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IntroducciónLos virus pueden afectar el sistema nervioso central (SNC) en forma de enfermedades virales agudas. La meningoencefalitis viral (MEV) es un síndrome multietiológico. Virus que difieren ampliamente en su morfología, composición química y replicación pueden producir iguales cuadros clínicos, con lesiones histopatológicas idénticas en el SNC.11 Los enterovirus, pertenecientes a la familia Picornaviridae, son los agentes etiológicos más comunes de las MEV. Los enterovirus no polio que se reportan con mayor frecuencia como agentes productores de MEV son: Echovirus 4, 6, 9, 11, 16 y 30, Coxsackievirus A7, A9, B2, B3, B4 y B5 (4, 24, 26, 27).Los primeros estudios sobre la etiología de las meningoencefalitis no bacterianas en Cuba fueron realizados por Pascual y cols. en 1969.21 Posteriormente, Más y cols.15, en un estudio de 14 años, demostraron la importante participación de los enterovirus en las MEV. Los brotes epidémicos suceden en nuestro país con una periodicidad aproximada de 4 años.5,15 Teniendo en cuenta la frecuencia de las MEV en nuestro medio y en el mundo y conociendo que constituyen un problema de salud importante, sobre todo en la edad pediátrica, nos dimos a la tarea de realizar un estudio de la etiología de este síndrome.4,15,21,28En el presente trabajo se muestran los aislamientos virales obtenidos en el Laboratorio de Enterovirus del IPK, en muestras de pacientes diagnosticados clínicamente con MEV en el período 1990 - 1998, brindando datos que permiten un mejor conocimiento de la participación de los enterovirus como agentes etiológicos de las MEV en nuestro medio.Materiales y Métodos1. Muestras.En el período de 1990-98 fueron recibidas, en el Laboratorio de Enterovirus del IPK, 731 muestras de heces (H) y 134 líquidos cefalorraquídeos (LCR)2. Procesamiento de las muestras.17Las muestras fueron tomadas en condiciones estériles y trasladadas congeladas o en frío al laboratorio, conservándose a -20°C hasta el momento de su tratamiento. De las H se realizó una suspensión al 10% en solución tamponada de fosfato (STF), se centrifugó a 13000 rpm 10 min, el sobrenadante fue tratado con cloroformo, se centrifugó en las mismas condiciones anteriores y se le añadió penicilina y estreptomicina en concentración final de 1000 U y 1000 µl respectivamente. Los LCR fueron inoculados sin tratamiento previo.3. Aislamiento e identificación viral.Las H y LCR se inocularon por duplicado en 2 sistemas celulares susceptibles:_ Células de línea de riñón de mono verde africano adulto normal Cercopithecus aetiops (Vero).2_ Células diploides de fibroblastos de pulmón humano (PHuE-1).6 Los aislamientos con efecto citopatogénico (ECP) de enterovirus se titularon e identificaron mediante la prueba de neutralización del ECP en micrométodo (NT), con pools de sueros hiperinmunes de Lim Benyesh-Melnick (LBM).18ResultadosLa positividad de las muestras recibidas para aislamiento (H y LCR) se observa en el Cuadro 1. (INSERTAR CUADRO 1)Se investigaron 865 muestras: 731 H y 134 LCR, de las cuales fueron positivas a enterovirus 299 H (40.9%) y sólo 9 LCR (6.7%) y, de éstos, 3 fueron positivos también en las correspondientes H. En total se realizaron 308 aislamientos que representan un 35.6%. El año en que más aislamientos se obtuvo fue 1994. Se encontró un mayor porcentaje de aislamientos en H que en LCR, con lo que se comprueba que las H constituyen la muestra de elección con fines de aislamiento. El análisis estadístico de estos resultados se realizó por la prueba de Kolmogorov-Smirnov y arrojó que existe diferencia significativa entre H y LCR (p < 0.01) para los diferentes años estudiados.El Cuadro 2 refleja la positividad de las muestras de H y LCR en cada sistema celular estudiado. (INSERTAR CUADRO 2)El PHuE-1 resultó ser el sistema más sensible para los enterovirus en los años estudiados ya que se obtuvo mayor número de aislamientos en él. De los 9 aislamientos obtenidos en LCR, 8 fueron en PHuE-1.El análisis estadístico de estos resultados se realizó por la prueba de Diferencias de Proporciones y reflejó diferencias significativas entre los sistemas celulares estudiados, para una p < 0.01.En el Cuadro 3 se exponen las tasas de incidencia de casos de MEV en Cuba, el total de muestras