Abstract
The spondyloarthropathies (SpA) are a group of diseases associated with the B27 histocompatibility antigen. Ninety percent of the ankylosing spondylitis patients are B27 positive, however, only 3-5% of the B27 positive individuals develope the disease, suggesting that other genetic markers are associated with the susceptibility to SpA. In order to detect other genetic markers associated with SpA, we studied several polymorphisms in a group of Mexican patients with diagnosis of SpA (ankylosing spondylitis, reactive arthritis and undifferentiated spondyloarthropathies). Questionnaires of activity and functionality (BASDAI and BASFI) were applied to the patients. Our results corroborate the strong association of SpA with HLA-B27, but we also detected other associated markers (HLA-B15 and HLA-DR1). We observed that the HLA markers have effect on the age at onset and in the severity of the disease. B27 positive patients had a lower age at onset than B27 negative individuals and the disease was also more severe. In addition, the HLA-DR1 positive patients had an age at onset higher than DR1 negative patients. Other genes such as the heat shock protein (HSP) and large molecular weight proteosome (LMP) only showed association with the undifferentiated forms of the disease.

Key words
Spondyloarthropathies, HLA-B27, genetic susceptibility, polymorphism

Artículo completo
Introducción
Las espondiloartropatías seronegativas (SpA, por sus siglas en inglés) son un grupo de enfermedades inflamatorias multisistémicas que afectan la columna vertebral, las articulaciones periféricas así como estructuras periarticulares. Además, se asocian a una serie de manifestaciones extraarticulares que incluyen inflamación aguda o crónica de los aparatos genitourinario o gastrointestinal –en algunas ocasiones en relación con infección bacteriana– inflamación ocular anterior, lesiones psoriatiformes en piel y uñas.^1-3 Dentro de este grupo se incluyen ciertas entidades bien diferenciadas como la espondilitis anquilosante (EA), la artritis reactiva (ReA), la espondilitis o artritis relacionada con psoriasis o enfermedad inflamatoria intestinal y las espondiloartropatías juveniles; por otro lado, un grupo de enfermedades no bien descritas, no clasificadas conocidas como espondiloartropatías indiferenciadas (U-SpA).^1-3
A pesar de que la etiología de estos padecimientos es desconocida, se sugiere que la enfermedad se desarrolla en individuos genéticamente susceptibles después del contacto con algún factor ambiental. Dada la importante participación del sistema inmune en la fisiopatogenia de las SpA, la región genética más estudiada a la fecha en este grupo de padecimientos es aquella que conforma el complejo mayor de histocompatibilidad (CMH). El grupo de las SpA está constituido por entidades asociadas en forma significativa al antígeno de histocompatibilidad HLA-B27 y de forma variable, dependiendo de la forma clínica y grupo étnico estudiado, a otros antígenos del CMH.^4-6 El HLA-B27 forma parte de los genes del CMH, localizado en el brazo corto del cromosoma 6 humano.⁷
Se sabe que cerca de 90% de los pacientes con EA y 60% de los pacientes con ReA o U-SpA presentan el antígeno HLA-B27 comparado con 3% a 8% de la población sana.^4,5,8,9 A pesar de la fuerte asociación de estas enfermedades con el HLA-B27, la presencia de este antígeno no lleva necesariamente a desarrollar la enfermedad. Unicamente 3% a 5% de los individuos B27 positivos finalmente desarrollan la enfermedad y, por otro lado, existe un pequeño número de pacientes que no presentan el HLA-B27.^10,11 Estos datos indican claramente que el HLA-B27 es necesario pero no suficiente para que un individuo desarrolle estas enfermedades. Al considerar estos antecedentes, el objetivo de nuestro trabajo es detectar si hay otros marcadores además del B27 que pudieran estar confiriendo la susceptibilidad genética a las SpA en la población mexicana. Nuestros estudios incluyeron genes HLA y a genes no HLA localizados en la misma región del CMH. De los genes no HLA hemos estudiado aquellos que codifican para las proteínas de choque térmico (HSP) y los que codifican para proteínas del proteosoma (LMP).
