ANALYSIS OF ENGRAFMENT USING ABO BLOOD GROUP GENOTYPING IN ABO-INCOMPATIBLE HEOMPOIETIC STEM CELL TRANSPLANTATION

Abstract
Background: The analysis of chimerism after hemopoietic stem cell transplantation (HST) is very important to evaluate sustained engraftment of donor cells. Although several methods have been developed, most of these methods identify differentiated cells such as mononuclear cells (MNCs), granulocytes and lymphocytes derived from donor cells. Since cDNAs for A transferase and B transferase were recently cloned, using PCR and clonal cell culture techniques, ABO blood group (ABO) genotypes of erythroid burst-forming units (BFU-E) can be analyzed after ABO-incompatible HST. Materials, methods and results: DNA was serially extracted from erythroid colonies and peripheral blood MNCs in 12 patients who received an ABO-incompatible hemopoietic stem cell transplant. DNA samples were amplified by PCR using specific primers for the A, B and O alleles. Flow cytometric identification of red blood cells (RBCs) was conducted using monoclonal antibodies specific for ABO antigens. Complete conversion to the donor’s ABO genotype was found on day +21 in 10 patients treated with myeloablative regimens. In contrast, recipient’s RBCs were detected until day +85. Autologous hemopoietic recovery was early detected by ABO genotypic analysis of BFU-E in one patient after HST. Another patient treated with a non-myeloablative regimen showed a transient mixed ABO genotypic chimerism of BFU-E and peripheral blood MNCs, followed by complete donor ABO genotypic chimerism in both cells. Conclusion: ABO genotypic analysis is useful for evaluating engraftment of donor cells after ABO-incompatible HST, although identifying complete donor chimerism, complete differences in ABO genes between the donor and recipient are necessary.

Key words
Hemopoietic stem cell transplantation, engraftment, chimerism, ABO blood group gene, BFU-E

Artículo completo
Introducción
Al clonarse el ADNc de la transferasa A (α1→3GalNAc transferasa) y de la transferasa B (α1→3Gal transferasa) se demostró que el ADNc del alelo O es idéntico al del alelo A, excepto por la supresión de un único nucleótido.^1,2 Este estudio evaluó la implantación de las células del donante, mediante el análisis del genotipo ABO.
Materiales y métodos
Doce pacientes recibieron trasplante de células madre hematopoyéticas de donantes ABO-incompatibles (tabla 1). Las muestras de ADN fueron amplificadas mediante el uso de reacción en cadena de la polimerasa (PCR); se utilizaron los iniciadores específicos GA23, GA13, GA14 y GA24.³ Los iniciadores GA23 y GA13 fueron diseñados para detectar sustituciones en el alelo B; los iniciadores GA23 y GA14, en el alelo A, y los iniciadores GA24 y GA14 se diseñaron para detectar la supresión de una única base en el alelo O. Posteriormente, los glóbulos rojos fueron analizadas mediante citometría de flujo.³ Se seleccionaron colonias eritrocitarias derivadas de las CMN de sangre periférica que fueron agrupadas y utilizadas para el análisis de los genotipos ABO.⁴



Resultados y discusión
Las figuras 1 y 2 muestran cambios en los genotipos ABO y en los fenotipos ABO antes y después del TMH. Se analizaron los genotipos ABO de las UFC-E en los receptores (R) 1 al R6 y aquellos de las CMN en sangre periférica en los R7 al R12. Los análisis del genotipo ABO comenzaron al día siguiente en el cual el recuento leucocitario superó 110⁹/l y fueron realizados con intervalos aproximados de 14 a 28 días. Luego del TMH a pacientes mielosuprimidos, el tiempo transcurrido hasta la detección más precoz de un quimerismo completo del genotipo donante ABO fue de 23 días en promedio. En el R5 se demostró la recuperación celular de la propia serie hematopoyética luego del TMH.⁵ Resultados similares se obtuvieron mediante el análisis del genotipo ABO en las CMN de sangre periférica. El R6, a quien no se le había realizado mieloablación, mostró una condición similar a la aplasia pura glóbulos rojos, asociada con el TMH tipo ABO-incompatible principal.^6,7 En ese momento, las UFC-E en médula ósea, así como las CMN de sangre periférica, exhibieron quimerismo mixto del genotipo ABO, seguido por quiemerismo completo del genotipo ABO donante (figura 3).








El análisis del genotipo ABO es útil para la evaluación de la implantación de las células del donante luego de un TMH ABO-incompatible. Demostramos que el análisis del genotipo ABO es superior al análisis del fenotipo ABO en caso de incompatibilidad de los genes ABO entre el donante y el receptor.Los autores no manifiestan conflictos.