investigadas, el porcentaje total de aislamientos y de los enterovirus predominantes, además de otros enterovirus que circularon cada año. En 1990 y 1991, aunque hubo predominio del Coxsackie A9, sólo hubo un ligero incremento de las tasas. En 1992 y 1993 las tasas permanecen bajas al igual que el porcentaje de aislamientos (1.90% y 8.51% respectivamente). Un incremento brusco de la tasa se produce en 1994 (85.62) y el porcentaje total de aislamientos fue de 37.25%, siendo el Echovirus 30 el enterovirus predominante con el 42.10% del total de aislamientos. En 1995 se mantienen las tasas elevadas en un 70.63, siendo el Coxsackievirus B5 el enterovirus predominante con 81.81% del total de aislamientos. Este agente continúa siendo predominante en 1996 junto con el Echovirus 9. En los siguientes años, 1997 y 1998, no hubo predominio de ningún enterovirus y las tasas fueron las más bajas encontradas en los 9 años estudiados. (INSERTAR CUADRO 3)DiscusiónEn un estudio realizado en nuestro país desde 1972 hasta 1985 en 1284 casos de MEV, se encontró que el mayor número de aislamientos de enterovirus fue en H (56.9%) y en LCR solo se obtuvieron 7.1%. De las 3 líneas celulares estudiadas, se obtuvo mayor aislamiento en cultivo primario de fibroblastos de embrión humano (FEH).15 Estos resultados coinciden con los encontrados por nosotros. Posteriormente en el período de 1986-89 se estudiaron 70 casos de MEV, obteniéndose 12 (17.1%) aislamientos de enterovirus (10 de H y 2 de LCR), de los cuales 11 fueron en FEH (Dr. Pedro Más Lago, Laboratorio de Enterovirus, IPK, Ciudad de la Habana, comunicación personal, 1996).Una posible explicación de la mayor positividad en células PHuE-1, la constituye el hecho de que el Coxsackievirus A9 predominó en 3 de los 6 años estudiados y las células anteriormente mencionadas constituyen un sistema muy sensible para este virus. El cambio de la situación epidemiológica podría hacer variar este patrón de susceptibilidad, ya que hay enterovirus que tienen más afinidad por uno u otro sistema celular (Dr. Pedro Más Lago, Laboratorio de Enterovirus, IPK, Ciudad de la Habana, comunicación personal, 1996).Estudios realizados en otros países coinciden con nuestros resultados. En 1987, Wildin30 en Estados Unidos, Kinnunen y cols.13 en Finlandia y Cobos y cols. en España en 19948 estudiaron casos aislados y brotes de MEV encontrando mayor número de aislamientos de enterovirus en H y en células de fibroblastos humanos. Estos resultados coinciden con los nuestros. En 1990-91 se produjo un brote epidémico de MEV en la población infantil de nuestro país, en el cual se identifica como agente etiológico el Coxsackie A9 que estuvo circulando estos 2 años. Ya en 1992 el Coxsackievirus A9 fue desplazado por el Coxsackie B4, pero en 1993 vuelve a circular. Esta circulación en «oleadas» es característica de los enterovirus.22,23 Al inicio de 1994 se observaron las primeras evidencias de positividad a Echovirus 30, dando lugar a un brote epidémico de MEV de gran difusión y su circulación se mantuvo hasta fines de año. En octubre de 1995 comenzó un incremento vertical y acelerado en la notificación de casos de MEV con respecto a similar período de 1994, detectándose que el agente causal fue el Coxsackievirus B5, el cual no circulaba desde 1976.5 En Cuba, en los períodos anteriormente estudiados, se encontró una epidemia de MEV causado por Coxsackievirus B5 (1976) y 2 epidemias de Echovirus 4 (1972 y 1985-86).15 El Coxsackievirus A9 y el Echovirus 30 no se habían reportado en Cuba como causantes de brotes epidémicos de MEV anteriormente y el Coxsackievirus B5 no circulaba desde 1976, por lo que había población susceptible acumulada para estos 3 virus. En el período estudiado de 1990-95 se produjeron 3 brotes epidémicos de MEV por: Coxsackievirus A9 (1990-91), Echovirus 30 (1994) y Coxsackievirus B5 (1995). Otros autores han reportado estos agentes como causantes de brotes de MEV en sus países.El Coxsackievirus A9 fue reportado en Estados Unidos3 y en Sudáfrica.16 El Echovirus 30 fue el principal agente causal de MEV en Estados Unidos entre 1965-70.3 También fue aislado en 1990 en un brote en niños menores de 1 año. En Australia, Canadá y países asiáticos fue reportado por varios autores.10,12,19,29,31,32 En cuanto al Coxackievirus