DETECTION OF TRICHOMONAS TENAX IN PATIENTS WITH GINGIVITIS

Abstract
Trichomonas tenax is a protozoan that can be detected like a comensal microorganism from human oral cavity in some subjects. There are studies that related its incidence in patients with Marginal Chronic Periodontitis and other periodontal diseases. The aim of this study was to detect this species in patients with Gingivitis who assist to Dental School at Central University of Venezuela. In this study, 40 patients were selected and classified in two groups: 1) Experimental: 20 adult patients with Gingivitis who dental calculus samples were taken, and 2) Control: 20 adult patients without periodontal disease, who subgingival dental plaque´s samples were taken. Two samples of each patient were taken and cultivated in "Kupferberg Trichomonas Broth" (K.T.B.) medium tubes. The tubes were incubated aerobically and anaerobically at 37ºC for 72 hours. Protozoa were identified by direct observation of flagellar morphotypes that grew in K.T.B. medium, using light microscopy. Results of the study indicated that T. tenax was detected in 7 (35%) patients with Gingivitis and was detected in 2 (10%) patients periodontally healthy.

Key words
Trichomonas tenax, Gingivitis, detection, oral protozoa, subgingival plaque.

Artículo completo
Introducción
Trichomonas tenax es un protozoario que se observó por vez primera en la cavidad bucal humana en 1773. Su trofozoíto comparte con otras especies del género Trichomonas (T. vaginalis y T. hominis) la forma ovalada o elipsoidal, así como la presencia de cuatro flagelos en el polo anterior, una membrana ondulante y un axostilo que atraviesan longitudinalmente el cuerpo celular (figura 1).

FIGURA 1. Dibujo esquemático de T. tenax en donde se destacan las siguientes estructuras: F.A., flagelos anteriores; B, blefaroplastos; M.o., membrana ondulante; F.p., flagelo posterior; C, citoplasma; N, núcleo; A.x., axostilo; G.c., gránulos cromáticos; A.p., aparato parabasal.

