THE APPLICATION OF DNA MICROARRAY TECHNOLOGY TO THE INVESTIGATION OF ENDOMETRIOSIS

Abstract
Endometriosis is a widespread and debilitating disease. Despite intense research, a variety of questions remain unanswered. For example, why do some women get endometriosis and not others Can we develop a noninvasive method for diagnosis of endometriosis Can we develop medical treatments for endometriosis that relieve pain, restore fertility, and cause fewer adverse reactions Can the similarities and differences in the invasive properties of the ectopic endometrium and cancer provide insight into both of these diseases For each of these questions, a more thorough fundamental understanding of how eutopic endometrial cells function and communicate, and how ectopic endometrial cells differ from eutopic endometrial cells, will build the foundation to provide answers. A global genome-screening technology such as the DNA microarray is an excellent tool for examining the questions posed by endometriosis. DNA microarray analysis is beginning to be applied to the questions of endometriosis. This technology, along with other technologies such as proteomics and data mining, holds promise to advance diagnosis and treatment of this disease.

Key words
Endometriosis, microarray, endometrium, vimentin

Artículo completo
Introducción
La endometriosis es una enfermedad muy difundida y debilitante de etiología desconocida y cuyo único diagnóstico establecido es a través de la exploración quirúrgica. Más aun, muchos de los tratamientos médicos causan efectos colaterales mal tolerados, incluyendo menopausia química. La pérdida del apoyo esteroideo al final del ciclo ovárico inicia una cascada de eventos que concluye con la descamación del endometrio. Estos eventos incluyen el vasoespasmo de las arterias espiraladas del endometrio, isquemia, invasión del endometrio por glóbulos blancos, secreción de citoquinas, apoptosis y menstruación. Se cree que en la mayoría de las mujeres hay flujo retrógrado de restos menstruales; normalmente, las células endometriales que ingresan a la cavidad endometrial mueren y son fagocitadas. En 3% a 10% de las mujeres¹ estas células sobreviven a la hipoxia, a la hipercapnia, a la pérdida de nutrientes y a las señales apoptóticas a las que están expuestos los fragmentos endometriales de los restos menstruales para finalmente implantarse, generar aporte sanguíneo y crecer por fuera del útero. Este tejido desplazado se implanta en cualquier lugar de la cavidad abdominal y ocasionalmente en otros sitios, como pequeños implantes, nódulos más gruesos o quistes, llamados endometriomas. El endometrio ectópico puede crear grandes adherencias cicatrizales que pueden unirse entre sí y cubrir los órganos abdominales (por ejemplo, ovarios, trompas de Falopio).
La endometriosis afecta a millones de mujeres en el mundo. En su forma leve, puede pasar inadvertida. La endometriosis más grave se asocia con intenso dolor pelviano y molestias abdominales, menstruaciones dolorosas e infertilidad.^1-5 Los síntomas de endometriosis son imitados por otras enfermedades de órganos de la cavidad abdominal como la enfermedad intestinal inflamatoria. Por lo tanto, el único diagnóstico preciso disponible actualmente es la exploración quirúrgica. Hoy la endometriosis se trata con medicación destinada a inhibir el crecimiento del tejido endometrial o por medio de intervenciones quirúrgicas para remover el tejido anormal. Ambas terapias tienen sus limitaciones. La medicación no siempre es efectiva y puede tener efectos colaterales significativos, como la menopausia química, lo que hace que las pacientes no cumplan con el tratamiento. La cirugía puede aliviar los síntomas temporariamente, pero con frecuencia el tejido patológico vuelve a aparecer. En ciertos casos, la enfermedad puede ser tan grave que se requiere la remoción quirúrgica del útero y los ovarios.