Materiales y métodos
Pacientes
El estudio se realizó en pacientes con diagnóstico de espondiloartropatía (SpA) (12) asistentes a clínicas especializadas en dos instituciones (Departamento de Reumatología del Instituto Nacional de la Nutrición Salvador Zubirán y Departamento de Reumatología del Hospital General de México), así como en un grupo control de individuos sanos no relacionados. Las categorías diagnósticas establecidas en el grupo con SpA fueron espondilitis anquilosante (EA),¹³ SpA indiferenciada (U-SpA) y artritis reactiva (ReA).¹⁴ Para ser considerado sano, el grupo de controles debió estar libre de síntomas y sin antecedentes de cualquier enfermedad, especialmente de tipo autoinmune. Como requerimiento adicional para ambos grupos se consideró que el individuo estudiado y dos generaciones previas a él fueran nacidas en México. La evaluación clínica del grupo con SpA incluyó variables demográficas, datos clínicos y radiográficos de la enfermedad y la aplicación de índices de actividad y capacidad funcional (BASDAI, BASFI, I. Dougados, Prueba de Schober y expansibilidad del tórax) con el propósito de establecer correlaciones clínicas con los marcadores estudiados.
Determinación de los alelos HLA
La determinación de estos alelos se realizó por medio de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando una serie de mezclas de iniciadores específicos de alelo. Dicho sistema utiliza un total de 96 mezclas distintas que permite la detección de todos los alelos hasta hoy conocidos del sistema HLA (21 mezclas para HLA-A, 45 mezclas para HLA-B, 30 mezclas para HLA-DR y DQ) (Pel Freez, Clinical Systems, Brown Deer, Wisconsin, EE.UU.). Después de realizar la amplificación del gen mediante la técnica de PCR, el producto amplificado fue visualizado en un gel de agarosa al 2% teñido con bromuro de etidio. La interpretación de los resultados se llevó a cabo utilizando un programa de computación diseñado para tal propósito (Pel Freez, Clinical Systems, Brown Deer, Wisconsin, EE.UU.).
Determinación del polimorfismo de HSP70
El polimorfismo del gen HSP70 (70-HOM, 70-1 y 70-2), se detectó mediante análisis por fragmentos de restricción polimórficos (RFLP) utilizando los iniciadores que amplifican los fragmentos que contienen los sitios polimórficos previamente reportados.¹⁵ Después de realizar la PCR, el DNA amplificado fue digerido con las enzimas de restricción correspondientes, NcoI para 70-HOM, BsrBI para 70-1 y Pst I para 70-2.¹⁶ Después, los fragmentos se separaron por electroforesis en gel de agarosa al 1.5% y las bandas correspondientes se visualizaron en un transiluminador de luz ultravioleta. En cada caso se obtuvieron dos alelos, uno que presenta el sitio de corte (alelo A) y otro que carece de dicho sitio (alelo B).
Determinación del polimorfismo de los genes LMP
El polimorfismo de estos genes se detectó por RFLP utilizando un grupo de iniciadores previamente reportados.¹⁷ Luego de la amplificación, los fragmentos fueron digeridos con las enzimas respectivas, CfoI para el LMP2 y BsmI para el LMP7.
Análisis estadístico
Las frecuencias de las variantes polimórficas de los genes HLA-A, HLA-B, HLA-DR, HLA-DQ, HSP70 y LMP en los pacientes se compararon con las de los controles utilizando pruebas estadísticas no paramétricas como la de χ² y la exacta de Fisher. El valor de p fue corregido por el método de Bonferroni multiplicando por el número de comparaciones realizadas en cada caso. La fuerza de las asociaciones fue calculada como razón de momios (RM). Para calcular el significado estadístico de las diferencias en las variables continuas (edad de inicio, tiempo de evolución e índices de actividad) entre diferentes grupos de alelos HLA, se utilizó la prueba t de Student.
