilizados os seguintes iniciadores para a primeira reação: TCZ1- 5´GCAGCTCTTGCCCACACGGGTGCT 3´ (sense); TCZ2 - 5´ CCTCCAAGCAGCGGATAGTTCAGG 3´ (antisense); Para a segunda reação, foram utilizados os iniciadores: TCZ3 – 5´ TGCTGCASTCGGCTGATCGTTTTCGA 3´ (sense) e TCZ4 – 5´ CARGSTTGTTTGGTGTCCAGTGTGTGA 3´ (antisense), que amplificam 188 pares de base na primeira reação e 149 pares de base na segunda reação.^3,15
Para a primeira reação, em tubo tipo "eppendorf" foi adicionado 0.8 a 1.0 μl do DNA a ser estudado (extraído das amostras de sangue periférico); 50 mM de cloreto de potássio; 10 mM de Tris-HCl (pH 8.4); 2.5 mM de cloreto de magnésio; 0.1 mM de cada oligonucleotídeo (TCZ1 e TCZ2; TCZ3 eTCZ4), mistura desoxirribonucléica (1 mM) - dNTPs (dATP, dGTP, dCTP; dTTP) e 2.0 U de Taq DNA polimerase (Gibco – BRL). A esta mistura, foi adicionada água completando um volume final de reação de 20 μl, além de 50 μl de óleo mineral para prevenir a evaporação dos reagentes. Para a segunda PCR (PCR dupla), houve mudança na concentração de MgCL₂ em relação à primeira para 2.8 mM. Nesta reação, uma alíquota (0.8 a 1.0 μl) do produto da primeira PCR foi reamplificada com um par de oligonucleotídeos (TCZ3 e TCZ4), que resultou em um fragmento de 149 pares de base, interno ao fragmento amplificado na primeira reação (188 pb).
Foram empregados ciclos diferenciados em termociclador automático para a primeira e segunda reação. Ambas reações foram precedidas de uma desnaturação inicial a 94C por 5 minutos e uma extensão final a 72C por 7 minutos. Na primeira reação, foram utilizados 30 ciclos, que compreenderam desnaturação a 94C por 1 minuto; anelamento a 60C por 1 minuto; extensão a 72C por 1 minuto e trinta segundos. Com estas temperaturas foram realizados cinco ciclos na primeira reação. Nos próximos vinte e cinco ciclos foram utilizados: desnaturação a 94C por 1 minuto: anelamento a 65C por 1 minuto; extensão: 72C por 1 minuto e trinta segundos.
Para a segunda PCR, empregamos 25 ciclos, precedidos de uma desnaturação inicial a 94C por 5 minutos e uma extensão final a 72C por 7 minutos. Nos ciclos foram utilizadas: desnaturação a 94C por 40 segundos; anelamento a 55C por 40 segundos; extensão a 72C por 1 minuto.
Após a amplificação, cerca de 6.0 μl do produto da PCR dupla (DNA nuclear) e da PCR para o gene da β-globina humana, acrescidos de 2.0 μl do corante azul de bromofenol, foram submetidos à eletroforese em gel de agarose a 2% corado com brometo de etídio e visualizado sobre luz ultravioleta. Nas amostras positivas, observou-se um fragmento de 149 pares de base (figura 1), quando realizada a PCR dupla, em fragmento de DNA nuclear. Como controle positivo da reação, utilizamos um macerado da cepa Y do T. cruzi; como controle negativo, utilizamos amostras de pessoas com sorologias e epidemiologia negativas para a doença de Chagas; e como branco da reação utilizamos água. Em todas as amostras testadas neste trabalho, houve amplificação do gene da β-globina humana de 365 pares de base (figura 2) realizados a partir de uma PCR dupla, indicando a boa qualidade do DNA extraído.

Figura 1. Amplificação do fragmento de 149 pb do DNA nuclear do T. cruzi pela PCR dupla (oligonucleotídeos TCZ3 e TCZ4), visualizado em gel de agarose a 2% corado com brometo de etídio em pacientes com sorologia positiva e duvidosa para doença de Chagas. M - Marcador de peso molecular (Ladder 100 pb, Gibco – BRL, USA); C+: Controle positivo para PCR dupla (cepa Y do T. cruzi); C- Controle negativo para a PCR dupla (paciente com epidemiologia negativa para doença de Chagas); B - Branco da reação (água destilada); 1 e 2: pacientes com sorologia positiva para doença de Chagas e PCR dupla positiva; 3 e 4 - paciente com sorologia duvidosa para a doença de Chagas e PCR dupla positiva.