La endometriosis se asocia a infertilidad.^1-5 Una de las hipótesis prevalecientes respecto de la relación entre endometriosis e infertilidad es que el endometrio de una mujer con endometriosis es fundamentalmente diferente del endometrio de una mujer sin endometriosis. Esta hipótesis se apoya, en parte, en que las lesiones endometriales ectópicas de una paciente pueden tener aspectos diferentes, unas aparentan ser más antiguas y otras más recientes. La diferencia en el aspecto sugiere que pueden haber ocurrido muchos eventos de siembra. Una diferencia fundamental en el endometrio podría explicar la capacidad de este tejido –en una paciente con endometriosis– de sobrevivir al estrés de la menstruación para implantarse en el abdomen y también podría explicar por qué el endometrio no es receptivo a la implantación en pacientes con endometriosis. Sin embargo, un metaanálisis del efecto de la endometriosis en la fertilización in vitro sugirió que esta enfermedad afecta el desarrollo del oocito y del embrión, así como la receptividad del endometrio.⁵ Por lo tanto, parece ser que una diferencia en el endometrio no es la única explicación de la infertilidad en mujeres con endometriosis. Más aun, si el endometrio de una mujer con endometriosis es fundamentalmente diferente del de una mujer sin la enfermedad, ¿esta diferencia se debe a la enfermedad o es preexistente, y por lo tanto causal Alternativamente, puede que sólo sea necesario que el endometrio sea "diferente" (es decir, capaz de sobrevivir a la hipoxia, hipercapnia, pérdida de nutrientes y señales apoptóticas de los restos menstruales) durante una menstruación para lograr la siembra del endometrio ectópico; las nuevas lesiones pueden originarse de las lesiones endometriósicas originales y no del endometrio uterino.
Varios estudios examinaron la expresión de genes, de a un gen por vez, en la endometriosis. Por ejemplo, se informó que en las células endometriales hay anomalías en la regulación de la glutatión peroxidasa,⁶ interleuquina-6,^7,8 una proteína tipo haptoglobina,⁹ factor de crecimiento endotelial vascular,⁸ metaloproteinasa de matriz-1,¹⁰ superóxido dismutasa¹¹ y glucodelina.^12-14 En conjunto, estos estudios apoyan la hipótesis de que la endometriosis se produce por expresión o regulación anormal de ciertos genes clave.
Preguntas fundamentales acerca de la endometriosis
Muchas cuestiones acerca de la endometriosis siguen sin respuesta. Estas preguntas incluyen: ¿Por qué algunas mujeres tienen endometriosis y otras no, especialmente si es causada por menstruación retrógrada y esto ocurre en la mayoría de las mujeres ¿Por qué la endometriosis se asocia con infertilidad ¿Es posible elaborar un método de diagnóstico no invasivo de la endometriosis ¿Es posible elaborar tratamientos médicos para la endometriosis, que alivien el dolor, restauren la fertilidad y causen menos reacciones adversas ¿Es posible elaborar un método para predecir quién tendrá endometriosis, y un tratamiento para prevenirla ¿Las diferencias y similitudes en las propiedades invasivas del endometrio ectópico y del cáncer pueden ayudar a comprender ambos procesos ¿Por qué las células endometriales no tienen un comportamiento invasivo dentro del útero pero sí fuera de él (es decir, por qué las células endometriales no invaden hacia la capa de músculo liso uterino) Para reponder acabadamente cada una de estas preguntas es fundamental la comprensión completa de cómo funcionan y se comunican las células endometriales, y de cómo las células endometriales ectópicas se diferencian de las eutópicas.
Herramientas de evaluación global del genoma
Las relativamente nuevas herramientas de la genómica, principalmente el análisis de la expresión de genes por micromatrices de ADN, se han empezado a aplicar a la función endometrial y a las cuestiones fundamentales de la endometriosis.^15-20 La micromatriz de ADN es una herrmienta que permite el examen global de la expresión de genes.²¹ En una micromatriz de ADN, las secuencias de muchos genes se ordenan en una matriz, como una placa de microscopio o una membrana. Actualmente hay micromatices disponibles comercialmente, en las que se ordenan 10 000 a 20 000 genes, e incluso algunos pueden contener todo el genoma humano. También hay matrices que contienen grupos especializados de genes, como por ejemplo citoquinas y sus receptores, o los genes de las proteínas de matriz extracelular.
