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Los conceptos actuales en neurobiología indican que el sistema nervioso entérico (SNE) podría desempeñar un papel en los trastornos inflamatorios crónicos (2-6). En un estudio previo (7), hemos demostrado que el patrón de la inervación intrínseca, y probablemente también el de la extrínseca, se halla alterado en la PC, lo cual lleva a un aumento en la expresión de neuropéptidos tales como la sustancia P y el polipéptido vasoactivo intestinal (PVI), los cuales son conocidos mediadores proinflamatorios y pronociceptivos. La creciente evidencia de cambios profundos en el patrón de inervación del páncreas humano bajo condiciones inflamatorias sugiere la participación de la plasticidad neuronal en el tejido pancreático inflamado. Recientemente, hemos aportado evidencias de activación neuronal por PC mediante el análisis de la proteína 43 asociada al crecimiento (GAP-43), un conocido marcador de plasticidad neuronal (8). Es sabido que la GAP-43 se halla involucrada en el desarrollo de los conos de crecimiento axónico y de las terminales presinápticas. Estudios más recientes revelaron que la expresión de la GAP-43 se halla modulada luego del daño de los nervios periféricos (9 - 11). En estos estudios experimentales, la GAP-43 fue reexpresada en altos niveles, reflejando la contribución neuronal a la inflamación y a la reparación poslesional. Utilizando inmunocitoquímica enzimática y de doble fluorescencia, pudimos demostrar un aumento en la reexpresión de GAP-43 en la mayoría de las fibras nerviosas pancreáticas y en las neuronas intrínsecas en el páncreas humano inflamado crónicamente, en comparación con una expresión generalmente baja de la GAP-43 en el páncreas humano normal.En nuestro último estudio correlacionamos los hallazgos inmunocitoquímicos con datos clínicos tales como antecedentes de dolor y nivel algésico preoperatorio. Además, correlacionamos el nivel del dolor con el grado de fibrosis pancreática y evaluamos si la infiltración inmune perineuronal correlaciona con el síndrome doloroso en la PC. Estos hallazgos han sido informados en detalle recientemente (12).PACIENTES.Se obtuvieron muestras de tejido pancreático normal de 12 donantes multiorgánicos previamente sanos (9 varones y 3 mujeres de entre 17 y 54 años, promedio 31 años). Además, se recolectaron en forma prospectiva muestras de tejido y datos clínico de 29 pacientes con PC (23 varones y 6 mujeres de entre 28 y 65 años, promedio 49 años). Veinticuatro de los 29 individuos padecían PC inducida por alcohol. Para evaluar la gravedad de la CP en estos pacientes, se obtuvieron datos de la historia de la enfermedad, los síntomas clínicos y los ensayos funcionales. Además, los pacientes respondieron un cuestionario en el que describían la intensidad de su dolor mediante una escala simple: "leve" (molestia abdominal infrecuente), "moderado" (molestia abdominal o dolor que no requierió analgésicos o no resultó incapacitante), "severo" (dolor controlado con analgésicos no narcóticos) o "insoportable" (dolor que requirió analgésicos narcóticos y resultó incapacitante). Todos estos datos fueron correlacionados con los hallazgos histopatológicos.METODOS.Se realizaron evaluaciones inmunocitoquímicas y morfológicas sobre secciones de tejido embebido en parafina. Para la inmunocitoquímica se utilizaron 2 anticuerpos: un anticuerpo policlonal contra el producto genético proteico 9.5 (PGP 9.5) y otro específico para la GAP-43. Se ha demostrado que el anticuerpo contra PGP 9.5 detecta todos los tejidos neuronales (marcador panneuronal). El índice de fibrosis fue medido en 6 secciones de cada paciente y de cada individuo control, coloreadas con hematoxilina y eosina. La relación entre el parénquima y la fibrosis de las secciones de tejido fue determinada cuantitativamente mediante el análisis digitalizado de imágenes. El grado de infiltración por células inmunes fue analizado en un segundo paso en las mismas secciones. Se registró el número individual de infiltrados inmunes perineuronales y se determinó un puntaje de infiltración para cada paciente. Tanto el cociente individual parénquima/fibrosis como el puntaje de infiltración por células inmunes fueron correlacionados con los datos clínicos de cada