Su tamaño promedio oscila entre 4 y 13 micrómetros de longitud por 2 a 9 micrómetros de anchura (1-4). De manera análoga a Entamoeba gingivalis, T. tenax presenta una distribución cosmopolita y se aísla en la cavidad bucal de pacientes con mala higiene bucal, donde este flagelado se alimenta de restos celulares4. El microorganismo vive en el cálculo dental y forma parte de la microbiota que conforma la placa dental subgingival (5,6).Al carecer de fase quística, T. tenax tiene que transmitirse directamente por medio de gotas de saliva y besos, o indirectamente a través del agua, alimentos o fómites contaminados (por ejemplo, cepillos de dientes, cubiertos o vasos). Sin embargo, los trofozoítos son bastante resistentes y se ha observado la supervivencia de éstos durante 3 a 6 días en el agua de beber a temperatura ambiente (4).Aun cuando T. tenax puede estar como comensal en la cavidad bucal de algunos individuos, está claramente demostrado el papel que juega esta especie como microorganismo patógeno, implicado en distintos procesos patológicos que se suscitan tanto dentro como fuera de los límites de la boca, constituyendo ésta un foco de infección (7). Aunque puede producir la lisis de células epiteliales, hematíes y leucocitos, se piensa que se comporta como un microorganismo oportunista en las lesiones producidas por otros microorganismos para obtener más fácilmente los nutrientes que necesita (4).La detección de T. tenax en pacientes con enfermedad periodontal ha sido puesta de manifiesto en diversos reportes publicados al respecto. En este sentido, Pardi y col. (8) realizaron un estudio donde se demostró la incidencia de este microorganismo en un grupo de 30 pacientes adultos con periodontitis marginal crónica (PMC) en relación con un grupo de 30 pacientes adultos periodontalmente sanos. Los resultados de este estudio reflejaron que el protozoario se detectó en 9 (30%) de los 30 pacientes con PMC y sólo en 1 (3%) de los 30 pacientes sin enfermedad periodontal.De igual forma, Zdero y col. (9) realizaron un estudio en dos poblaciones de 50 pacientes adultos de ambos sexos, de la ciudad de Rosario, Argentina: la población 1 (control) con bocas sanas y buenos hábitos de higiene bucal y la población 2 con gingivitis y/o periodontitis y mala higiene bucal. El objetivo fue la búsqueda de E. gingivalis y T. tenax para determinar sus prevalencias en individuos con patología bucal y la relación de estos parásitos con la IgA y el pH salival. La frecuencia de E. gingivalis y T. tenax en la población 1 fueron de 48% y 10% respectivamente y resultaron notablemente mayores en la población 2 (E. gingivalis: 76% y T. tenax: 20%). La presencia de estos parásitos bucales fue independiente del valor de IgA en las dos poblaciones y la población control mostró dependencia entre el pH salival y la presencia de protozoarios, en tanto que en la población con patología bucal no habría dependencia entre estas variables.Por su parte, Mahdi y al Saeed (10) realizaron en la población de Basrah, Irak un estudio para determinar la frecuencia de T. tenax en 143 muestras de pacientes con problemas periodontales y 271 muestras provenientes de pacientes periodontalmente sanos, encontrando al protozoario en 8,4% de los pacientes con enfermedad periodontal y 4,1% de los pacientes sanos. Se ha podido detectar a T. tenax en procesos patológicos de la cavidad bucal diferentes de las patologías periodontales. En este sentido, Duboucher y col. (11) reportaron un caso de trichomoniasis salival debido a la presencia de este microorganismo en la glándula submaxilar de una paciente de 85 años. De igual forma, se han reportado diversos casos de patologías que se suscitan fuera de los límites de la cavidad bucal en las que se encuentra implicada esta especie, tales como: trichomoniasis pulmonar, encontrándose T. tenax en pacientes con abscesos en el pulmón, cáncer pulmonar o bronconeumonía (12-14), meningitis poilimicrobiana (15), absceso subhepático (16), fibrosis quística en seno (17), infección de un nódulo linfático (18) y más recientemente dos casos, uno de trichomoniasis pleural en un paciente masculino de 59 años con diagnóstico de adenocarcinoma metastático de pulmón y en el que el fluido pleural obtenido era purulento, fétido y con grandes cantidades de T. tenax mezcladas con una flora bacteriana mixta (19) y el otro de un empiema en un paciente masculino de 56 años a nivel de la parte inferior del tracto respiratorio (20). Sobre la base de todo lo anteriormente señalado, el objetivo de esta investigación fue detectar a T. tenax en un grupo de pacientes con gingivitis, los cuales estaban recibiendo tratamiento odontológico en la Facultad de Odontología de la Universidad Central de Venezuela (U.C.V.). Materiales y métodos
Selección de los pacientes
En este estudio, se seleccionaron 40 pacientes que asistían a la Facultad de Odontología de la U.C.V. por diversos motivos, a fin de recibir tratamiento odontológico. Estos pacientes fueron divididos en dos grupos:

1. Grupo experimental. Estaba conformado por 20 pacientes adultos, quienes tenían diagnóstico de gingivitis (diagnóstico previamente establecido en sus historias clínicas) y no habían recibido tratamiento periodontal. Sus edades oscilaban entre 21 y 67 años y 12 eran de sexo masculino. A cada uno de los pacientes se le realizó un examen clínico bucal, observándose gran cantidad de cálculo dental y de detritus, lo que implicaba higiene bucal deficiente, y se les tomaron radiografías de la zona elegida previo a la toma de las muestras, a fin de evidenciar que no hubiese pérdida ósea característica de la periodontitis, sino únicamente inflamación de las encías, característica ésta de la gingivitis.
2. Grupo control. Estaba compuesto por 20 pacientes adultos, a quienes les habían realizado los procedimientos de tartrectomía y de técnicas de enseñanza de higiene bucal, por lo que sus condiciones periodontales eran satisfactorias y su higiene bucal excelente. Estos pacientes se encontraban en la fase resolutiva del tratamiento odontológico (instalación de prótesis parcial fija y/o removible en aquellos casos que así lo requerían, o culminación de la odontología operatoria en los pacientes que no requerían prótesis dentales). La edad de los integrantes de este grupo oscilaba entre 24 y 59 años y 15 eran de sexo masculino.