Para realizar análisis de expresión de genes por micromatrices de ADN se extrae el ARN del tejido a estudiar.²¹ El ARN mensajero (ARNm) se transcribe en forma inversa a una cadena de ADN complementario (ADNc). Durante esta reacción es posible incorporar una marca fluorescente o radiactiva al ADNc o es posible sintetizar la segunda cadena de ADNc, a partir de la cual obtener ARN complementario (ARNc), con el marcador incorporado durante la reacción de síntesis del ARNc. Este último método es el que generalmente se prefiere porque el ARNc forma una unión más estrecha con el ADN que el ADNc. El ARNc (o ADNc) marcado es incubado con la micromatriz para permitir la hibridación entre las moléculas marcadas y las secuencias de ADN en la matriz. Si determinado gen se expresa en una célula, su ARNm estará presente en el extracto. Cuanto mayor sea la expresión del gen, más ARNm de dicho gen estrá presente y más ARNc (o ADNc) se hibridará con la secuencia del gen en la matriz. Luego de la hibridación se examina la micromatriz y se analiza la información a través de una computadora, para obtener la lectura de los genes expresados en el tejido y para determinar diferencias entre la expresión del gen en el control y en el tejido tratado o enfermo. Creemos que una tecnología de evaluación global del genoma, como la micromatriz de ADN, es una herramienta excelente para examinar las preguntas que surgen de una enfermedad como la endometriosis, en la que la etiología es desconocida y quedan tantas preguntas sin responder.
Análisis de la expresión de genes por micromatriz de ADN en la endometriosis
En nuestro estudio previo,¹⁵ usamos micromatrices de ADN para comparar la expresión de genes en el endometrio eutópico versus el ectópico en mujeres con endometriosis. Para participar en este estudio se seleccionaron pacientes a las que se les había programado cirugía para endometriosis (n = 3); se obtuvo su consentimiento informado. Se obtuvo aprobación para el estudio por parte del Tribunal de Revisión Institucional de Investigación en Seres Humanos de la Escuela de Medicina de la Universidad de Dakota del Sur. El tejido endometrial ectópico se obtuvo de endometriomas ováricos en los tres casos. El tejido endometrial eutópico se obtuvo del útero de las mismas pacientes al momento de la laparoscopia, realizando histeroscopia seguida de dilatación y legrado.
Se extrajo todo el ARN de las muestras de endometriosis, se lo purificó y cuantificó. Se adquirieron Named Human Genes GeneFilters con 4 133 genes, de ResGen (Huntsville, AL, EE.UU.). La preparación de los marcadores, hibridación, imágenes y análisis se realizaron según las instrucciones de la compañía. Cuando se comparó la expresión de genes en el endometrio uterino con la del tejido endometrial ectópico, se observó que 8 genes se expresaban en forma diferente. Como fuera publicado por otros respecto de la información de micromatrices,²² observamos conformidad en la dirección pero no en la intensidad de la respuesta. Las expresiones relativas de los genes expresados diferencialmente se muestran en la tabla 1.



Tres de los genes regulados positivamente, vimentina, beta-actina y alfa-2 actina, codifican elementos cioesqueléticos. La vimentina es un filamento intermedio que se entrecruza con otras proteínas^23,24 y es sintetizada a intervalos discontinuos durante el desarrollo²⁵ en las células mesenquimáticas. La beta-actina es un componente no muscular del citoesqueleto. Con frecuencia se la ha usado como gen "doméstico" de referencia para la normalización de la expresión de otros genes, si bien la evidencia reciente que sugiere que la expresión de beta-actina puede ser estimulada por estrógenos pone en duda la validez de ese uso.^26,27 El endometrio ectópico es un tejido invasivo; la anexión y el movimiento celular necesarios para la invasión tisular requieren reestructuraciones del citoesqueleto. La naturaleza invasora de los implantes endometriales puede explicar la regulación positiva de la vimentina, beta-actina y alfa-2 actina. Otro de los genes regulados positivamente en el endometrio ectópico fue la proteína ribosómica 40S S23. Las proteínas ribosómicas son generalmente consideradas genes domésticos; sin embargo, se informó que su síntesis aumenta en respuesta a los estrógenos.^28,29 Como el principal mecanismo de acción de los estrógenos es aumentar la expresión de genes, y como los genes deben ser traducidos en proteínas en los ribosomas, es lógico especular que los estrógenos estimulan la expresión de proteínas ribosómicas para permitir la síntesis de otras proteínas estimuladas por estrógenos.
La disfunción del sistema inmune ha sido implicada en la etiología de la endometriosis.^30,31 La regulación positiva de genes del sistema inmune apoya la noción de que el sistema inmune tiene una función en la etiología de la endometriosis. En los implantes endometriales están presentes células B, pero no está claro si el número de células B es mayor en el endometrio ectópico que en el eutópico.^32,33 Como algunos informes indican un incremento en las células B, no sorprende encontrar regulación positiva de la expresión de la cadena liviana lambda en nuestras muestras de endometrio. La regulación positiva del gen de la línea germinal Ig cadena H región G-E-A gamma 2 es más problemática. Este gen sufre reestructuración, transcripción selectiva y procesamiento de ARN, que produce síntesis de cadenas pesadas Ig; la transcripción final de ARN incluye sólo una pequeña porción del gen de la línea germinal de cadenas pesadas.³⁴ Por lo tanto, la expresión del gen de la línea germinal Ig cadena H región G-E-A gamma 2 en los implantes endometriales sugiere expresión aberrante de genes, ya que ninguna célula debería expresar este gen en sus líneas germinales no modificadas.