B5, Moore20 plantea que fue el principal responsable de MEV en Estados Unidos entre 1970-79. Kinnunen y cols.13 reportan un brote de MEV por este agente en jóvenes.Los enterovirus son responsables del 80%-90% de las MEV, ya sean en casos esporádicos o epidemias, y se reportan con mayor frecuencia los Echovirus 4, 6, 9, 11, 16 y 30 y Coxsackievirus A7, A9, B2, B4 y B5, aunque casi todos los enterovirus pueden producir MEV en un momento dado.4,9,20,23,25,27 En nuestros 9 años de estudio de las MEV en Cuba podemos concluir que en el período de 1990-98 se encontraron 3 enterovirus causantes de brotes epidémicos; Coxsackievirus A9, Echovirus 30 y Coxsackievirus B5, correspondiendo en los casos de Echovirus 30 y Coxsackievirus B5 a elevadas tasas de incidencia. Además, se vincula por primera vez desde 1970 a los Coxsackievirus A9 y Echovirus 30 como productores de MEV en Cuba. En los períodos interepidémicos fueron relacionados con cuadros de MEV el Poliovirus vacunal tipo 2, los Echovirus 6, 7, 11, 13, 14, 15, 18, 21, 25, 27, 30, 31, 32, 33, los Coxsackievirus A9, A16, B1 y EVNP. Se detectó mayor número de aislamientos de enterovirus a partir de H y el sistema celular más sensible fue el PHuE-1. (C) SIIC, 1999 Lic. Marité Bello CorredorBibliografía1. Abreu I, Bello M, Más P, Arteaga E, Avalos I, Sarmiento L, Palomera R y Pérez L. «Estudio de un brote de meningoencefalitis viral. Comparación de 2 sistemas biológicos empleados para el aislamiento», Rev Cub Med Trop 50(1):71-74, 1998.2. American Type Culture Collection. Catalogue of cell lines and Hybridoma. 7ma ed pág. 48, 1992. 3. Assaad F y Cockburn WC. «Four-year study of WHO virus reports on enterovirus other than poliovirus», Bull Wld Hlth Org 46:329-336, 1972.4. Baum SG. «Acute viral meningitis». Parte V, en, Gorbach SL, Bartlett JG, Blacklow NR (eds.) Infections Disease. USA WB Saunders Co. pág. 1177-1186, 1992. 5. Bello M, Más P, Palomera R y González Z. «Brote de meningoencefalitis viral por Coxsackie B5, Cuba, 1995», Rev Cub Med Trop 49(1):69-70, 1997.6. 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Muestras recibidas para aislamiento y positividad en el período estudiado (1990-1998).Año Muestras H H(+) % LCR LCR(+) % Total(+) % estudiadas 1990 122 112 38 (32.9) 10 0 (0.0) 38 (31.1)1991 181 176 50 (28.4) 5 0 (0.0) 50 (27.6)1992 68 66 8 (12.1) 2 0 (0.0) 8 (11.7)1993 107 60 12 (20.0) 47 0 (0.0) 12 (11.2)1994 149 118 87 (73.7) 31 8 (25.8) 95 (63.7)1995 67 54 22 (40.7) 13 0 (0.0) 22 (32.8)1996 125 107 70 (65.4) 18 0 (0.0) 70 (56.0)1997 32 28 12 (42.8) 4 1 (25.0) 13 (40.6)1998 14 10 0 (0.0) 4 0 (0.0) 0 (0.0) Total 865 731 299 (40.9) 134 9 (6.7) 308 (35.6)Fuente: Laboratorio de Enterovirus, IPK.****************************************************** (CUADRO 2, A 6 COLUMNAS Y ALGUNAS SUBCOLUMNAS)(TITULO)Cuadro 2. Positividad de H y LCR de casos de MEV en 2 sistemascelulares (1990 - 1998).(COLUMNA 1)Muestra No. muestras H 731 LCR 134Total 865(COLUMNA 3, 2 SUBCOLUMNAS) Vero(+) (%)44 6.1 1 0.745 5.2(COLUMNA 4, 2 SUBCOLUMNAS)PHuE-1(+) (%)189 25.8 8 5.9197 22.7(COLUMNA 5, 2 SUBCOLUMNAS)Vero/PHuE-1(+) (%)66 9.0 0 0.066 7.6(COLUMNA 6)Total (%)299 (41.4) 9 (6.7)308 (35.6) (PIE DEL CUADRO, CUERPO MENOR)Fuente: Laboratorio de Enterovirus, IPK.**************************************************** (CUADRO 3, A 6 COLUMNAS)(TITULO)Cuadro 3. Tasas de casos de MEV y circulación de enterovirus según años (1990-1998).(COLUMNA 1)Año199019911992199319941995199619971998(COLUMNA 2)Tasa *36.0145.9836.6432.5085.6270.6390.1424.3721.71(COLUMNA 3)Total de muestras investigadas122181 68107149 67125 32 14 (COLUMNA 4)Total de aislamientos38 (31.1%)50 (27.6%) 8 (11.7%)12 (11.2%)95 (63.7%)22 (32.8%)70 (56.0%)13 (40.6%) 0 (0.0%)(COLUMNA 5)Enterovirus predominanteCA9 28 (73.6%)CA9 24 (48.0%)CB4 4 (50.0%)CA9 4 (33.3%)E30 40 (42.1%)CB5 18 (81.8%)CB5 12 (17.1%) E9 11 (15.7%)------(COLUMNA 6)Otros enterovirusCA16, CB1E6, 7, 11, 14, 25E15E15, 21, 25CA9, E6CB1, E30, 31, EVNPCA16, CB1, 6, E2, 3, 6, 7, 11, 15, 16, 18, 21, 25, 27, 33, EVNPPolio 2 vac., CA16, E7, 13, EVNP---(PIE DEL CUADRO, CUERPO MENOR)* Tasa de incidencia por 100.000 hab. CA:CoxsackievirusA. CB:CoxsackievirusB. E:Echovirus. EVNP: Enterovirus no polio.Fuente: Laboratorio de Enterovirus, IPK.************************************************************ 12