GENETIC PREDISPOSITION TO THYROID CANCER

Abstract
In contrast to the 5-10% of the population presenting detectable nodules, thyroid cancer is responsible for no more than 1.6% of all kinds of cancers. Therefore, screening tools designed to identify individuals at risk for thyroid nodule cancer are of utmost necessity. Some clinical and epidemiologic features, among other factors, have proved to be important in the identification of individuals at risk. More recently, molecular biology methods allowed us to identify genetic polymorphisms that compose the biochemical basis for the susceptibility to cancer. Using a triplex PCR that included ß-globin gene as a DNA quality control to study GSTM1 and GSTT1 and a PCR-SSCP-sequencing approach to study GSTP1 polymorphisms, we compared the genotypes of patients with malignant nodules, including papillary carcinomas (PC) and follicular carcinomas (FC), to benign nodules and to healthy control individuals. Patients with PC and FC showed a significant over-representation of the variants of GSTP1 allele compared to the control population (p<0.0001). Also, we found an increased risk of thyroid cancer in individuals with the GSTT1 and GSTM1 combined null inheritance (p<0.005). We suggest that GST profiling from peripheral blood may be a simple and useful tool in the screening for thyroid nodule malignancy.

Key words
Differentiated Cancer; Molecular Markers; Pre

Artículo completo
Nódulos na tiróide constituem um verdadeiro problema de Saúde Pública tal a sua prevalência, particularmente em mulheres. Estima-se que 5 a 10% da população venha a desenvolver um nódulo palpável durante a vida, de forma que, considerando-se que em áreas previamente carentes de iodo a prevalência de bócio pode atingir mais da metade da população local, é provável que tenhamos no Brasil uma população de cerca de 10 milhões de portadores de nódulos tiroidianos (1). A maior disponibilidade da ultra-sonografia e de outros métodos diagnósticos tem trazido aos serviços de saúde um crescente número de indivíduos aflitos pela possibilidade de portarem um câncer. No entanto, a maior parte dos nódulos deve ser benigna já que o câncer de tiróide é responsável por apenas 0.6% e 1.6% de todos os cânceres de homens e mulheres, respectivamente, nos EUA (2,3). Mais ainda, o carcinoma diferenciado da tiróide. Felizmente, a maior parte dos casos são precocemente diagnosticados e confirmados, graças à citologia facilmente obtida por uma simples punção aspirativa com agulha fina, e a mortalidade pelo câncer diferenciado da tiróide é relativamente baixa (4). Por outro lado, nem todos os casos de carcinomas diferenciados da tiróide têm prognóstico tão bom. Um percentual não desprezível, de 7 a 20% dos pacientes, é tardiamente diagnosticado, evolui mal e acaba contribuindo para as cerca de 1400 mortes anuais por câncer da tiróide previstas para os EUA no ano de 2003 (4,5). A identificação correta dos nódulos que merecem investigação laboratorial mais completa, uma punção do nódulo e/ou cirurgia, é fundamental para o estabelecimento de estratégias que representem a melhor relação de custo-benefício não apenas para o paciente, mas também para o Sistema de Saúde do país, onde a alocação de recursos deve ser muito criteriosa. Uma série de fatores clínicos e epidemiológicos, resumidos, respectivamente, nas Tabelas 1 e 2, vem sendo utilizados na seleção dos pacientes de risco para câncer da tiróide. Nos últimos anos, a biologia molecular vem proporcionando uma maior compreensão da etiopatogenia e dos fatores envolvidos no risco ao câncer, trazendo assim novos métodos de rastreamento. TABELA 1. Fatores epidemiológicos de risco para câncer de tiróide

1. Radiação ionizante terapêutica ou acidental
2. Predisposição familiar
   • carcinoma papilífero familiar: raro, caracterização genética pobre
   • polipose adenomatosa familiar: ­ até 160 x risco mulheres < 35 anos
   • doença de cowden
   • neoplasia endócrina múltipla (nem)
3. Ingesta de iodo
   • déficit de iodo: maior risco de carcinoma folicular, > incidência de bmn
   • suficiência de iodo: predomina o carcinoma papilífero
4. Tiroidopatias pré-existentes
   • adenoma folicular: predispõe ao carcinoma folicular
   • doença de graves
   • tiroidite crônica de hashimoto: linfoma tiroidiano
5. Fatores hormonais e reprodutivos
6. Fatores étnicos e geográficos
7. Dieta e drogas

TABELA 2. Fatores clínicos relacionados a malignidade no nódulo de tiróide

---

1. História
   • irradiação externa
   • história familiar de câncer de tiróide
   • 20 anos < idade> 60 anos
   • sexo masculino
2. Características do nódulo
   • de tamanho, principalmente durante terapia supressiva
   • duro, firme, superfície irregular
3. Outros sintomas
   • rouquidão, disfagia, paralisia de cordas vocais.
   • gânglios cervicais