La información de nuestro estudio demostró que la expresión de genes en el endometrio ectópico difiere del eutópico e identificó los genes de interés específico en estudios de seguimiento. En contraste con nuestro trabajo, Kao y col. usaron la tencnología de micromatrices de ADN para examinar la expresión diferencial de genes en el endometrio eutópico en mujeres con endometriosis, de la del endometrio eutópico en mujeres sin endometriosis.¹⁷ Por lo tanto, sus estudios examinaron la hipótesis de que el endometrio de una mujer con endometriosis es fundamentalmente diferente del endometrio de una mujer sin endometriosis, y que esta diferencia tiene una relación causal con la infertilidad asociada a la endometriosis. Kao y col.¹⁷ encontraron tres patrones de expresión genética de interés. Ocho genes que se demostró estaban aumentados durante la implantación en mujeres normales, se hallaban significativamente disminuidos en la endometriosis. Estos 8 genes eran IL-15, proteína rica en prolina, B61, Dickkopf-1, glucodelina, GlcNAc6ST, proteína G0S2 y fosforilasa de nucleósidos purinas. Los genes que estaban incrementados en la endometriosis y disminuidos en el estado normal incluyeron semaforina E, proteína neuronal relacionada con olfactomedina localizada en el retículo endoplásmico y proteína fosfotirosina símil Sam-68 alfa (SALP). El tercer patrón incluyó un gen, pentraxina neuronal II, con mayor regulación negativa que la disminución normal que se produce en el período de implantación. Concluyeron que la expresión de genes es diferente durante el período de implantación en las mujeres con endometriosis, respecto de las que no tienen endometriosis. Sin embargo, una cuestión que no pudo ser resuelta sobre la base de ese estudio fue si la expresión de genes era anormal como resultado de la endometriosis (debido a que el entorno estaba alterado por los implantes ectópicos, es decir debido a inflamación) o si el endometrio era realmente diferente antes de que tuviera lugar la endometriosis (y, por lo tanto, causal).
Prospección informática de datos (data mining)
Este es un proceso que combina toda la información acerca de micromatrices de ADN acumulado en bases de datos en línea y bibliográficas, con el fin de descubrir relaciones que no eran evidentes en el estudio inicial. También se puede usar para incrementar el poder de una observación. Por ejemplo, los estudios de genes únicos indicaron que en la endometriosis hay diferencias en la expresión de genes que codifican para proteínas de matriz extracelular y proteínas de adhesión celular. Al extraer la información de expresión basal y diferencial de los genes de matriz extracelular y de adhesión de las micromatrices de endometriosis aumentará el poder de las observaciones individuales en un experimento determinado y se identificarán nuevas relaciones en la expresión de esas grandes familias de genes, no aparentes en estudios individuales.
Perspectivas
Apenas hemos empezado a indagar en la riqueza de información que el análisis de la expresión de genes por micromatrices de ADN es capaz de brindar respecto de la endometriosis. Esta tecnología proporcionará nuevas bases para responder las preguntas acerca de la endometriosis formuladas en este artículo; es decir la información obtenida a partir de las micromatrices de ADN no necesariamente responde estos interrogantes. En cambio, da información para formar la base a partir de la cual se plantearán nuevas hipótesis respecto de estas cuestiones.
Otras nuevas tecnologías contribuirán a encontrar las respuestas a esas preguntas. Por ejemplo, los estudios proteómicos –el examen global de las proteínas expresadas por un determinado tipo celular en condiciones específicas, así como las midificaciones postraslacionales de dichas proteínas–^35,36 también pueden ser muy importantes en la comprensión de la endometriosis. Si bien el cambio en la expresión del ARNm de un determinado gen sugiere que la proteína afín se expresará, no todos los ARNm son traducidos a proteínas, por lo que es importante confirmar que la expresión diferencial de genes se traduce en expresión diferencial de proteínas. Un segundo punto importante acerca de las proteínas es que las modificaciones postraslacionales pueden aumentar o disminuir la actividad de una proteína; las proteínas mismas deben ser estudiadas para determinar los cambios.
