Artículo completo
Durante el transcurso de los últimos diez años, el interés en el examen de esputo como una técnica no invasiva para la recolección de células y material soluble proveniente del pulmón se ha incrementado y ganado impulso. La inducción del esputo a través de la inhalación de una solución salina hipertónica como un marcador de inflamación en las enfermedades de la vía aérea es un procedimiento particularmente prometedor ya que proporciona información específica tanto de los componentes celulares como de los moleculares de la inflamación.El método ha sido utilizado de manera amplia para la evaluación de la inflamación de la vía aérea en el asma y en la enfermedad pulmonar obstructiva crónica debido a que produce resultados confiables y a que es comparable con otras técnicas invasivas como la biopsia y el lavado broncoalveolar (LBA). Recientemente se ha demostrado que el esputo inducido (EI) puede utilizarse para estudiar las enfermedades pulmonares intersticiales (EPI) y más específicamente las neumoconiosis, la sarcoidosis y las EPI no granulomatosas. Los citados resultados son comparables con los obtenidos con el LBA para las enfermedades pulmonares preocupacionales y sirven para distinguir los pacientes con sarcoidosis de los sujetos sanos y de las personas con EPI no granulomatosas. Más aún, los marcadores de inflamación proporcionados por el EI pueden emplarse en el monitoreo de los tratamientos. En conclusión, el EI puede constituir un sustituto no invasivo o una herramienta complementaria de otras técnicas más invasivas utilizadas en investigación y en las evaluaciones clínicas de los pacientes con EPI.El empleo del esputo inducido en medicinaActualmente el empleo del EI en medicina es amplio. En un comienzo se utilizó para investigar 1 y para diagnosticar 2 el cáncer de pulmón y más tarde como herramienta para la detección temprana del cáncer de pulmón primario a través de inmunohistoquímica3 y de la inducción del antígeno asociado con el tumor.4 Hoy se sabe que se necesitarán programas de búsqueda sistemática muy específicos para llevar a cabo el rastreo del cáncer de manera eficaz para lograr la reducción de la tasa de mortalidad causada por la enfermedad. Los procedimientos de mayor utilidad para realizar en las muestras obtenidas a través del EI son la activación oncogénica específica, la deleción del gen supresor, la inestabilidad del genoma y la metilación anormal del tumor.5 En el campo de las enfermedades infeccionsas, el EI resultó valioso para mejorar el diagnóstico de los pacientes con sospecha de padecer tuberculosis 6,7 y luego para identificar neumonías por Pneumocystis carinii en personas infectadas con HIV.8Se ha comprobado que la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa (conocida como PCR) para la detección del Pneumocystis carinii en las muestras obtenidas por EI posee alta especificidad y sensibilidad cuando se la compara con la detección mediante inmunofluorescencia9 o con la PCR efectuada en las muestras obtenidas por LBA.10,11Recientemente el método se modificó, se concentró la atención en varios marcadores de inflamación12 con el objetivo de estudiar a las personas asmáticas como también de investigar la patogenia, fisiopatología y tratamiento del asma en general13,14 y del asma ocupacional en especial.15 La información de la composición de las células proporcionada por el EI es valiosa para el tratamiento de la limitación crónica del flujo de aire.16 La no invasividad del método lo convierte en ampliamente utilizable para evaluar la inflamación de la vía aérea en los niños,17 para efectuar el diagnóstico diferencial del asma y así separarlo de las enfermedades infecciosas18 y para llevar a cabo el monitoreo de los tratamientos.19 Los macrófagos que contienen hemosiderina pueden ser útiles para detectar la disfunción ventricular izquierda20 y los macrófagos que contienen lípidos pueden indicar la presencia de reflujo orofaríngeo con microaspiración.21 Ambas situaciones pueden complicar o tornar confusa la evaluación de las enfermedades de la vía aérea. El empleo del esputo inducido en la enfermedad pulmonar intersticial (EPI)Nuestro grupo fue el primero en investigar el empleo del EI en la EPI. El LBA ha facilitado la metodología de muestreo de la respuesta inflamatoria.22 El LBA es útil para el diagnóstico