Resultados y discusión
Los resultados obtenidos en los diferentes marcadores estudiados son sumados en la tabla 1. Los resultados del estudio de los genes HLA mostraron incremento en las frecuencias de los alelos HLA-B27, HLA-B15 y HLA-DR1 en el grupo total de pacientes con SpA. Cuando se consideraron los subgrupos clínicos, se observó aumento en la frecuencia del DR1 y B15 en el grupo de pacientes con las formas indiferenciadas. Con el fin de establecer si estas asociaciones eran independientes de la presencia del HLA-B27, decidimos analizar sólo aquellos individuos negativos para este alelo. En este grupo de pacientes se observó incremento en la frecuencia del B15 en el grupo total de SpA, así como incremento del B15 y del DR1 en el subgrupo de las formas indiferenciadas. La correlación con las variables clínicas demostró que los pacientes B27 positivos tienen una edad de inicio menor de la enfermedad que los B27 negativos. Por otro lado, los pacientes DR1 positivos inician la enfermedad a edades más tardías que los individuos DR1 positivos. Los índices de actividad y de funcionalidad medidos en nuestros pacientes fueron mayores en aquellos individuos B27 positivos al comparar con los B27 negativos. Contrariamente, ni el B15 ni el DR1 tuvieron influencia en estos índices.¹⁸
Tabla 1Los resultados de nuestros estudios sugieren que además de la fuerte asociación entre el HLA-B27 y cada una de las tres formas clínicas de las SpA, este grupo de enfermedades se asocia con otros genes localizados en la región del MHC. De esta forma nosotros encontramos asociación con el B15 y el DR1 en algunos subgrupos clínicos. El DR1 es un marcador que previamente había sido asociado con EA en pacientes ingleses.¹⁹ Por el contrario, no detectamos asociación entre las SpA y el HLA-DR8, B60 y B39 reportados previamente.^20,21 Las diferencias entre los resultados pueden deberse al número de pacientes estudiados, a la forma en que fueron seleccionados, así como a las técnicas de tipificación utilizadas. En nuestro caso se incluyó un conjunto de pacientes vistos por un único grupo de reumatólogos, además el uso de técnicas de biología molecular para la determinación del HLA minimiza de forma importante la presencia de falsos positivos y negativos. Un dato importante es haber establecido que la edad de inicio de los pacientes que son B27 positivos es menor que la de pacientes B27 negativos. Este hecho fue diferente al analizar la presencia del DR1, ya que en este caso los pacientes DR1 positivos iniciaron la enfermedad a edades más tardías que los DR1 negativos.
En cuanto a los genes de las proteínas de choque térmico nuestros estudios ya citados mostraron asociación de las SpA (EA, U-SpA y ReA) con el genotipo HSP-70-2 BB. Esta asociación permaneció significativa cuando analizamos solo los individuos B27 negativos, lo que sugiere un papel independiente del B27 de este genotipo en la susceptibilidad a la enfermedad. Por otro lado, el análisis del locus HSP70-hom mostró asociación con el alelo A y con el genotipo AA en el grupo total de pacientes así como en los subgrupos con EA y con las formas indiferenciadas. En este caso las diferencias se mantuvieron al analizar únicamente a los individuos B27 negativos sólo en el grupo total de pacientes y en el subgrupo de las formas indiferenciadas. Estos datos sugieren un papel directo de estos alelos en la susceptibilidad a las SpA, en especial a las formas indiferenciadas. Estudios previos mostraron asociación entre el genotipo HSP70-2 B/B y algunas enfermedades autoinmunes,^22,23 sin embargo, el mecanismo que actúa en esta asociación permanece desconocido. Se ha informado que los individuos homocigotas para el alelo HSP70-2B producen menor cantidad de la proteína que aquellos individuos AB o AA.²⁴ Si éste es el caso se esperaría que la respuesta celular de los individuos B/B ante el estrés pudiera estar alterada y llevaría a una acumulación de proteínas desnaturalizadas o a defectos en el transporte de péptidos afectando directamente la tolerancia a lo propio.
Finalmente los datos preliminares del estudio de los genes LMP mostraron incremento del genotipo LMP2 R/R en el grupo total de pacientes con SpA, así como en los subgrupos con U-SpA y EA. Cuando se analizaron a los individuos B27 negativos únicamente permaneció incrementado el genotipo LMP2 R/R en el subgrupo de pacientes con EA. En este caso los pacientes que portaron el genotipo LMP2 R/R iniciaron la enfermedad a edades más tempranas que aquellos que portaron los otros genotipos (H/R y H/H). Las frecuencias de los alelos del gen LMP7 fueron similares en los diferentes grupos de estudio. Los datos en este gen sugieren que el gen LMP2 está involucrado en la susceptibilidad al desarrollo de la EA en los mexicanos, además de que la edad de inicio de este padecimiento puede estar afectada por genotipos de este gen.
En conclusión, nuestros estudios establecen que además del HLA-B27 existen otros genes que pueden participar en la susceptibilidad genética al desarrollo de las espondiloartropatías. Estos genes podrían también condicionar las manifestaciones clínicas de estos padecimientos.
El autor no manifiesta conflictos.

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