La tecnología de micromatrices de ADN sin lugar a dudas brinda gran cantidad de información nueva acerca de la expresión de genes en la endometriosis que producirá avances en el diagnóstico y el tratamiento de la enfermedad. Sin embargo, aún queda por realizar la mayor parte del trabajo. Son necesarias más micromatrices de ADN que cubran mayor porcentaje del genoma humano en poblaciones más grandes de pacientes. Además, la información de las micromatrices debe ser confirmada por otras tecnologías como la reacción en cadena de polimerasa (PCR) de tiempo real, Northern blot y Western blot y se deben determinar las funciones de los genes desconocidos.
Los autores no manifiestan conflictos.

Bibliografía del artículo

1. Speroff L, Glass RH, Kase NG, eds. Endometriosis. In: Clinical Gynecologic Endocrinology and Infertility, Sixth Edition. Baltimore: Lippincott, Williams, and Wilkins, 1999:1057-1073.
2. Schenken RS. Endometriosis. In: Scott JR, Di Sain PJ, Hammond CB, Spellacy WN, eds. Danforth's Obstetrics and Gynecology, Eighth Edition. Baltimore: Lippincott, Williams, and Wilkin, 1999;669-675.
3. Barbieri RL, Missmer S. Endometriosis and infertility: A cause-effect relationship Annals NY Acad Sci 2002;955:23-33.
4. Guidice LC, Telles TL, Lobo S, Kao L. The molecular basis for implantation failure in endometriosis: On the road to discovery. Annals NY Acad Sci 2002;955:252-264.
5. Barnhart K, Dunsmoor-Su R, Coutifaris C. Effect of endometriosis on in vitro fertilization. Fertility and Sterility 2002;77:1148-1155.
6. Ota H, Igarashi S, Kato N, Tanaka T. Aberrant expression of glutathione peroxidase in eutopic and ectopic endometrium in endometriosis and adenomyosis. Fertil Steril 2000;74:313-318.
7. Tsudo T, Harada T, Iwabe T, Tanikawa M, Nagano Y, Ito M, et al. Altered gene expression and secretion of interleukin-6 in stromal cells derived from endometriotic tissues. Fertil Steril 2000;73:205-211.
8. Mahnke JL, Dawood MY, Huang J-C. Vascular endothelial growth factor and interleukin-6 in peritoneal fluid of women with endometriosis. Fertil Steril 2000;73:166-170.
9. Sharpe-Timms K, Piva M, Ricke EA, Surewicz K, Zhang YL, Zimmer RL. Endometriotic lesions synthesize and secrete a haptoglobin-like protein. Biol Reprod 1998;58:988-994.
10. Kokorine I, Eeckhout Y, Nisolle M, Courtoy PJ, Donnez J, Marbaix E. Expression of interstitial collagenase (matrix metalloproteinase-1) is related to the activity of human endometriotic lesions. Fertil Steril 1997;68:246-251.
11. Ota H, Igarashi S, Hatazawa J, Tanaka T. Immunohistochemical assessment of superoxide dismutase expression in the endometrium in endometriosis and adenomyosis. Fertil Steril 1999;72:129-134.
12. Sharpe KL, Zimmer RL, Griffin WT, Penney LL. Polypeptides synthesized and released by human endometriosis differ from those of the uterine endometrium in cell and tissue explant culture. Fertil Steril 1993;60:839-851.
13. Vaisse C, Atger M, Potier B, Milgrom E. Human placental protein 14 gene: sequence and characterization of a short duplication. DNA Cell Biol 1990;9:401-413.
14. Mueller MD, Vigne J-L, Vaisse C, Taylor RN. Glycodelin: a pane in the implantation window. Semin Reprod Med 2000;18:289-298.
15. Eyster KM, Boles AL, Brannian JD, Hansen KA. DNA microarray analysis of gene expression markers of endometriosis. Fertility and Sterility 2002;77:38-42.
16. Kao LC, Tulac S, Lobo S, Imani B, Yang JP, Germeyer A, Osteen K, Taylor RN, Lessey BA, Giudice LC. Global gene profiling in human endometrium during the window of implantation. Endocrinology 2002;143:2119-2138.