de condiciones específicas, para establecer la magnitud de las enfermedades y en algnos casos, para predecir la respuesta al tratamiento. A pesar de que éste es un procedimiento esencialmente no invasivo cuando se lo realiza bajo correctas condiciones de selección y de que implica un riesgo mínimo, es frecuente que la aceptación del paciente se convierta en un problema y entonces el LBA no puede practicarse en las búsquedas sitemáticas ni en la toma reiterada de muestras.Más aún, no puede realizarse en pacientes que sufren enfermedades que contraindican la broncoscopia. Contrariamente a lo que ocurre con el LBA, el esputo inducido es mucho más sencillo de realizar, es completamente no invasivo, es menos costoso y puede ser realizado frecuentemente para seguir la evolución de la enfermedad inflamatoria pulmonar y los efectos del tratamiento. La cuestión es si puede proporcionar la misma información que el LBA y eventualmente reemplazarlo dentro de determinadas condiciones.Durante los pasados 5 años se publicaron los primeros resultados de varios estudios que compararaban las muestras de material pulmonar obtenido por esputo inducido y por LBA en personas sanas.23-25 Otros trabajos comparaban el EI, el lavado bronquial, la biopsia bronquial y el LBA en pacientes con asma,23,25,26 con bronquitis crónica25 y enfermedad pulmonar obstructiva crónica.27 En general, las muestras de EI presentan mayor cantidad de neutrfilos y menor número de macrófagos y linfocitos en comparación con las muestras obtenidas por LBA. Más aún, el análisis mediante el EI produce resultados cualitativamente similares a los obtenidos por el lavado bronquial, la biopsia bronquial y el LBA en personas asmáticas y en sujetos sanos. Todos los resultados demostraron que existe una concordancia bastante buena entre las técnicas con respecto al recuento de eosinófilos en las personas asmáticas y en las portadoras de bronquitis crónica reagudizada. Sin embargo, los primeros estudios que comparan el esputo inducido con el LBA en enfermedades pulmonares intersticiales se publicaron recientemente, cuando nuestro grupo informaba que el EI podría revelar el estado de la exposición a polvos peligrosos de manera tan eficaz como el LBA28 y que el EI es comparable con el LBA para la evaluación de pacientes con sarcoidosis y enfermedad intersticial pulmonar no granulomatosa.29 Simultáneamente, otros investigadores compararon el EI con el lavado bronquial y con el LBA en pacientes con diagnóstico reciente de sarcoidosis.30 Con respecto a otro grupo de enfermedades, recientemente hemos demostrado que puede evidenciarse el compromiso pulmonar a través de la acumulación de linfocitos CD4+ en el EI de los pacientes con enfermedad de Crohn.31Para la validación de la metodología de la inducción del esputo y el examen del esputo en los pacientes con enfermedades pulmonares intersticiales hemos utilizado un nebulizador ultrasónico, método reportado como más propenso al éxito comparado con otros nebulizadores.32 Solamente hemos utilizado 8 ml de solución salina hipertónica, ya que provoca la misma obtención de esputo, otorga menor incomodidad al paciente y causa menor incremento de la cantidad de neutrófilos que dosis mayores.33Debido a la seguridad de la inducción del esputo se encontró que este método está exento de riesgos para los pacientes con asma de distinta gravedad34,35 y para los que padecen enfermedad pulmonar obstructiva crónica.36Si se tiene en cuenta la disminución de la saturación de oxígeno durante la inducción del esputo, los resultados aún son controvrtidos. Algunos autores señalaron una pequeña caída de la saturación de oxígeno que no fue clínicamente significativa36 mientras que otros demostraron efectos más importantes.37 Nosotros creemos que el efecto del esputo inducido sobre la saturación de oxígeno en la sangre arterial en pacientes con EPI debe someterse a un monitoreo mientras dure la inducción. Más aún, el procedimiento de inducción del esputo genera una caída mínima en la VEF1 que puede evitarse mediante el pretratamiento con salbutamol.36 Por esta razón la función de la vía aérea se monitorea estrechamente a lo largo del procedimiento y los pacientes en riesgo reciben un pretratamiento con broncodilatadores.38 A pesar de que generalemnete no existen evidencias de enfermedad obstructiva reversible