---

Compreendemos atualmente que a grande maioria dos cânceres do ser humano ocorre por uma interação entre fatores ambientais como fumaça de cigarro, alimentos e bebidas, poluição urbana e industrial, etc e a bagagem genética de cada indivíduo (6). Polimorfismos de genes que codificam enzimas responsáveis pelo metabolismo de carcinógenos, como as do sistema da glutationa s-transferase (GST), estão relacionados com desenvolvimento de vários tipos de câncer. Até o presente momento, pelo menos 5 genes diferentes, mu, alfa, pi, teta e sigma, foram identificados como causadores de alteração na atividade enzimática. Existem várias evidências de que a ausência de uma ou mais de uma forma de GST ou variantes alélicas que expressam diferentes combinações de herança étnica destas enzimas (polimorfismo hereditário) são mais susceptíveis de sofrer stress químico (6, 7). Os genes GST mu 1 (GSTM1) e GST teta 1 (GSTT1) possuem uma variante alélica nula nos quais o gene inteiro está ausente e, portanto, não existe codificação ou produção da respectiva enzima. O gene GST pi 1 (GSTP1) possui um polimorfismo de substituição do aminoácido I105V que resulta na produção de uma enzima variante com menor atividade e capacidade de detoxificação. Com a finalidade de avaliar a importância do perfil genotípico das GSTs na susceptibilidade ao câncer da tiróide, estudamos inicialmente o perfil genotípico de 116 portadores de nódulos tiroidianos, incluindo 49 casos benignos (38 bócios multinodulares e 11 adenomas foliculares) e 67 casos malignos (50 carcinomas papilíferos e 17 foliculares). A população controle foi composta de 300 indivíduos saudáveis da mesma região. Todos os indivíduos e pacientes foram cuidadosamente examinados e interrogados quanto a hábitos alimentares, uso de drogas, cigarros, patologias presentes ou prévias, em especial da tiróide, exposição a radiação ionizante, antecedentes familiares e fatores considerados de risco para câncer em geral e da tiróide em particular. Comparamos o genótipo obtido através de extração de DNA de sangue periférico com o do DNA extraído de 35 casos em que obtivemos o tumor tiroidiano, sempre obtendo resultados idênticos. O método usado foi uma PCR triplex em que ambos os genes, GSTT1 e GSTM1, tinham sua seqüências amplificadas juntamente com uma seqüência do gene da ß-globina, controlando-se desta forma a qualidade do DNA extraído. A figura 1 mostra que a distribuição de genótipos é bastante semelhante entre os portadores de nódulos benignos, malignos e a população controle exceto quando os 2 genes estão ausentes. Estes casos são muito mais freqüentes entre os portadores de neoplasias malignas, de forma que a ausência dos 2 genes, combinada, significa um risco 2,6 vezes maior para o desenvolvimento de câncer da tiróide (8).

Figura 1. Comparação entre os diferentes padrões de herança polimórfica para os alelos GSTT1 (T) e GSTM (M) representados como ausentes (-) ou presentes (+) em 300 indivíduos normais da população de Campinas, 49 casos de bócio benigno e 67 casos de carcinomas malignos da tiróide.

Numa segunda fase desta investigação, aumentamos o número de tumores malignos para 98 casos, incluindo 77 carcinomas papilíferos e 21 foliculares. Utilizamos ainda 44 nódulos benignos e uma população controle de 157 indivíduos normais para genotipar as variantes alélicas do gene GSTP1, cuja relação com o câncer de cabeça e pescoço é maior segundo a literatura (9). Para tanto, lançamos mão de um método de rastreamento de mutações, a single strand conformation polymorphism analysis (SSCP) cujos resultados foram confirmados pelo sequenciamento direto de todas as amostras que apresentavam suspeita de alteração no padrão de corrida aletroforética. Os resultados obtidos podem ser visualizados na Figura 2. Embora as variantes alélicas de GSTP1 não distingam bócio de câncer nem adenomas de carcinomas foliculares, os indivíduos com genótipo variante, ajustado para sexo, idade, uso de tabaco e drogas, possuem uma chance de apresentarem câncer 5.7 vezes maior do que a população controle em relação ao carcinoma papilífero e 8.2 vezes maior do que a população controle para o carcinoma folicular (10).

Figura 2. Comparação entre os diferentes padrões de herança polimórfica para os alelos normais do gene GSTP1 representados em barras abertas e para os alelos variantes de GSTP1 em barras quadriculadas em indivíduos normais da população de Campinas, pacientes com bócio benigno e carcinomas papilíferos e foliculares da tiróide.

