Para el diagnóstico de la sífilis se requieren métodos directos e indirectos. Los métodos directos, como el examen directo en campo oscuro (EDCO), permiten demostrar la presencia de Treponema pallidum subespecie pallidum en muestras de lesiones sifilíticas durante las etapas tempranas; mientras que los métodos indirectos permiten la detección de anticuerpos séricos inespecíficos (pruebas no treponémicas) o anticuerpos específicos (pruebas treponémicas). Dentro del grupo de las pruebas no treponémicas las más usadas son el Venereal Disease Research Laboratory (VDRL) y la detección rápida de reaginas plasmáticas (RPR); y como pruebas treponémicas la hemaglutinación de T. pallidum (HATP), los ensayos inmunoenzimáticos (ELISA) y la absorción de anticuerpos fluorescentes (FTA-ABS). La Organización Mundial de la Salud (OMS) recomienda la combinación de ambas pruebas serológicas para establecer el diagnóstico definitorio de esta entidad. ²

Los ensayos ELISA se introducen en el diagnóstico de la sífilis por la necesidad de contar con pruebas rápidas, específicas y automatizadas que permitan la pesquisa y confirmación de la misma. Diversos ELISA han sido diseñados y evaluados con estos objetivos. ^3-5 El uso de antígenos de T. pallidum obtenidos por vía recombinante, en lugar de mezclas de antígenos treponémicos pobremente definidas obtenidas de testículos de conejo, ha sido una estrategia potencial para aumentar las especificidades de estas pruebas. ^6,7

La primera proteína de T. pallidum estudiada y utilizada con este objetivo fue la proteína de membrana externa TmpA, cuyo gen fue secuenciado desde 1985, valorándose desde entonces el uso potencial de ELISA con este antígeno expresado en Escherichia coli.⁸ Su estructura antigénica también ha sido estudiada a través de péptidos sintéticos sobrelapantes. ⁹

Varios autores han comunicado la utilización de ensayos ELISA con TmpA derivada de ADN recombinante en el diagnóstico y confirmación serológica de la sífilis, y los resultados obtenidos eran buenos. ^10-13 También se ha informado el uso de esta prueba en la evaluación de la terapéutica antibiótica a dicha enfermedad, a diferencia del resto de las pruebas treponémicas, en las que los niveles de anticuerpos después del tratamiento se mantienen detectables por largos periodos e incluso de por vida. ¹⁰

En el presente trabajo se muestran los resultados obtenidos al evaluar un sistema ELISA anti-TmpA recombinante en el diagnóstico y confirmación de sífilis.

Materiales y métodos
Se diseñó un estudio experimental, donde la selección de los pacientes se realizó a nivel del sistema de atención primaria de salud durante un periodo de 3 meses. Fueron recolectadas muestras de sueros de 76 pacientes con sífilis sin tratar (38 con sífilis primaria, 10 con sífilis secundaria y 28 en estado de latencia temprano), utilizando para su diagnóstico la combinación del VDRL (Imefa, Cuba) y/o la RPR (Imefa, Cuba) como métodos de pesquisa, y EDCO en lesiones genitales y la HATP (OXOID, Diagnosis Reagents, England) como métodos confirmatorios. Se incluyeron además 2 muestras de pacientes con sífilis congénita y otras provenientes de personas supuestamente sanas (164 donantes de sangre, 29 embarazadas y 9 ancianos) y de pacientes con patologías que pudieran dar reacciones falsas positivas en las pruebas serológicas para sífilis (8 leptospirosis humana, 7 mononucleosis infecciosa, 9 hepatitis, 11 diabetes mellitus, 13 artritis reumatoidea, 11 lepra, 9 tuberculosis, 12 HIV/sida, 4 lupus eritematoso sistémico y 3 fiebre reumática).

El panel de 367 sueros fue codificado utilizando un sorteo al azar para evitar efectos subjetivos en las observaciones posteriores.

A todas estas muestras les fue aplicado el sistema ELISA anti-TmpA (BioSCREEN&TM;, Heber Biotec S.A., Cuba), que consiste en un ensayo inmunoenzimático tipo sandwich indirecto, en el cual los pocillos están recubiertos con el antígeno TmpA recombinante con un 90% de pureza, obtenido en E. coli. Todas las pruebas serológicas fueron desarrolladas según las instrucciones descritas en cada estuche diagnóstico.

Los parámetros cualitativos (sensibilidad, especificidad, valores predictivos positivo y negativo) del sistema ELISA fueron calculados con un intervalo de confianza de 95%, así como la sensibilidad del método en cada uno de los estadíos clínicos estudiados de la enfermedad.

La precisión (intraensayo e interensayo) de la prueba fue determinada utilizando 8 sueros, 6 de ellos pertenecientes a pacientes con sífilis en los diferentes estadíos clínicos y con diferentes reactividades serológicas por VDRL/RPR y HATP, y 2 de donantes de sangre negativos a estas pruebas.

Resultados y discusión
Los ensayos serológicos han sido los procedimientos fundamentales para la pesquisa y diagnóstico de la sífilis, los cuales son adquiridos generalmente en forma de estuches comerciales. ² Recientemente se han descrito y evaluado nuevos sistemas de diagnóstico potencialmente útiles para esta actividad. ^2,14

El sistema ELISA anti-TmpA de T. pallidum utilizado en este trabajo es presentado en forma de un paquete diagnóstico. Al evaluarlo con el panel de sueros recolectados se encontró una sensibilidad general para él de 91.02% y una especificidad de 96.19% (tabla 1).