paciente, incluyendo el puntaje algésico y la duración de la enfermedad. La relación GAP/PGP en las fibras nerviosas pancreáticas fue deteminada como se describiera previamente (8), utilizando análisis digitalizado de imágenes. Las áreas con tinción positiva para GAP-43 fueron determinadas como una proporción relativa a las fibras nerviosas con tinción para PGP 9.5. De esta manera, se estableció un cociente GAP/PGP para cada paciente. Secciones consecutivas teñidas subsecuentemente para GAP-43 y PGP 9.5 fueron analizadas adicionalmente para detectar neuronas intrínsecas inmunorreactivas para GAP-43. La marcación inmune fue calificada en forma subjetiva como "ausente" (0), "débil" (1), "moderada" (2) o "fuerte" (3).RESULTADOS.El 96% de los pacientes manifestaron dolor epigástrico. La presencia del dolor se remontaba entre 6 meses y 22 años, y consistió en episodios constantes o frecuentes de dolor agudo por varios días. Veinte pacientes (69%) mostraron deterioro de la función exocrina del páncreas (evaluada por la prueba del pancreolauril) (13). La función endocrina se hallaba deteriorada en 16 casos (55%): 11 pacientes (38%) exhibieron metabolismo patológico de la glucosa y 5 pacientes (17%) tuvieron diabetes insulino dependiente. Se observó insuficiencia conjunta de las funciones endocrina y exocrina en 10 casos (34%). La intensidad del dolor, evaluada por el cuestionario, fue leve en 2 pacientes, moderada en 7, severa en 10 e insoportable en 10 casos. El puntaje obtenido con la escala visual analógica (1 a 10 puntos) durante la internación prequirúrgica fue menor a 5 en 20 casos (69%) y superior a 5 en los restantes 9 casos (31%). Diecisiete enfermos (59%) requirieron analgésicos, que en 5 casos fueron no narcóticos y en los restantes 12 fueron opiáceos.La evaluación morfológica cuantitativa reveló que la cantidad promedio de tejido conectivo en muestras de pacientes con PC se hallaba significativamente aumentada (p<0.001) en comparación con la de las muestras de control. En el páncreas humano normal no se observaban células inmunes, excepto células mononucleares perivasculares aisladas. No se observaron acúmulos perineurales de células inmunes en ninguno de los tejidos de control (puntaje de infiltración= 0). En cambio, todos los pacientes con PC exhibieron áreas infiltradas principalmente por células mononucleares. El grado de infiltración perineural con células inmunes varió entre 9.3 puntos y 110.1 puntos (media 44.6, error estándar de la media: 6.7). El análisis inmunocitoquímico reveló que los troncos nerviosos interlobulares con reactividad positivo para PGP 9.5 se hallaban regularmente agrandados en los pacientes con PC en comparación con el páncreas normal, y exhibían a menudo morfología simil neuroma. En estadios avanzados de la PC, los nervios de tamaño medio y grande con tinción positiva para PGP 9.5 se hallaban regularmente rodeados por infiltrados de células inmunes o por tejido fibroso. En el páncreas normal, la tinción para GAP-43 se restringió a las fibras nerviosas intralobulares delgadas en aposición estrecha con las células exocrinas, los vasos sanguíneos y los conductos. A diferencia de la abundante tinción para PGP 9.5, sólo muy pocas fibras de los nervios interlobulares e intralobulares mostraban tinción para GAP-43 (fig. 1 A/B). La morfometía digitalizada reveló que sólo el 3.0% (+1.0%) de los nervios interlobulares e intralobulares positivos para PGP 9.5 expresaban inmunorreactividad para GAP-43. Cerca de dos tercios de las neuronas intrínsecas no mostraban tinción para GAP-43 y un tercio mostraba una reactividad débil.En los pacientes con PC, el númeor de fibras parenquimatosas con tinción positiva para GAP-43 fue extremadamente reducido. En cambio, se observó un tremendo incremento de esta tinción en los nervios interlobulares e intralobulares (fig. 1 C/D). El análisis de imágenes reveló que el 70.4% (+7.1%) de las fibras positivas para PGP 9.5 también eran inmunorreactivas para GAP-43. Al respecto, la diferencia entre los controles y las muestras de PC fue altamente significativa (p<0.001 en el test exacto de Fisher). Además, la gran mayoría de las neuronas intrínsecas de los páncreas con inflamación crónica exhibieron ona intensa tinción citoplasmática para GAP-43. Regularmente, los