Não houve associação entre o genótipo para qualquer GST e as características clínicas dos pacientes, parâmetros da agressividade do tumor no diagnóstico ou comportamento durante o seguimento. Também, não foi encontrada relação entre o perfil genotípico para GSTs e os fatores de risco para o aparecimento de tumores da tiróide benignos e malignos que foram investigados, isto é, idade, sexo, cor, história de patologia tiroidodiana prévia, uso de drogas ou medicamentos ou fumo. Assim, tal perfil genotípico parece relacionar-se apenas ao risco do paciente adquirir um câncer da tiróide. Como a susceptibilidade a carcinógenos químicos pode modificar o risco do câncer da tiróide Diversos produtos químicos causam neoplasia de tiróide em roedores por um efeito carcinogênico direto, ativando os oncogenes, inativando os genes supressores tumorais e produzindo alterações específicas na expressão e função dos genes envolvidos no crescimento celular, diferenciação e tempo de vida da célula (11). Carcinógenos químicos também podem, através de uma variedade de mecanismos, alterar a função da tiróide e produzir uma neoplasia secundária ao desequilíbrio hormonal (11). No entanto, até o momento, o único fator reconhecidamente capaz de produzir tumores benignos e malignos na tiróide humana, tanto do ponto de vista experimental quanto por evidências clinico-epidemiológicas, é a radiação ionizante (2,3). Vários estudos epidemiológicos relacionaram a ingestão de cereais refinados (12), vegetais crucíferos (13) alimentos marinhos (14), laticínios (15) com maior risco de câncer da tiróide, mas outros não encontraram tal associação (16,17). Da mesma forma, a exposição a carcinógenos ambientes e mesmo ao cigarro são fatores discutíveis na susceptibilidade ao câncer da tiróide (13, 18). A ingestão de iodo está nitidamente relacionada à diminuição da prevalência de carcinomas foliculares e parece se relacionar com discreto aumento nos carcinomas papilíferos, mas ainda se discute o efeito de fatores ambientais no câncer da tiróide (18, 19). Dados relativos ao perfil das GSTs em pacientes com patologias tiroidianas são escassos. Conhecemos apenas o estudo de Hernandez et al, que não conseguiu demonstrar relação entre o perfil das GTSs e a susceptibilidade a o câncer da tiróide em moradores de Barcelona, Espanha (20). Além de possível influência do método menos sensível usado por Hernandez (restrição enzimática), podemos aventar as diferenças étnicas de nossa população, exposição a diferentes fatores ambientais e hábitos alimentares diferentes dos europeus como principais causas de tal diferença. Na verdade, acumulam-se evidências de que as GSTs e suas variantes alélicas possuem afinidades específicas por diferentes substratos (21-24). Assim, é possível que a herança de fatores de proteção contra fatores ambientais, como as enzimas do sistema GST, faça parte dos fatores responsáveis pelas diferenças na incidência do câncer da tiróide pelo mundo (14). Nosso laboratório prossegue na investigação de outros genes codificadores de enzimas do sistema GST, do citocromo P450 (CYP), do sistema n-acetil-transferase (Nat) e de outros sistemas de metabolismo de xenobióticos. Acreditamos que o uso de perfis genéticos, juntamente com os clássicos fatores clínicos e epidemiológicos de risco, poderá nos auxiliar na importante decisão de escolher, entre os portadores de nódulos da tiróide, os indivíduos que possuem risco de desenvolver câncer.