Los valores obtenidos son aceptables para un método de diagnóstico serológico y comparables con los de otros ensayos ELISA, en los que han sido usado también la proteína TmpA obtenida por vía recombinante como antígeno.^10,11

Las muestras de sueros con niveles de anticuerpos a otras enfermedades infecciosas o autoinmunes, así como de donantes de sangre, embarazadas y ancianos, fueron estudiadas para investigar la posibilidad de reacciones cruzadas no específicas con sífilis al hacer uso de las pruebas no treponémicas, debido a la activación policlonal de la respuesta de anticuerpos. Se detectaron 15 falsos positivos entre las muestras de los pacientes con leptospirosis humana, hepatitis, tuberculosis, diabetes mellitus, fiebre reumática, embarazadas, ancianos y donantes de sangre. Todos ellos tenían resultados reactivos en las pruebas serológicas no treponémicas en diluciones inferiores a 1:8, lo que se corresponde con lo consignado en la bibliografía. ^2,15,16

Al analizar los resultados de estas mismas muestras de sueros por el ELISA anti-TmpA y compararlos con los del resto de las técnicas serológicas empleadas, se encontró que 7 sueros (2.4%) solo tenían resultado positivo por ELISA, y pertenecían a pacientes con mononucleosis infecciosa, hepatitis y HIV/sida, así como donantes de sangre y un anciano; estos resultados pueden ser considerados como falsos positivos dadas las características del antígeno empleado, el cual fue obtenido por vía recombinante en E. coli (enterobacteria de amplia distribución geográfica) y con un nivel de pureza de 90%, por lo que podrían quedar algunos epitopes no específicos.

La ocurrencia de falsos positivos por HATP, como prueba específica, en población saludable se ha reportado en menos de 1% de ella. En otros casos los resultados serológicos han sido difíciles de interpretar porque la sífilis puede coexistir con otras infecciones, y por ende no tratarse de reacciones falsas positivas. ²

Los valores predictivos para una prueba positiva y una negativa fueron 86.58% y 97.54%, respectivamente (tabla 1). Son aceptables para el ensayo evaluado, lo que es de gran importancia para estudios de factibilidad económica, ya que según esos valores la prueba representa una alternativa útil para la confirmación serológica de la sífilis.

Los valores de sensibilidad de este sistema ELISA fueron determinados según el estadio clínico de la enfermedad, obteniéndose un valor de 92.10% para sífilis primaria, 100% para sífilis secundaria, 85.75% para sífilis latente reciente y 100% para sífilis congénita.

A pesar de que en este trabajo no fueron incluidos sueros de pacientes con infección latente tardía para la evaluación del sistema, se conoce que entre los principales anticuerpos detectados en esta etapa no se encuentran aquellos contra la proteína TmpA; ⁴ quizá pueda ser ésta la causa de que la sensibilidad del ensayo es inferior al detectar la infección latente reciente, pues ya este tipo de anticuerpos ha ido desapareciendo de la sangre de los pacientes.

De forma general, los valores obtenidos se encuentran dentro de los rangos establecidos para sensibilidades de otros métodos treponémicos como FTA-ABS, HATP y FTA-ABS de doble tinción, sobre los cuales se informan en sífilis primaria valores entre 70%-100%, 69%-90% y 69%-90%, respectivamente, para sífilis secundaria 100% y en sífilis latente entre 97%-100% para las tres pruebas. Igualmente ocurre con la especificidad, que en los informes alcanza valores entre 94%-100%. Estos resultados provienen de estudios del Centro para el Control de Enfermedades de Atlanta (CDC). ²

En el grupo de pacientes estudiados con sífilis primaria se detectó uno que se encontraba aún en la etapa preserológica, pues teniendo un EDCO positivo a partir de la linfa de la lesión examinada, todas las pruebas serológicas fueron negativas, lo que demuestra que los métodos serológicos carecen de sensibilidad para detectar la sífilis primaria temprana.

También se encontró un paciente con EDCO y VDRL/RPR positivo pero donde la HATP y el ELISA evaluado eran negativos, lo que indicaba que estas pruebas comienzan a detectar anticuerpos específicos más tardíamente que las pruebas no treponémicas; y en otro paciente se pudo observar, incluso, que el ELISA se positivisó después que la HATP.

Ijsselmuiden y col., al evaluar un ELISA utilizando la proteína TmpA purificada a partir de E. coli, encontraron una sensibilidad de 76% para sífilis primaria, 100% para sífilis secundaria y 98% para sífilis latente reciente,¹⁰ discrepando los resultados para sífilis primaria y latente reciente con los obtenidos en este trabajo.

El objetivo de cualquier método de laboratorio es proporcionar resultados confiables y altamente repetibles. En los ensayos ELISA se introducen múltiples pasos y oportunidades de error, y la complejidad de la reacción antígeno-anticuerpo y la reacción enzima-sustrato contribuyen a la variabilidad.

En la tabla 2 se detallan los resultados del estudio de la precisión del ensayo ELISA anti-TmpA con las muestras estudiadas.

Como se puede observar, los coeficientes de variación entre los resultados de los sueros al realizar los ensayos de precisión fueron inferiores al 10%, lo que demuestra buena repetibilidad y reproducibilidad de las pruebas.

Los resultados obtenidos indican que el ensayo ELISA anti-TmpA recombinante es sensible, específico, preciso, de fácil aplicación como técnica automatizada y útil en la confirmación de gran número de muestras de individuos con serologías no treponémicas reactivas.