Toma y recolección de las muestras
Para realizar la toma de la muestra de los pacientes de ambos grupos, se seleccionaron las zonas anteroinferior y posterosuperior de cada uno de ellos, debido a que en esas zonas se acumula gran cantidad de cálculo dental, detritus y placa dental subgingival (en los pacientes con gingivitis). En los pacientes del grupo control, se tomaron muestras de placa dental subgingival, ya que estos no tenían ni cálculo dental ni detritus alrededor de sus dientes. Para la remoción del cálculo dental, así como de los detritus y de la placa subgingival de los pacientes con gingivitis se emplearon tartrectomos y curetas periodontales previamente esterilizadas. A los pacientes del grupo control se les tomaron muestras de placa dental ubicada alrededor del cuello de los dientes, utilizando para ello curetas periodontales previamente esterilizadas. El cálculo dental removido de los pacientes del grupo experimental fue triturado con varillas de vidrio esterilizadas previo a la siembra y a la observación microscópica.Transporte de las muestras
Las muestras tomadas fueron colocadas en los viales con el medio de transporte (solución de Ringer estéril) y llevadas de inmediato al Laboratorio de la Cátedra de Microbiología de la Facultad de Odontología de la U.C.V. para su posterior siembra y observación microscópica. Siembra de las muestras
Luego que las muestras fueron llevadas al laboratorio, se tomó por cada paciente de ambos grupos 0,1ml. de la solución de Ringer que contenía el inóculo, utilizando para ello pipetas estériles de 1ml y se sembró en el caldo selectivo de Kupferberg, medio empleado para el crecimiento de T. tenax ("Kupferberg Trichomonas Broth", Difco Laboratories, Detroit, Michigan, U.S.A.), al cual se le añadió 0,1 g. de cloranfenicol a fin de evitar el crecimiento de bacterias y otros microorganismos contaminantes. Se realizaron dos siembras por cada paciente, una para ser incubada en condiciones de aerobiosis y la otra para ser incubada en condiciones de anaerobiosis, utilizando la jarra destinada para tal fin (Gas Pak). Los medios de cultivo sembrados fueron incubados en la estufa a 37 ºC por 72 horas.Observación microscópica
Para la detección de T. tenax se realizaron observaciones microscópicas en tres ocasiones por cada paciente, a fin de determinar en cuales ocasiones existía la posibilidad de visualizar al protozoario. Las observaciones se realizaron el mismo día de la toma de muestra, tomando una gota del inóculo contenido en el medio de transporte con el asa de platino previamente esterilizada para colocarlo sobre una lámina portaobjeto. Las otras dos observaciones microscópicas se realizaron 72 horas después de haber incubado los medios en la estufa, tomando una gota del inóculo con el asa de platino previamente esterilizada, tanto del caldo que se incubó en condiciones de aerobiosis como el que se incubó en anaerobiosis, colocándola en cada caso sobre la superficie de su respectiva lámina portaobjeto.En cada una de las ocasiones antes referidas, se colocó sobre la gota de suspensión microbiana una laminilla cubreobjeto, para realizar posteriormente la observación al fresco, mediante el empleo del microscopio de luz (marca Leitz), enfocando en primera instancia con un lente de poco aumento (10x) y después con lentes de mayor aumento (20x y 40x).Resultados
Hallazgos microbiológicos
El crecimiento microbiano en el caldo selectivo de Kupferberg fue claramente evidenciado por la aparición de turbidez característica en el medio, así como la aparición de un sedimento en el fondo. Asimismo, se pudo observar un cambio de color del medio de azul a amarillo, debido al mismo crecimiento celular.La observación al fresco de las láminas preparadas permitió visualizar en los casos considerados como positivos, a los protozoarios desplazándose en algunos casos con movimientos circulares y en otras ocasiones sin moverse y aislados. Usualmente, los morfotipos flagelados de T. tenax pueden ser observados con cuatro flagelos, pero en algunas ocasiones pueden verse solamente con uno o dos flagelos.Detección de T. tenax
Los resultados de este estudio revelaron que T. tenax se detectó en 7 (35%) de los 20 pacientes con gingivitis (casos positivos), en tanto que el protozoario no pudo ser aislado en los 13 pacientes restantes (65%) de este grupo (casos negativos) (figura 2).

