ANTI-COMPLEMENT EFFECT OF BILIRUBIN

Abstract
We evaluated the in vitro and in vivo effect of bilirubin (BR) on complement (C) activation by the classical pathway. BR inhibited the hemolytic activity of C in vitro, mainly at the C1 step level, in a dose-dependent way. This effect was a consequence of a dose-dependent inhibition of the interaction between C1q and immunoglobulins such as IgM and IgG. The inhibitory effect of BR was also analyzed in vivo by determining the C-mediated intravascular hemolysis induced by transfusion of sheep red cells into rats carrying naturally occurring heteroantibodies capable of C-fixation. BR reduced the intravascular hemolysis in a dose-dependent way, consistent with the effects reported in vitro. The interaction between BR and C1q was further studied by analyzing the differential spectrum of absorption of the pigment in the presence of increasing concentration of C1q. The results indicated a specific, high affinity binding of BR to C1q. We postulate that BR interferes the initial step of C classical pathway activation by interfering the normal binding of C1q to immunoglobulins.

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Antecedentes

El sistema del complemento (C) es una de las vías principales por las que el reconocimiento del antígeno se convierte en una defensa efectiva contra la infección, lo que es particularmente importante en la protección contra bacterias extracelulares.¹ Este sistema está formado por un gran número de diferentes proteínas plasmáticas, la mayoría de las cuales circulan como cimógenos que se activan en forma secuencial a través de una cascada de reacciones enzimáticas. Una de las vías más comunes de activación del C es la vía clásica, la cual se inicia por la unión de complejos antígeno-anticuerpo al componente C1 del C. Tanto la participación exagerada como disminuida del sistema del C puede llevar a enfermedad. Comprender el mecanismo de modulación de la actividad de este sistema podría contribuir a contrarrestar alteraciones patológicas de su función. En los últimos años nos hemos dedicado a estudiar el efecto modulador in vitro de la bilirrubina sobre la activación del C, particularmente por la vía clásica, y sus consecuencias in vivo en animales de experimentación.

En los vertebrados, el grupo hemo de la hemoglobina se degrada primariamente a los pigmentos biliares biliverdina (BV) y bilirrubina (BR), aunque pueden existir vías alternativas de degradación y también puede ser excretado en bilis sin cambios.² La BV representa un intermediario importante en la síntesis de BR, su conversión en BR es mediada por un proceso de reducción, muy eficiente en mamíferos. Como resultado, la mayor parte de los pigmentos biliares excretados en bilis están representados por BR, particularmente en forma de conjugados con ácido glucurónico. Es interesante destacar que la BR en la bilis se reconvierte rápidamente a BV por oxidación espontánea, si la BV es derivada fuera del organismo.

Estudios recientes indican que la BV es capaz de inhibir la activación del C por la vía clásica.³ Esto puede explicar la utilidad del uso de la bilis de buey, rica en BV, como medicamento antialérgico por parte la medicina tradicional china. Sin embargo, el hecho de que BV se convierta rápidamente en BR una vez incorporada exógenamente a los mamíferos,⁴ sugiere que su efecto anticomplementario podría estar mediado esencialmente por la BR. De ser así, surge entonces un interrogante: ¿podría el sistema del C estar alterado en humanos en situaciones de ictericia

Para evaluar esta posibilidad, en una primera etapa realizamos estudios in vitro comparando la acción inhibitoria de la BR y la BV sobre la activación del C de origen humano por la vía clásica. Los resultados, publicados en 1999,⁵ indicaron que el efecto inhibitorio de la BR (a) fue mayor que el de la BV, (b) se localizó sobre el componente C1 de la cascada del C, (c) involucró la etapa de unión entre el anticuerpo (tanto IgM como IgG) y el subcomponente C1q del C1 y, (d) fue mayor para la BR no conjugada que para su derivado conjugado con ácido glucurónico. Todos estos efectos fueron dependientes de la dosis y se manifestaron a concentraciones de BR superiores a las fisiológicas, específicamente por encima de 34 µM (2 mg/dl). Estos resultados confirmaron nuestra hipótesis sobre el efecto inhibitorio de la BR sobre el sistema del C. Claramente, el efecto podría tener alguna implicancia en el organismo intacto, aunque fundamentalmente en situaciones de ictericia con aumento de BR no conjugada.

En una segunda etapa, y para verificar que la BR no conjugada era capaz de inhibir la activación del C in vivo, desarrollamos un protocolo experimental en la rata. Dicho protocolo permitió evaluar la activación intravascular del C por la vía clásica, a través de la detección de la hemoglobina liberada por lisis de eritrocitos de carnero transfundidos a ratas Wistar portadoras de anticuerpos heterófilos. Los resultados, publicados en 2002,6 mostraron que la BR no conjugada fue capaz de atenuar la activación del C, su efecto fue dependiente de la dosis y, como era de esperar, sólo visible en concentraciones superiores a las fisiológicas.