nervios y los ganglios intrínsecos inmunorreactivos para GAP-43 se hallaban rodeados de infiltrados inflamatorios de células inmunes con estructura tipo folículo.Se evaluó la posible relación entre los hallazgos clínicos y los inmunocitoquímicos. Se analizaron los datos clínicos obtenidos con el cuestionario sintomático, el grado de inflamación perineural expresado como puntaje de infiltración y la expresión inmunocitoquímica de la GAP-43. Hubo una relación significativa entre el puntaje de infiltración y la intensidad del dolor (p<0.01). En cambio, no se halló relación entre el grado de fibrosis y la intensidad del dolor (p>0.05). Los pacientes con mayor intensidad dolorosa exhibieron una inmunorreactividad significativamente más fuerte en las neuronas intrínsecas (p<0.05). Más aún, hubo una relación significativa entre la inmunorreactividad para GAP-43 en las fibras nerviosas y la intensidad del dolor (p<0.05). Además, el puntaje de infiltración correlacionó con la intensidad de la tinción para GAP-43 en las neuronas intrínsecas (r=0.49, p<0.05). La duración de la enfermedad correlacionó linealmente con la intensidad de la tinción para GAP-43 en las fibras nerviosas (r=0.60, p<0.05) y con la expresión de GAP-43 en las neuronas intrínsecas (r=0.80, p<0.05). En consecuencia, los pacientes con PC de larga data mostraron un fuerte aumento de la inmunorreactividad para GAP-43 tanto en las neuronas como en las fibras nerviosas. Sin embargo, no se detectó una asociación entre la duración de la enfermedad y la intensidad del dolor (p=0.09).DISCUSION.Este estudio provee evidencias de una asociación directa de la infiltración de células inmunes o el crecimiento nervioso o ambos con el dolor en la PC humana. El hallazgo de cambios neuronales en los páncreas con inflamación crónica concuerdan con informes previos (1) y demuestran por primera vez una correlación directa entre el grado de inflamación perineural y los síntomas clínicos del dolor, lo cual apoya fuertemente la hipótesis de una interacción neuro-inmune como un factor imporante, si no predominante, en la generación del dolor en la PC. Sin embargo, el grado de fibrosis pancreática no tuvo influencia significativa sobre la generación del dolor en la población estudiada. Esto va en contra del concepto habitual de que la fibrosis lleva a un aumento en la presión interna del conducto en el páncreas crónicamente inflamado, por lo cual es considerado indirectamente un factor patogenético en la producción de dolor pancreático.La inmunorreactividad aumentada para GAP-43 en los nervios interlobulares e intralobulares señala cambios plásticos del sistema nervioso intrínseco durante la PC. En nuestro estudio anterior acerca de la GAP-43 en el páncreas humano (8), habíamos hipotetizado que la inflamación crónica produce una pérdida de estructuras blanco (reducción del parénquima) de las fibras nerviosas pancreáticas, lo cual lleva a un fenómeno de brotación abortiva. Esta situación puede ser comparada con una transección de un nervio periférico, que es el modelo clásico para la inducción de la expresión de GAP-43 en neuronas periféricas.Debe ponerse énfasis en señalar que, de acuerdo con los conceptos neuroanatómicos habituales, las neuronas intrínsecas no forman parte de la cadena neuronal que transmite señales nociceptivas al sistema nervioso central. Por lo tanto, la correlación dentre el dolor y la expresión de GAP-43 en neuronas intrínsecas requiere una interpretación cuidadosa. Hemos demostrado un aumento significativo de la GAP-43, tanto en fibras nerviosas pancreáticas (axones de las neuronas parasimpáticas posganglionares y fibras de origen extrínseco) como en neuronas intrínsecas. Por lo tanto, la observación de que en la PC la gran mayoría de los nervios, si no todos, vuelven a expresar el marcador GAP-43 de plasticidad neuronal bajo condiciones de PC, sugiere que todas las subpoblaciones de los sistemas neuronales, incluyendo las fibras nociceptivas aferentes, son afectadas por el proceso inflamatorio y reaccionan contra él.Por razones éticas, la estimulación de las neurona espinales y vagales aferentes no puede ser demostrada directamente por métodos inmunocitoquímicos en humanos. Sin embargo, la demostración de neuronas intrínsecas estimuladas