Con respecto a los pacientes periodontalmente sanos (grupo control), el microorganismo se encontró solamente en 2 (10%) casos (casos positivos), y los 18 individuos restantes de este grupo (90%) fueron considerados como casos negativos, al no poderse evidenciar la presencia del flagelado (figura 3).

Es importante resaltar que a los 7 pacientes con gingivitis, a quienes se les detectó T. tenax en sus bocas, se les pudo visualizar el flagelado tanto al realizar la observación microscópica inmediatamente después de la toma de muestra como en las observaciones realizadas 72 horas posincubación de los medios en condiciones de anaerobiosis. En cuanto a las observaciones microscópicas realizadas 72 horas después de haberse incubado los medios selectivos en condiciones de aerobiosis, T. tenax se detectó en 5 de los 7 casos positivos.En relación con los 2 casos positivos del grupo control, T. tenax se pudo identificar tanto en el momento que se realizaron las observaciones microscópicas inmediatamente después de la toma y recolección de las muestras, como cuando se realizaron las observaciones microscópicas de las muestras sembradas en los medios que se incubaron tanto en aerobiosis como en anaerobiosis.Con respecto al sexo de los pacientes, hay que destacar que la proporción de pacientes masculinos del grupo experimental a quienes se les detectó T. tenax fue mayor que de pacientes femeninos: 5 (25%) de los 12 pacientes masculinos y sólo 2 (10%) de los 8 pacientes del sexo femenino (tabla 1).

De igual forma, los 2 pacientes del grupo control (10%) a los cuales se les aisló T. tenax de sus bocas, eran del sexo masculino (tabla 2).

Asimismo, la frecuencia de detección de T. tenax en los pacientes del grupo experimental fue mayor en el grupo etario comprendido entre 20 y 30 años, ya que de los 6 pacientes ubicados dentro de este grupo, el protozoario se encontró en 3 (15%) de éstos, en tanto que en los grupos etarios comprendidos entre 41 y 50 años y mayor de 50 años, este microorganismo se halló en 1 (5%) de los 4 pacientes que conformaban cada grupo (tabla 3).

Por otra parte, los dos casos positivos del grupo control, correspondieron a pacientes ubicados dentro de de los grupos etarios comprendidos entre 20 y 30 años y 31 y 40 años (1 paciente de cada grupo) (tabla 4).