Figura 2. Amplificação do fragmento de 365 pb do gene da β-globina humana pela PCR dupla, com os oligonucleotídeos P3 e 109, visualizado em gel de agarose a 2% corado com brometo de etídio em pacientes com sorologia positiva e duvidosa para doença de Chagas. M: marcador de peso molecular (Ladder 100 pb, Gibco – BRL, USA); C+: controle positivo para a reação (amostra de DNA humano testada anteriormente); 1 e 2 ; PCR dupla positiva para a β-globina em pacientes com sorologia positiva para doença de Chagas; 3 e 4 : PCR dupla positiva para a β-globina em paciente com sorologia duvidosa para a doença de Chagas; B - Branco da reação (H2O).

Para fins comparativos, realizamos o seqüenciamento genético automatizado do fragmento de 149 pares de base (pb) obtido a partir da PCR dupla em 03 pacientes com sorologia duvidosa e PCR dupla positiva, envolvidos em nosso estudo. O seqüenciamento automatizado foi realizado no aparelho "ABI PRISM 310 Genetic Analyser" da "Biosystems". Foram seqüenciados os produtos da PCR dupla (região do DNA nuclear) de 3 amostras com sorologia duvidosa. Estas amostras apresentaram, no gel de agarose corado, bandas bem definidas, sem excesso de reagentes ou bandas inespecíficas. Das amostras selecionadas, os produtos amplificados a partir da PCR dupla foram purificados com o "Kit" da QIAGEN (QIAquick PCR Purification kit) seguindo as normas descritas pelo fabricante. Para o seqüenciamento, os produtos da PCR dupla purificados, foram quantificados utilizando-se um marcador de massa molecular (Load mass – GIBCO – BRL), através de uma corrida em gel de agarose 1.5% corado com brometo de etídio e visualização das bandas sobre luz U.V. A comparação da intensidade das bandas obtidas com as bandas do marcador permitiu estimar a quantidade de DNA presente nas amostras.
Foram utilizados de 15 a 45 ng do DNA purificado a partir da PCR dupla para uma reação de 10 μl, contendo 3 μl de Big Dye Terminator Ready Reaction ("ABI PRISM Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit") e 1 μl de um dos oligonucleotídeos iniciadores (TCZ3 e TCZ4) utilizados na PCR dupla, adicionando-se água até o volume final. As condições do seqüenciamento foram as seguintes: desnaturação inicial a 96C por 10 segundos, hibridização dos oligonucleotídeos a 57C por 5 segundos e extensão a 60C por 4 minutos, sendo processados 25 ciclos; e uma extensão final a 60°C por 10 segundos. As amostras foram analisadas em seqüenciador automático ABI PRISM 310 e comparadas às seqüências descritas por MOSER e colaboradores (1989).
Das vinte e nove amostras (29) dos pacientes com sorologia duvidosa, submetidas a PCR dupla para investigação do DNA do T. cruzi, treze (13) apresentaram resultados positivos, ou seja, cerca de 45%. Além disso, um paciente que apresenta epidemiologia positiva para doença de Chagas, inclusive com cirurgia para correção de megaesôfago com sorologia e xenodiagnóstico negativos (tabela 1), apresentou PCR dupla positiva. Portanto, a PCR como ferramenta molecular no diagnóstico da tripanossomíase americana, tem grande importância no esclarecimento desses casos.