En función de los primeros estudios que mostraron que la BR interfiere la unión de IgM o IgG a C1q, surgió el interés de probar si el pigmento podría unirse directamente a C1q, en el sitio (o próximo al sitio) de unión de las inmunoglobulinas, compitiendo así con IgM o IgG por la unión a C1q. En la etapa más reciente de nuestro estudio analizamos la interacción de la BR con C1q mediante la técnica de espectrofotometría diferencial. Los resultados se presentan a continuación en forma sintética.Interacción de BR con C1q

La BR es un pigmento amarillo que presenta un espectro de absorción específico con un pico máximo a aproximadamente 450 nm. Desde hace años se sabe que al interaccionar con ciertas proteínas, el pico del espectro de la BR puede cambiar de posición. Este cambio, específicamente estudiado para la interacción con albúmina sérica, se debe a una transformación estructural en la molécula del pigmento que conlleva a cambios en sus propiedades fisicoquímicas, incluido el espectro de absorción. Técnicamente, el procedimiento consiste en evaluar el espectro de absorción del pigmento, antes y después de agregar la proteína de unión en concentraciones crecientes. El resultado se visualiza como la resta de los espectros con proteína y sin proteína, tal como se muestra en la figura 1 para la albúmina sérica humana (ASH). Así, el corrimiento del pico de absorción de la BR en presencia de ASH hacia la derecha (Fig. 1A) se traduce, al realizar el espectro diferencial, en una curva de valores negativos y luego positivos conforme aumenta el valor de longitud de onda (Fig. 1B). Un corrimiento en el espectro de absorción de la BR en presencia de C1q confirmaría nuestra presunción acerca de una interacción específica entre ambos.

Figura 1. Construcción del espectro diferencial de bilirrubina. El panel A muestra el desplazamiento del espectro de absorción de bilirrubina (BR) hacia longitudes de onda mayores en presencia de albúmina sérica humana (ASH). Al restar de este último el primero se obtiene el espectro diferencial (panel B), indicativo de interacción específica entre el ligando (BR) y la proteína (ASH). El mismo se registra como cambios de densidad óptica en función de los cambios de longitud de onda.

El análisis del espectro de absorción de la BR en presencia de C1q se realizó a 25°C en un espectrofotómetro Perkin Elmer Lambda 2 S, doble haz. La BR se disolvió en un volumen mínimo de NaOH 0.1 N y se diluyó en solución de Mayer conteniendo concentraciones apropiadas de Ca²⁺ y Mg2+. Para las mediciones de absorbancia diferencial, el mismo volumen de la solución de BR fue pipeteado en dos cubetas diferentes. Luego se agregaron volúmenes crecientes de una solución de C1q de origen comercial (Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo, EE.UU.) o de solución de buffer Tris 0.150 M, NaCl 1.5 M; pH 7.3 (solvente de C1q), en la cubeta para muestra y en la de referencia, respectivamente. Como controles positivos y negativos se analizaron los espectros de absorción diferenciales de la BR en presencia de ASH o IgG humana respectivamente, ya que en experimentos preliminares observamos que la IgG no interacciona con la BR.

Los resultados se muestran en la Fig. 2. Se observa que C1q es capaz de unirse a la BR, al modificar su espectro de absorción y confirmar una interacción específica, no presente para el control negativo IgG. Se desprende de los mismos resultados que las concentraciones de C1q (margen derecho de la figura) necesarias para producir el desplazamiento del espectro fueron menores que las de ASH necesarias para producir un desplazamiento de magnitud similar. Esto sugiere mayor afinidad de la BR por C1q que por ASH. Esta observación podría explicar por qué el pigmento fue capaz de inhibir la activación del C en animales in vivo, aun cuando, como es sabido, las concentraciones fisiológicas de albúmina sérica son muy superiores a las de C1q.

Figura 2. Espectro diferencial de bilirrubina en presencia de C1q. Se muestra el espectro diferencial de bilirrubina (BR) ante el agregado de concentraciones crecientes de C1q (margen derecho) y de los controles positivo (albúmina sérica humana, ASH) y negativo (inmunoglobulina G humana, IgG). El estudio demuestra interacción entre C1q y BR, aunque con un perfil cualitativamente y cuantitativamente diferente del de la interacción ASH-BR. Como era de esperar, IgG no modificó el espectro de absorción de BR, lo que indica ausencia de interacción entre ambas.

Se ha demostrado que la BR se une a grupos amino de lisina presentes en la ASH a través de interacciones electrostáticas del tipo dipolo-dipolo. Se sabe además que C1q es una de las proteínas más básicas del organismo debido a su elevado contenido en arginina e hidroxilisina. Nuestro modelo para explicar los hallazgos observados hasta el presente se muestra en la Fig. 3 y plantea que la BR, en particular en su forma no conjugada y a concentración superior a la fisiológica, se une a C1q en algún sitio de su cabeza globular (crítico para la unión de inmunoglobulinas), muy probablemente a través de uniones dipolo-dipolo, inhibiendo así el inicio de la activación de C1 y, por ende, la activación de la vía clásica del C. La interacción normal entre las cabezas globulares de C1q y la región Fc de las inmunoglobulinas (panel A), en el ejemplo de la Fig. 3, unidas a antígenos de superficie, no puede producirse si se une BR a C1q (panel B).

Figura 3. Probable mecanismo inhibitorio de la bilirrubina sobre la activación del complemento. La activación del complemento por la vía clásica se inicia con la unión de las cabezas globulares de C1q a las regiones Fc de las inmunoglobulinas que forman parte de los complejos antígeno-anticuerpo, en este caso fijados a la superficie de la membrana celular (Panel A). La flecha negra indica el sitio de esa unión. La presencia de bilirrubina (BR) en concentraciones suprafisiológicas bloquea esa posibilidad de unión, al interaccionar con las cabezas globulares de C1q, posiblemente generando un impedimento estérico (panel B).

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