que pueden ser investigadas directamente en las muestras de tejido pancreático obtenidas puede ser considerado un modelo excelente para el concepto de que la inflamación crónica que estimula a los nervios intrínsecos y extrínsecos lleva a cambios profundos en los estadios funcionales de las neuronas, como lo demuestra el aumento en la expresión neuronal de GAP-43.También observamos que la inflamación prolongada correlacionó con los mayores grados de expresión de GAP-43 en las neuronas intrínsecas. Esta correlación refleja la creciente pérdida de estructuras blanco para los nervios pancreáticos en el transcurso de la PC, la cual, según nuesto concepto, es un factor fuertemente estimulante para la expresión del marcador GAP-43 de plasticidad reparación neuronal.En conclusión, la correlación entre el dolor abdominal y la expresión de GAP-43 en neuronas intrínsecas provee evidencia indirecta de una alta activación de los sistemas nerviosos intrínseco y extrínseco (en particular el aferente) en el transcurso de una PC dolorosa. Nuestra observación de acúmulos perineurales de células inflamatorias señala un papel importante de la interacción neuroinmune en la patogénesis del dolor en la PC. Estudios adicionales deberán demostrar qué factores (por ejemplo citoquinas o sustancias tipo neuropéptidos) desempeñan un papel fundamental en la transmisión de los estímulos nociceptivos y la destrucción de los nervios pancreáticos.Comentario del autor.En este estudio hemos provisto evidencia de activación neuronal en la PC utilizando la GAP-43, un conocido marcador de plasticidad neuronal. La expresión de GAP-43 en los nervios intrapancreáticos correlacionó con los síntomas clínicos de dolor. En conjunto, estos hallazgos indican un papel importante de la interacción neuroinmunológica en la patogénesis de la PC. Los neuropéptidos, tales como el SP, también han sido implicados en la respuesta inmune local. Además, se ha demostrado que el SP aumenta la proliferación de linfocitos activados y la síntesis de inmunoglobulinas, tanto in vivo como in vitro. Más aún, se ha demostrado que las citoquinas, una clase de glicoproteínas inmunorreguladoras, interaccionan con el SP en varios paradigmas del dolor y la inflamación. Estas observaciones sugieren fuertemente que los neuropéptidos y las citoquinas pueden estar involucradas en la fisiopatología de la inflamación crónica en la PC. Varios estudios han puesto énfasis en una posible conexión entre los neuropéptidos y los mediadores inflamatorios. Lotz y col. (Science 241:1218-1221, 1998) demostraron que el SP y los péptidos relacionados son estímulos potentes y específicos para la producción de citoquinas tales como IL-1, TNF-Ó e IL-6 por monocitos sanguíneos humanos, lo cual sugiere como pueden regularse las respuestas inmunológicas e inflamatorias por señalaes derivadas del sistema nervioso.Como hemos demostrado previamente, el daño de la capa perineural en la PC puede permiteir el libre acceso de los mediadores tisualres al tejido circundante, incluyendo las células inflamatorias, lo que permitiría una comunicación local bidireccional entre los sistemas nervioso e inmune. Nuestros hallazgos proveen nuevas indicaciones acerca del papel que desempeña el sistema nervioso en la modulación de la respuesta inflamatoria. Estos datos indican que los mecanismos neurominmunes locales están involucrados en la fisiopatología del dolor y de la inflamación en la PC.Leyendas de las figuras.Figura 1: Inmunomarcación para PGP 9.5 y GAP-43 en el páncreas normal y en la pancreatitis crónica. Los paneles superior e inferior muestran secciones consecutivas.Panel superior izquierdo: Tinción para PGP 9.5 en el páncreas normal. El color verde señala un nervio inmunorreactivo en el páncreas normal.Panel inferior izquierdo: Tinción para PGP 9.5 en la pancreatitis crónica. El color verde muestra un nervio pancreático agrandado. La amplificación original es la misma que en el panel superior izquierdo.Panel superior derecho: Tinción para GAP-43 en el páncreas normal. Sólo unas pocas fibras nerviosas exhiben inmunorreactividad para GAP-43 en el páncreas normal.Panel inferior derecho: Tinción para GAP-43 en la pancreatitis crónica. Intensa inmunorreactividad para GAP-43 en los nervios pancreáticos agrandados.