O diagnóstico por métodos de biologia molecular, como a PCR, tem sido proposto como uma boa alternativa para a detecção do T. cruzi em DNA extraído de sangue humano, pois os testes sorológicos para detecção do T. cruzi no sangue são sensíveis, mas sua especificidade é geralmente insatisfatória. Por outro lado, testes de diagnóstico parasitológico como o xenodiagnóstico ou a hemocultura, são altamente específicos, porém têm baixa sensibilidade.¹⁷
Oligonucleotídeos específicos de regiões conservadas da cadeia do kDNA e DNA nuclear do parasita têm sido utilizados para amplificação gênica em pacientes infectados. A elevada sensibilidade da PCR permite a detecção de quantidades reduzidas de DNA, facilitando o diagnóstico de indivíduos doentes, mas com baixo número de parasitas no sangue, tendo grande importância no diagnóstico de pacientes chagásicos crônicos e com sorologia duvidosa.^17-20 Primeiramente utilizamos como molde de amplificação da seqüência do T. cruzi, regiões do k DNA, localizados nos minicírculos do cinetoplasto. Com esta região, testamos 30 pacientes com sorologia positiva e 11 com sorologia duvidosa, com positividade pela PCR em 23 dos pacientes com sorologia positiva e 06 pacientes com sorologia duvidosa. A utilização da PCR com estes iniciadores não foi finalizada devido às dificuldades de padronização. Nesta etapa, várias mudanças foram realizadas quanto à concentração de reagentes, DNA e ciclos de amplificação. Foram testadas técnicas já descritas como o "hot start", que consiste na realização da PCR em duas fases: na primeira, realiza-se a desnaturação da fita dupla de DNA; e na segunda fase é adicionada a enzima (Taq DNA Polimerase) para anelamento dos oligonucleotídeos e extensão.^8,21,22 Nesse caso, o risco de contaminação é maior devido à manipulação extra das amostras. Também utilizamos a enzima Platinum Taq DNA Polimerase (GIBCO - BRL), com a finalidade de minimizar as bandas inespecíficas e obtivemos alguma melhora nos resultados. Entretanto, o k DNA possui seqüências genéticas repetidas que se pareiam no momento da amplificação pela PCR, resultando em produtos inespecíficos que interferem na observação do produto esperado de 330 pares de base. Estudos posteriores serão necessários para a padronização da PCR nesta região.
A utilização de um segmento repetitivo de 195 pares de base da região do DNA nuclear, como molde para amplificação pela PCR para o diagnóstico de pacientes chagásicos foi descrita,^3,7 inclusive demonstrando que a PCR é significativamente mais sensível para a detecção do parasita em triatomíneos alimentados com sangue de pacientes chagásicos crônicos que a visualização microscópica.²³ A especificidade é comprovada entre outros autores que testam a PCR em várias cepas do parasita, pacientes chagásicos na forma aguda e demonstra a importância do método para o esclarecimento de casos de filhos nascidos de mães chagásicas.^24,25 Em seres humanos e outros mamíferos infectados com baixa parasitemia, demonstrou-se que a PCR é mais vantajosa em relação à microscopia.²⁶ Estes trabalhos sobre a aplicação da PCR utilizaram a região genômica nuclear amplificando um fragmento de 188 pares de base internas à região repetitiva de 195 pares de base. A sensibilidade dos testes aplicados é aumentada pela hibridização com sondas específicas marcadas com isótopo radioativo e não radioativo.
Durante a padronização da primeira PCR para a região do DNA nuclear, houve amplificação de produtos inespecíficos, mas com a utilização dos primeiros ciclos diferenciados na primeira reação, o problema foi solucionado. No entanto, estas bandas inespecíficas já foram descritas²⁶ quando se utiliza os primers TCZ1 e TCZ2 em ratos infectados, onde observa-se, bandas de 383 e 578 pares de base, as quais são produtos específicos da amplificação pela PCR de dois ou três segmentos repetidos de 195 pares de base, que são arranjados em seqüência.
No presente trabalho, padronizamos a PCR dupla (nested – PCR) em amostras de sangue periférico de pacientes com sorologia duvidosa. A vantagem da PCR dupla é a não utilização de sondas radioativas e a simplicidade do método⁴ sendo que a sensibilidade e especificidade obtida em nosso trabalho se equiparam a testes similares que utilizam a hibridização na região do k DNA.^27,28
O seqüenciamento automatizado realizado em alguns pacientes envolvidos neste trabalho confirma que o produto da PCR dupla de 149 pares de base observado em gel de agarose corado é realmente uma seqüência do T. cruzi, descrita anteriormente,⁷ indicando a especificidade da PCR.
Portanto, a PCR e a PCR dupla como ferramentas moleculares na detecção do DNA do T. cruzi, são de grande importância aos pacientes, podendo ser considerado um padrão-ouro, principalmente nos casos não esclarecidos (sorologia duvidosa).²⁹ A PCR dupla apresenta alta sensibilidade, pois não encontramos nenhum resultado falso-positivo quando comparado a outros testes realizados, como o xenodiagnóstico, que é altamente específico.³ Além disso, é um teste altamente específico, pois detecta o DNA do parasita, que por princípio da escolha dos oligonucleotídeos, não amplifica DNA de outro parasita ou mesmo do ser humano, ou seja, não há reação cruzada como pode acontecer com as sorologias convencionais, onde o teste reconhece anticorpos de outras espécies de parasitas, como a Leishmania spp., que ocorre concomitantemente nas regiões endêmicas da doença de Chagas. Os testes sorológicos são necessários, pois além de serem realizados em larga escala, apresentam preços mais acessíveis, com obtenção rápida dos resultados, sendo importantes na triagem sorológica. Além disso, a PCR dupla tem grande valor na investigação no monitoramento de pacientes em tratamento específico e imunossuprimidos, pois o xenodiagnóstico e hemocultura demandam tempo e laboratórios muitas vezes externos. Também, a PCR tem demonstrado ser imprescindível em estudos atuais sobre a epidemiologia da doença de Chagas, principalmente na genotipagem e tropismo das cepas em modelos animais e humanos.³⁰
Los autores no manifiestan conflictos.

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