Discusión
Aunque existe una gran variedad de protozoarios que pueden producir enfermedades en el ser humano, y muchos de ellos llegarán a su localización definitiva intestinal tras pasar por la cavidad bucal, solamente dos especies, T. tenax y E. gingivalis se han adaptado a las condiciones ecológicas existentes en esta región del organismo (4).Si bien se ha señalado que la asociación de estas dos especies con las enfermedades periodontales es discutible (4), y de hecho algunos autores los han considerado como microorganismos no patógenos (21), existen evidencias más que suficientes y en este sentido se han publicado diversos informes que han demostrado de manera inequívoca su papel como microorganismos patógenos en gingivitis, periodontitis, así como en otros procesos patológicos que se suscitan tanto dentro como fuera de los límites de la cavidad bucal. Por ello, en este estudio se decidió detectar a T. tenax en un grupo de pacientes con diagnóstico de gingivitis, considerando que en Venezuela son escasos los informes que existen en relación con la detección de este microorganismo en pacientes con patologías periodontales. Los resultados de este estudio demostraron que la frecuencia con la cual se detectó T. tenax fue mayor en los pacientes ubicados en el grupo experimental (con gingivitis) que en el grupo de pacientes periodontalmente sanos (grupo control). Estos resultados coinciden con los publicados por otros investigadores (9,10,22-24); sin embargo, difieren de los obtenidos por Ferrara y col. (25), quienes reportaron que de 14 pacientes con gingivitis a quienes se les tomó muestras de placa y cálculo dental a fin de demostrar la presencia de T. tenax, no lograron aislar al protozoario en ninguno de estos.Se ha podido detectar a T. tenax en pacientes con gingivitis ulcerativa aguda y en este sentido existen reportes publicados al respecto (26,27). Destacan estos reportes que la frecuencia de detección del microorganismo oscila entre 12% y 32% de los pacientes con la patología antes mencionada.En cuanto al sexo, si bien este no parece tener mayor influencia en la frecuencia de aparición de T. tenax en los pacientes con gingivitis, el protozoario fue detectado principalmente en los pacientes masculinos y en este sentido, resultados similares han sido reportados por otros autores (6,23,28). Ello podría obedecer a que los pacientes del sexo masculino son, por lo general, más descuidados que los del sexo femenino en cuanto a higiene bucal se refiere, lo que implicaría desde luego que tuvieran mayor cantidad de cálculo dental en sus bocas. Con respecto a la edad, si bien la frecuencia de detección de T. tenax en los pacientes del grupo experimental (con gingivitis) fue mayor en aquellos que tenían menor edad (20-30 años) y ello no coincide con lo afirmado en algunas publicaciones donde se señala que la frecuencia de detección del flagelado en sujetos con periodontopatías se incrementa a medida que aumenta la edad de estos (5,28,29), es posible que estos pacientes en razón de su edad, estén más motivados en acudir al odontólogo a fin de que les realicen controles periódicos de su salud bucal y por lo tanto sea menos probable que tengan problemas periodontales más avanzados. La capacidad por parte de T. tenax de producir infecciones en la cavidad bucal puede incrementarse en aquellos pacientes que además de presentar cálculo dental, sean respiradores bucales o presenten hipertrofia de las papilas de la lengua (lengua pilosa) (29).Se ha podido demostrar que la actividad proteolítica de T. tenax viene dada por proteasas de la cisteína o cisteinasas capaces de hidrolizar distintos tipos de colágeno (tipos I, III, IV y V), todos ellos presentes en los tejidos periodontales. Asimismo se sugiere la posible presencia de metaloproteinasas en este protozoario, las cuales podrían contribuir a la actividad antes mencionada (30,31). También se ha podido demostrar in vitro que la actividad proteolítica por parte de células de T. tenax detectadas en muestras de placa dental humana puede deberse a la presencia de endopeptidasas (32). Queda aún por aclarar si además de los efectos que ejercen las cisteinasas producidas por este protozoario sobre los tejidos periodontales, concretamente sobre la matriz proteica, cumplen otras funciones. De allí que se sugiera sobre su posible implicación en la destrucción de varios componentes de diversa índole del sistema inmunológico del hospedero (30,31). Por otra parte, se ha demostrado que una cepa de T. tenax (ATCC 30207) sintetiza dos tipos distintos de hemolisinas, una de naturaleza lipídica y la otra de naturaleza proteica, las cuales destruyen los glóbulos rojos humanos y de algunos animales (ovejas, conejos y caballos) (33). Además, se ha comprobado, al menos de manera experimental, que T. tenax no se adhiere a las células epiteliales ni a los fibroblastos porque no posee adhesinas o proteínas de superficie que permitan la unión (34). La gran movilidad de T. tenax que se observa con el microscopio en preparaciones al fresco con solución salina es una característica importante para su identificación en el laboratorio (4). Dicha observación constituye un hecho imprescindible si se quiere lograr el hallazgo rápido del protozoario, pudiéndose visualizar en ocasiones con uno o dos flagelos. No obstante, deben inocularse las muestras tomadas en los medios de cultivo selectivos a fin de garantizar mayor seguridad en la identificación de esta especie (2,35).Conclusiones

1. La frecuencia de detección de T. tenax fue mayor en los pacientes con Gingivitis que en los pacientes periodontalmente sanos.
2. La proporción en la cual se encontró T. tenax en los pacientes con Gingivitis fue mayor en los del sexo masculino que en los del sexo femenino.
3. La frecuencia de detección de T. tenax en los pacientes con Gingivitis fue mayor a medida que disminuía la edad de estos.

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