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OTRAS TECNICAS DIAGNOSTICAS PARA EL ESTUDIO DE LAS DISTROFIAS MUSCULARES DE DUCHENNE/BECKER
(especial para SIIC © Derechos reservados)
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montejo9.jpg Autor:
Yuset Montejo Pujadas
Columnista Experto de SIIC



 Artículos publicados por Yuset Montejo Pujadas 

Recepción del artículo: 7 de enero, 2004

Aprobación: 0 de , 0000

Primera edición: 7 de junio, 2021
Segunda edición, ampliada y corregida:  7 de junio, 2021

Conclusión breve
En este trabajo se dan a conocer técnicas moleculares que se utilizan en la actualidad para el estudio de esta enfermedad, tales como electroforesis por microchip, secuenciación directa del gen e hibridación múltiple.

Resumen

Las distrofias musculares de Duchenne/Becker (DMD/B) se encuentran entre las miopatías más frecuentes, con una incidencia de 1:3500 varones nacidos vivos. Presenta un patrón de herencia recesivo ligado al sexo. El gen responsable de esta enfermedad se conoce como gen DMD y se localiza en el brazo corto del cromosoma X. Es uno de los genes más grandes que se conocen, por lo que es muy susceptible a sufrir mutaciones; las deleciones son las más frecuentes, aunque pueden existir duplicaciones o inserciones dentro del gen. Existen numerosas técnicas moleculares para el estudio de esta enfermedad desarrolladas durante años. En este trabajo se pretende dar a conocer otras técnicas moleculares que se utilizan en la actualidad para el estudio de esta enfermedad, tales como electroforesis por microchip, secuenciación directa del gen e hibridación múltiple, así como hacer referencia a algunos métodos terapéuticos.

Palabras clave
Distrofia muscular Duchenne, distrofia muscular Becker, gen DMD, deleciones, terapia.

Clasificación en siicsalud
Artículos originales> Expertos del Mundo>
página www.siicsalud.com/des/expertos.php/66222

Especialidades
Principal: Neurología, 
Relacionadas: Bioquímica, Diagnóstico por Laboratorio, Genética Humana, 

Enviar correspondencia a:
Dra. Yuset Montejo Pujadas. Mazón 163 e/ San José y Valle. Plaza. Ciudad Habana. Cuba 10300.

ADDITIONAL TECHNIQUES FOR THE MOLECULAR DIAGNOSIS OF THE DUCHENNE/BECKER MUSCULAR DYSTROPHY

Abstract
Duchenne/ Becker Muscular Dystrophies (DMD/B) are the most frequent myopathies. They are estimated to affect 1:3500 newborn males. They are X-linked recessive diseases. The DMD gene is located in the short arm of the X chromosome. It is the biggest gene described. This fact makes it vulnerable to an increasing number of mutations, among which deletions are the most frequent, although duplications and insertions can also be found. There are several molecular techniques which are very useful for the diagnosis of these diseases. This article describes other molecular techniques which have demonstrated to be useful in the molecular diagnosis of DMD/B, as well as some aspects related to gene therapy.

Key words
Duchenne muscular dystrophy, Becker muscular dystrophy, DMD gene, deletion, therapy.

OTRAS TECNICAS DIAGNOSTICAS PARA EL ESTUDIO DE LAS DISTROFIAS MUSCULARES DE DUCHENNE/BECKER

(especial para SIIC © Derechos reservados)

Artículo completo

Introducción
Las distrofias musculares de Duchenne/Becker (DMD/B) se encuentran entre las miopatías hereditarias más graves, con una incidencia de 1:3500 varones nacidos vivos1 y un patrón de herencia recesivo ligado al sexo.2 Sus principales características son la debilidad muscular, la hipertrofia de gemelos, así la como maniobra de Gower positiva. Estos síntomas provocan la invalidez en la primera década de vida y luego la muerte por insuficiencia respiratoria o cardíaca.3 Los pacientes aquejados por esta enfermedad presentan valores de fosfocreatinquinasa (CPK) en sangre muy elevados. El gen causante de la enfermedad se conoce como gen DMD, y se localiza en el brazo corto del cromosoma X en la región Xp21.1-21.3.4

Por años se conoció la existencia de otra miopatía, muy parecida a la de Duchenne pero con síntomas menos severos; no fue sino hasta 1955 que Becker descubrió que tanto la DMD como la DMB son formas alélicas de un mismo gen.5 El gen DMD está constituido por 79 exones. Las mutaciones más frecuentes encontradas en éste son las deleciones, aunque pueden existir duplicaciones, mutaciones puntuales o traslocaciones.6

La proteína distrofina, codificada por este gen, fue aislada por primera vez en 1987. Presenta un PM = 427 kDa y está formada por 3685 aminoácidos.7 Su función se ha visto relacionada con la estabilidad que es capaz de proporcionarle a la membrana del músculo durante los ciclos de contracción y relajación y, además, con el anclaje de otras proteínas musculares citoplasmáticas a la membrana celular.8

El análisis de estas enfermedades se hace un poco complejo debido a la extensión y tasa de mutación del gen DMD. Las numerosas técnicas moleculares existentes para su estudio han contribuido a mejorar la calidad de vida de los pacientes y las familias portadoras; entre ellas se cuentan el Southern Blot, fragmentos de restricción de longitud Polimórficos (RFLP), Western Blot (WB) para el estudio de la proteína, y -la más utilizada por todos- la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). 9 Sin embargo, existen otras técnicas que han permitido también la realización de otros estudios entre las que podemos citar:

  1. Cromatografía líquida desnaturalizante de alta resolución (DHPLC).
  2. Método de secuenciación directa.
  3. Amplificación y secuenciación simple utilizando oligonucleótidos internos (SCAIP).
  4. Amplificación múltiple por sondas hibridadas.
  5. Electroforesis por microchip.
Desarrollo
  1. Cromatografía líquida desnaturalizante de alta resolución (DHPLC)
    Este método permite detectar alteraciones de diferentes tamaños en el gen DMD. Aunque hay un ligero incremento en el costo, la técnica es, sin embargo, útil porque podemos encontrar hasta 92% de las mutaciones existentes en pacientes con DMD y DMB.10 Se trabaja con oligonucleótidos diseñados para una región determinada. Se fundamenta en la separación de fragmentos de ADN homodúplex y heterodúplex utilizando cromatografía líquida de fase reversa.11 No se requiere la utilización de radioisótopos ni bromuro de etidio para la visualización de los resultados en esta técnica.
  2. Método de secuenciación directa
    Este método ha sido considerado demasiado caro y extenso, pero existe una forma más directa del estudio de deleciones a través de secuenciación de fragmentos específicos utilizando polimorfismo conformacional de simple cadena (SSCP). Los SSCP permiten detectar otras mutaciones que no sean deleciones, pero luego se necesita secuenciar para poder determinar donde se encuentra la mutación patogénica.12 Por otro, lado hay muchos gastos de tiempo, reactivos y personales.
  3. Amplificación y secuenciación simple utilizando oligonucleótidos internos (SCAIP).
    Se amplifican simultáneamente gran cantidad de exones y luego se procede a la secuenciación de la región amplificada por medio de un set interno de oligos. Esto garantiza el estudio de las dos cadenas y siete de los ocho promotores que presenta este gen. Por medio de este método se puede determinar el polimorfismo existente en la región de intrones estudiados y detectar el 2% de los pacientes con deleciones exónicas que no son detectadas por los métodos del PCR múltiplex conocidos.Además, permite analizar a un gran número de pacientes de forma rápida, económica y eficiente al permitir la secuenciación de una gran parte del gen.13
  4. Amplificación múltiple por sondas hibridadas
    Se fundamenta en la recuperación de la sonda después de su hibridación por el ADN inmovilizado. Cada sonda es amplificada solamente con un juego de oligos. Al aplicar esta técnica, es posible determinar las deleciones o duplicaciones que pueden estar presentes en los 79 exones del gen DMD de un paciente afectado.La prueba tiene como ventaja que puede emplearse en diferentes laboratorios, ya que utiliza métodos tradicionales tales como southern blot y reacción en cadena de la polimerasa (PCR).14
  5. Electroforesis por microchip
    Constituye un método más rápido y menos trabajoso que el southern blot para determinar las mutaciones presentes en el gen DMD y realizar estudios de portadoras. Además, no se trabaja con radiactividad, que siempre conlleva algún riesgo para la salud, con la consiguiente protección al personal que realiza la prueba.Se utilizan instrumentos y reactivos comerciales, por lo que puede ser aplicado en laboratorios dedicados al diagnóstico de la enfermedad. 15

Terapia génica
En los últimos años han adquirido desarrollo diferentes tipos de terapia: la génica, imposible de aplicar al hombre por problemas éticos y técnicos; y la de células somáticas, que utiliza genes previamente clonados y asociados con una determinada enfermedad.16 En el caso de la DMD, se ha utilizado la terapia de genes convencionales entre los que se encuentran vectores virales, plásmidos desnudos y trasplante de células, los cuales tienen problemas por los bajos resultados obtenidos en la mejoría de estos los pacientes afectados.

En estos momentos, se está trabajando con vectores de adenovirus y se ha modificado el proceso de maduración del ARN que participa en la síntesis de la proteína distrofina.17

Otro tipo de terapia sería aumentar la producción de utrofina, proteína presente en todas células musculares, que podría sustituir las funciones de la distrofina. Esta proteína se puede encontrar en la región donde hace contacto el nervio con el músculo, conocida como unión neuromuscular. La fibra muscular produce utrofina durante todo el período de vida fetal. Una vez que el feto está desarrollado, la utrofina es sustituida por la distrofina, de manera que es una vía muy prometedora para el tratamiento de esta patología.

Conclusiones
Cada día las técnicas moleculares utilizadas para el estudio de numerosas enfermedades que hasta estos momentos no tienen una terapia certera contribuyen a mejorar la calidad de vida de familias afectadas. En el caso de la DMD, se han podido realizar estudios de portadoras así como diagnósticos prenatales, y todos ellos han contribuido en algún grado al esclarecimiento de la enfermedad desde el punto de vista molecular.




Bibliografía del artículo

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  16. Yang L, Lochmuler H, Luo J, Massie B, Nalbantoglu J, Karpati G, Petrof BJ. Adenovirus-mediated dystrophin minigene transfer improves muscle strength in adult dystrophic (MDX) mice. Gen Ther 1998; 5(3):369-379.
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