RENIN EXPRESSION AS MINIMAL RESIDUAL DISEASE MARKER IN ACUTE LEUKEMIAS

Abstract
Some leukemias have at diagnosis a molecular change useful as minimal residual disease (MRD) marker. The aim of this paper is to study the incidence and value of renin gen expression as MRD molecular marker in acute mieloid leukemia (AML) patients without other molecular marker. We analized 78 samples of AML and the follow-up of positive patients, using PCR and real time-PCR. 31 of 78 patients were positive (39.74%). We observed negativization in all positive cases with the complete remission, recurrence in the relapse and persistence if the disease is refractive to the treatment. In patients with other cytogenetic or molecular marker we observed a similar behaviour in both of them along with the disease evolution. We think that renin gene analysis by PCR is a useful marker of MRD in patients that lack others. The real time-PCR methodology that we describe has more sensitivity than PCR.

Key words
Renin, leukemia, minimal residual disease, molecular marker, real time-PCR

Artículo completo
Introducción
El uso de métodos diagnósticos con mayor sensibilidad que la morfología nos permite la detección de enfermedad mínima residual (EMR) y el tratamiento precoz de las recaídas.^1-5 Determinadas neoplasias hematológicas se caracterizan por una alteración molecular que constituye un marcador para el diagnóstico y monitorización de la EMR por PCR.^8-12 En aquellos casos de leucemia aguda sin un marcador genético específico debe considerarse la búsqueda de otros marcadores¹³ como la expresión del gen del tumor de Wilms (WT1),^14-16 del gen del retinoblastoma^17,18 o la sobreexpresión del FLT3.¹⁹
Las evidencias de la existencia de los componentes del sistema renina angiotensina en la médula ósea,^20-22 con efectos sobre la hematopoyesis,^23-30 junto con la demostración de la existencia de renina y expresión de dicho gen en blastos de determinadas leucemias^31,32 nos llevó a analizar la expresión del gen de la renina en médulas óseas procedentes de nuestros pacientes afectados por leucemia mieloblástica aguda (LMA) con el objetivo de analizar la incidencia y estudiar el valor de dicha expresión como marcador molecular de EMR en aquellos pacientes positivos al diagnóstico que carezcan de otros marcadores moleculares. En este artículo se amplía la serie de pacientes publicada previamente por nuestro grupo³³ y se introduce como metodología de trabajo la PCR en tiempo real.^34,35
Pacientes y método
Se determinó la incidencia de la expresión del gen de la renina en 9 muestras de sujetos sanos y en 78 pacientes afectados por LMA no promielocítica (tabla 1). El análisis se realizó en muestras pertenecientes a diagnóstico, remisión completa y recaída, pudo realizarse el seguimiento de 19 pacientes positivos para renina. Las muestras no valorables, por mala calidad del ARN existente, no fueron incluidas en el estudio.



Los pacientes fueron clasificados inicialmente según la clasificación de la FAB³⁶ y posteriormente se utilizó únicamente la propuesta por la WHO³⁷ o se combinaron ambas, tal y como se recomienda. Asimismo, se utilizó la clasificación inmunológica en los casos dificilmente asignables con la clasificación morfológica o a los que no se les practicó aspirado medular.³⁸
Las células mononucleadas fueron obtenidas de las muestras de medula ósea o de sangre periférica anticoaguladas con EDTA y se aislaron mediante centrifugación en un gradiente de Ficoll-Hypaque. El ARN total fue extraído mediante el método del tiocianato de guanidino-fenol ácido.³⁹ Se aseguró la integridad del ARN mediante electroforesis en un gel de agarosa al 1% teñido con bromuro de etidio. La concentración del ARN se determinó mediante espectrofotometría y los ARN se almacenaron en un congelador a –80ºC.
El ADNc de las secuencias de ARN fue obtenido a partir de 1 μg de ARN usando la transcriptasa inversa AMV (Boehringer Manheim) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La desnaturalización y la síntesis de ADNc se realizó en un termociclador a 95º C durante 10 minutos seguidos de 42º C durante 60 minutos, respectivamente. La determinación del gen de la renina se realizó inicialmente por RT-PCR⁴⁰ y electroforesis en gel de agarosa y, posteriormente, por PCR en tiempo real con SYBR Green I.
Para la amplifcación del gen de la renina por PCR en tiempo real se utilizó el Light Cycler Instrument. Se usaron dos cebadores específicos (REN F y REN R) a una concentración 0.5 μM y el colorante fluorescente SYBRGreen I (Fast Start DNA Master SYBR Green I). Para la determinación del gen control β-glucuronidasa (GUS) se utilizó el cebador directo ENF y el inverso ENF 1102 (tabla 2). Las condiciones para la amplificación de las muestras se definen en la tabla 2, mientras que las de análisis de la curva de fusión se establecieron según las indicaciones del instrumento. La fluorescencia fue medida en el canal F1 (530 nm).



Resultados
Se encontró positividad en 31 de los 78 pacientes analizados (39.74%) (tabla 1). Las características de los pacientes positivos para renina se resumen en la tabla 3.



En todos los pacientes renina positivos al diagnóstico se observó la negativización de dicha expresión con la remisión completa. Asimimo, se observó la reaparición de dicha positividad en la recaída y la persistencia de dicha expresión cuando existía enfermedad refractaria al tratamiento, siempre y cuando la celularidad medular fuera adecuada (tabla 4 y figura 1). La PCR en tiempo real presentó mayor sensibilidad que la RT-PCR, mostrando positividad en algunos casos negativos por RT-PCR. En los pacientes que presentaban otro marcador citogenético o molecular se observó un comportamiento similar en ambos durante el curso clínico de la enfermedad.
Tabla 4

Figura 1. Imagen de la determinación (curva de fusión) de la expresión del gen de la renina por PCR en tiempo real del seguimiento de un paciente positivo al diagnóstico. Al diagnóstico (en verde) se observa un pico con la misma temperatura de fusión que el control positivo (en azul). Las muestras pertenecientes a la remisión completa (rojo y negro) son negativas. En la recaída (en rosa) reaparece la positividad.

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