Bibliografía del artículo

1. David B, Bernard D, Navenot JM et al. Flow cytometric monitoring of red blood cell chimerism after bone marrow transplantation. Transfus Med 1999; 9: 209-217.
2. Palka G, Calabrese G, Di Girolamo G et al. Cytogenetic survey of 31 patients treated with bone marrow transplantation for acute nonlymphocytic and acute lymphoblastic leukemias. Cancer Genet Cytogenet 1991; 51: 223-233.
3. Kogler G, Wolf HH, Heyll A et al. Detection of mixed chimerism and leukemic relapse after allogeneic bone marrow transplantation in subpopulations of leucocytes by fluorescent in situ hybridization in combination with the simultaneous immunophenotypic analysis of interphase cells. Bone Marrow Transplant 1995; 15:41-48.
4. Leclair B, Fregeau CJ, Aye MT et al. DNA typing for bone marrow engraftment follow-up after allogeneic transplant: a comparative study of current technologies. Bone Marrow Transplant 1995; 16: 43-55.
5. Wang LJ, Chou P, Gonzalez-Ryan L, et al.: Evaluation of mixed hematopoietic chimerism in pediatric patients with leukemia after allogeneic stem cell transplantation by quantitative PCR analysis of variable number of tandem repeat and testis determination gene. Bone Marrow Transplant 2002; 29: 51-56.
6. Lee JH, Lee JH, Choi SJ, et al.: Changes of isoagglutinin titres after ABO-incompatible allogeneic stem cell transplantation. Br J Haematol 2003; 120: 702-710.
7. Watkins WM.: Biochemistry and Genetics of the ABO, Lewis, and P blood group systems. Adv Hum Genet 1980; 10:1-136, 379-385.
8. Hakomori S.: Philip Levine award lecture: blood group glycolipid antigens and their modifications as human cancer antigens. Am J Clin Pathol 1984; 82: 635-648.
9. Yamamoto F.: Molecular genetics of the ABO histo-blood group system. Vox Sang 1995; 69:1-7.
10. Yamamoto F.: Molecular genetics of ABO. Vox Sang 2000; 78 Suppl 2: 91-103.
11. Kishino K, Muroi K, Kawano C, et al.: Evaluation of engraftment by ABO genotypic analysis of erythroid burst-forming units after bone marrow transplantation. Leuk Res 2002; 26: 13-17.
12. Procter J, Crawford J, Bunce M, et al.: A rapid molecular method (polymerase chain reaction with sequence-specific primers) to genotype for ABO blood group and secretor status and its potential for organ transplants. Tissue Antigens 1997; 50: 475-483.
13. Suzuki T, Muroi K, Tomizuka H, et al.: Characterization of enriched CD34+ cells from healthy volunteers and those from patients treated with chemotherapy plus granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF). Stem Cells 1995; 13: 273-280.
14. Muroi K, Kawano C, Yokote T, et al.: Early myelodysplastic syndrome after allogeneic bone marrow transplantation for acute myeloid leukemia. Leuk Lymphoma. 2002; 43: 1493-1496.
15. Blanchard D, Bruneau V, Bernard D, et al.: Flow cytometry analysis of dual red blood cell populations after bone marrow transplantation. Br J Haematol 1995;89: 741-747.
16. Hasegawa W, Lipton JH, Messner HA, et al.: Influence of one human leukocyte antigen mismatch on outcome of allogeneic bone marrow transplantation from related donors. Hematology 2003; 8: 27-33.
17. Anagnostopoulos A, Giralt S.: Critical review on non-myeloablative stem cell transplantation (NST). Crit Rev Oncol Hematol. 2002; 44:175-190.
18. Benjamin RJ, Connors JM, McGurk S, et al.: Prolonged erythroid aplasia after major ABO-mismatched transplantation for chronic myelogenous leukemia. Biol Blood Marrow Transplant 1998; 4: 151-156.
19. Lee JH, Lee KH, Kim S, et al.: Anti-A isoagglutinin as a risk factor for the development of pure red cell aplasia after major ABO-incompatible allogeneic bone marrow transplantation. Bone Marrow Transplant 2000; 25: 179-184.
20. Maciej Zaucha J, Mielcarek M, Takatu A, et al.: Engraftment of early erythroid progenitors is not delayed after non-myeloablative major ABO-incompatible haematopoietic stem cell transplantation. Br J Haematol 2002; 119: 740-750.
21. Seltsam A, Hallensleben M, Kollmann A, et al.: Systematic analysis of the ABO gene diversity within exons 6 and 7 by PCR screening reveals new ABO alleles. Transfusion 2003; 43: 428-439.
22. Yip SP.: Sequence variation at the human ABO locus. Ann Hum Genet 2002; 66(Pt 1): 1-27.
23. Watts MJ, Somervaille TC, Ings SJ, et al.: Variable product purity and functional capacity after CD34 selection: a direct comparison of the CliniMACS (v2.1) and Isolex 300i (v2.5) clinical scale devices. Br J Haematol 2002; 118: 117-123.