Bibliografía del artículo

1. Tomimori E, Pedrinola F, Cavaliere H, Knobel M, Medeiros-Neto G. Prevalence of incidental thyroid disease in a relatively low iodine intake area. Thyroid 1995; 5(4):273-6.
2. Schlumberger MJ. Papillary and follicular thyroid carcinoma. Baillieres Best Pract Res Clin Endo Metab 2000; 14(4): 601-613.
3. Boone RT, Fan CY, Hanna EY. Well-differentiated carcinoma of the thyroid. Otolaryngol Clin North Am. 2003;36(1):73-90.
4. Ward LS, Assumpção LVM. Cancer diferenciado da tiróide: fatores prognósticos e tratamento. Arq Bras Endocrinol Metab 2004 - no prelo.
5. American Cancer Society. Cancer facts and figures 2003. Disponível em: http://www.cancer.org/docroot/PRO/. Acessado em 23/12/2003.
6. Palli D, Masala G, Vineis P, Garte S, Saieva C, Krogh V, Panico S, Tumino R, Munnia A, Riboli E, Peluso M. Biomarkers of dietary intake of micronutrients modulate DNA adduct levels in healthy adults. Carcinogenesis. 2003;24(4):739-46.
7. Knudsen LE, Loft SH, Autrup H Risk assessment: the importance of genetic polymorphisms in man. Mutat Res. 2001; 482(1-2):83-8.
8. Morari EC, Leite JLP, Granja F, Assumpção LVM and Ward LS. Cancer Epidemiol, Bio & Prev 2002; 11(11):1485-1488.
9. Mulder TP, Manni JJ, Roelofs HM, Peters WH, Wiersma A. Glutathione S-transferases and glutathione in human head and neck cancer. Carcinogenesis 1995; 16(3):619-24.
10. Granja F, Morari J, Morari EC, Correia LA, Assumpção LVM, Ward LS. GST profiling may be useful in the screening for thyroid nodule malignancy. Cancer Letters 2004 - no prelo.
11. McClain RM. Mechanistic considerations for the relevance of animal data on thyroid neoplasia to human risk assessment. Mutat Res. 1995; 333(1-2):131-42.
12. Chatenoud L, La Vecchia C, Franceschi S, Tavani A, Jacobs DR Jr, Parpinel MT, Soler M, Negri E. Refined-cereal intake and risk of selected cancers in italy. Am J Clin Nutr. 1999; 70(6):1107-10.
13. Zivaljevic V, Vlajinac H, Jankovic R, Marinkovic J, Dzodic R, Sipeti Grujii S, Paunovic I, Diklic A, Zivaljevic B. Case-control study of female thyroid cancer - menstrual, reproductive and hormonal factors. Eur J Cancer Prev. 2003; 12(1):63-6.
14. Memon A, Varghese A, Suresh A. Benign thyroid disease and dietary factors in thyroid cancer: a case-control study in Kuwait. Br J Cancer. 2002;86(11):1745-50.
15. Galanti MR, Hansson L, Bergstrom R, Wolk A, Hjartaker A, Lund E, Grimelius L, Ekbom A. Diet and the risk of papillary and follicular thyroid carcinoma: a population-based case-control study in Sweden and Norway. Cancer Causes Control. 1997; (2):205-14.
16. Bosetti C, Negri E, Kolonel L, Ron E, Franceschi S, Preston-Martin S, McTiernan A, Dal Maso L, Mark SD, Mabuchi K, Land C, Jin F, Wingren G, Galanti MR, Hallquist A, Glattre E, Lund E, Levi F, Linos D, La Vecchia C. A pooled analysis of case-control studies of thyroid cancer. VII. Cruciferous and other vegetables (International). Cancer Causes Control. 2002; 13(8):765-75.
17. Mack WJ, Preston-Martin S, Bernstein L, Qian D. Lifestyle and other risk factors for thyroid cancer in Los Angeles County females. Ann Epidemiol. 2002; 12(6):395-401.
18. Nagataki S, Nystrom E. Epidemiology and primary prevention of thyroid cancer. Thyroid. 2002; 12(10):889-96.
19. Czene K, Lichtenstein P, Hemminki K. Environmental and heritable causes of cancer among 9.6 million individuals in the Swedish Family-Cancer Database. Int J Cancer. 2002; 99(2):260-6.
20. Hernandez A, Cespedes W, Xamena N, Surralles J, Creus A, Galofre P, Marcos R.. Glutathione S-transferase polymorphisms in thyroid cancer patients. Cancer Lett. 2003; 190(1):37-44.
21. Pal A, Hu X, Zimniak P, Singh SV. Catalytic efficiencies of allelic variants of human glutathione S-transferase Pi in the glutathione conjugation of alpha, beta-unsaturated aldehydes. Cancer Lett. 2000; 154(1):39-43.
22. Pandya U, Srivastava SK, Singhal SS, Pal A, Awasthi S, Zimniak P, Awasthi YC, Singh SV. Activity of allelic variants of Pi class human glutathione S-transferase toward chlorambucil. Biochem Biophys Res Commun. 2000;278(1):258-62.
23. Hu X, Pal A, Krzeminski J, Amin S, Awasthi YC, Zimniak P, Singh SV. Specificities of human glutathione S-transferase isozymes toward anti-diol epoxides of methylchrysenes. Carcinogenesis. 1998; 19(9):1685-9.
24. Hu X, Seidel A, Frank H, Srivastava SK, Xia H, Pal A, Zheng S, Oesch F, Singh SV. Differential enantioselectivity of murine glutathione S-transferase isoenzymes in the glutathione conjugation of trans-3,4-dihydroxy-1, 2-oxy-1,2,3,4-tetrahydrobenzo[c]phenanthrene stereoisomers. Arch Biochem Biophys. 1998; 358(1):40-8.