17. Kao LC, Germeyer A, Tulac S, Lobo S, Yang JP, Taylor RN, Osteen K, Lessey BA, Giudice LC. Expression profiling of endometrium from women with endometriosis reveals candidate genes for disease-based implantation failure and infertility. Endocrinology 2003;144:2870-2881.
18. Carson DD, Lagow E, Thathiah A, Al-Shami R, Farach-Carson MC, Vernon M, Yuan L, Fritz MA, Lessey BA. Changes in gene expression during the early to mid-luteal (receptive phase) transition in human endometrium detected by high-density microarray screening. Mol Hum Reprod 2002;8:871-879.
19. Borthwick JM, Charnock-Jones DS, Tom BD, Hull ML, Teirney R, Phillips SC, Smith SK. Determination of the transcript profile of human endometrium. Mol Hum Reprod 2003;9:19-33.
20. Taylor RN, Lundeen SG, Guidice LC. Emerging role of genomics in endometriosis research. Fertility and Sterility 2002;78:694-698.
21. Eyster KM, Lindahl R. Molecular medicine: A primer for clinicians. Part XII: DNA microarrays and their application to clinical medicine. South Dakota Journal of Medicine, 2001;2:57-61.
22. Popovici RM, Kao L-C, Giudice LC. Discovery of new inducible genes in in vitro decidualized human endometrial stromal cells using microarray technology. Endocrinology 2000;141:3510-3513.
23. Herrmann H, Aebi U. Intermediate filaments and their associates: multi-talented structural elements specifying cytoarchitecture and cytodynamics. Curr Opinion Cell Biol 2000;12:79-90.
24. Correia I, Chu D, Chou Y-H, Goldman RD, Matsudaira P. Integrating the actin and vimentin cytoskeletons: adhesion-dependent formation of fimbrin-vimentin complexes in macrophages. J Cell Biol 1999;146:831-842.
25. Klymkowsky MW. Intermediate filaments: new proteins, some answers, more questions. Curr Opin Cell Biol 1995;7:46-54.
26. Cicatiello L, Ambrosino C, Coletta B, Scalona M, Sica V, Breesciani F,et al. Transcriptional activation of jun and actin genes by estrogen during mitogenic stimulation of rat uterine cells. J Steroid Biochem Molec Biol 1992;41:523-528.
27. Weisinger G, Gavish M, Mazurika C, Zinder O. Transcription of actin, cyclophilin and glyceraldehyde phosphate dehydrogenase genes: tissue- and treatment-specificity. Biochim Biophys Acta 1999;1446:225-232.
28. Knowles JT. Oestriol-stimulated synthesis of ribonucleic acid in the uterus of the immature rat. Biochem J 1978;170:181-183.
29. Muller RE, Knowles JT. The synthesis of ribosomal RNA and ribosomal protein and their incorporation into ribosomes in the uterus of the oestrogen-stimulated immature rat. FEBS Lett 1984;174:253-257.
30. Lebovic DI, Mueller MD, Taylor RN. Immunobiology of endometriosis. Fertil Steril 2001;75:1-10.
31. Nothnick WB. Treating endometriosis as an autoimmune disease. Fertil Steril 2001;76:223-231.
32. Oosterlynck DJ. Immunohistochemical characterization of leukocyte subpopulations in endometriotic lesions. Arch Gynecol Obstet 1993;253:1977-206.
33. Nomiyama M, Hachisuga T, Sou H, Nakamura K, Matsumoto Y, Iwasaka T, et al. Local immune response in infertile patients with minimal endometriosis. Gynecol Obstet Invest 1997;44:32-37.
34. Goldsby RA, Kindt TJ, Osborne BA. Organization and expression of immunoglobulin genes. In: Kuby Immunology, Fourth edition. New York: WH Freeman and Company, 2000:115-128.
35. Bateman RH, Carruthers R, Hoyes JB, Jones C, Langridge JI, Millar A, Vissers JPC. A novel precursor ion discovery method on a hybrid quadrupole orthogonal acceleration time-of-flight (Q-Tof) mass spectrometer for studying protein phosphorylation. J Am Soc Mass Spec 2002;13:792-803.
36. Petricoin EF III, Ardekani AM, Hitt BA, Levine PJ, Fusaro VA, Steinberg SM, Mills GB, Simone C, Fishman DA, Kohn EC, Liotta LA. Use of proteomic patterns in serum to identify ovarian cancer. Lancet 2002;359:572-577.