en los pacientes con enfermedad pulmonar intersticial, nuestro protocolo incluyó la administración de agonistas beta 2 con la intención de prevenir los efectos adversos inesperados de la solución salina.Para examinar el esputo empleamos el método de la dispersión celular.39 Se seleccionan tapones frescos de esputo sin contaminación con saliva, se dispersan las células del esputo a través de la destrucción mecánica con dititiotreitol, se preparan centrifugados de las células y se recoge el sobrenadante para la medición de los componentes de la fase líquida.38 Este método ha demostrado ser comparable con el análisis del esputo en su totalidad para distinguir a los asmáticos de quienes no lo son, de acuerdo con el porcentaje de eosinófilos y de los niveles de ECP39. Sin embargo el método de procesar ciertos tapones del esputo ha sido muy estudiado en relación con la identificación de subtipos celulares y de activación celular.40 A semejanza de otros estudios,41 nos permitió aplicar la citometría de flujo en el examen de la suspensión celular.–Cuáles son las posibles ventajas del esputo inducido como herramienta clínica para la evaluación de la enfermedad pulmonar intersticial en el futuroEn primer término hemos utilizado el EI en la descripción un caso fatal de silicosis de curso acelerado ACCELERATED con un componente de neumoconiosis causada por varios polvillos en un joven esmerilador de metales duros.42 En este informe sobre un caso hemos encontrado una aceptable concordancia entre el LBA y los hallazgos del EI ya que los estudios microscópicos con luz polarizada de las muestras provenientes del LBA como de las tomadas mediante el EI mostraron partículas típicas de sílice. En un estudio posterior comparamos el EI con el LBA en la evaluación de la exposición a polvillos peligrosos y en el examen de pacientes con neumoconiosis (trabajadores en contacto con sílice y metales duros).28 Se han llevado a cabo varios estudios en los cuales se evaluó solamente el esputo de personas con sospecha de presentar exposiciones laborales. Se realizaron recuentos de eosinófilos en el esputo inducido de sujetos asmáticos sensibles a los isocianatos43 y se investigó la frecuencia de aparición de displasia bronquial en el esputo de mineros expuestos44. Otros investigadores estudiaron la importancia de los cuerpos de asbesto en la producción espontánea de esputo.45,46 En la evaluación de los trabajadores expuestos al sílice y a metales duros hemos hallado que las muestras obtenidas por LBA y por EI proporcionaron resultados semejantes tanto cualitativos como cuantitativos con respecto al número de partículas presentes en las muestras y a su análisis químico. De manera que el esputo inducido es un procedimiento seguro y sencillo que podría ser una herramienta especialmente eficaz para la evaluación de los trabajadores con sospecha de ser portadores de silicosis o de una enfermedad producida por un metal duro. Además, el monitoreo biológico de los trabajadores expuestos a agentes tóxicos ha ganado una creciente aceptación debido a su acertada determinación de la exposición a ese tipo de agentes.47 La exposición a metales (plomo y cadmio) y solventes (tolueno y tricloroetano) se calcula a través de la medición de las sustancias o de sus metabolitos en la sangre, en la orina o en el aire exhalado por el paciente. Sin embargo, las mediciones de los polvos peligrosos no se han incluido todavía en este protocolo debido a que la evaluación de la exposición se ha basado principalmente en los antecedentes ocupacionales y en el monitoreo del entorno. Nuestros hallazgos abren la posibilidad de que el esputo inducido sirva en el futuro como un método biológico de monitoreo en la revisaciones físicas periódicas de trabajadores sanos expuestos a polvillos peligrosos.Con respecto a otras enfermedades intersticiales del pulmón de etiología desconocida como la sarcoidosis y la fibrosis pulmonar idiopática, tanto otros investigadores30,48 como nosotros29hemos realizado estudios de comparación entre la información proporcionada por el LBA con la obtenida mediante el esputo inducido. D\'Ippolito y sus colaboradores 30 indicaron que hay un porcentaje mayor de linfocitos tanto en el LBA como en el esputo de pacientes con sarcoidosis en comparación con sujetos de control. No obstante, se sabe que la linfocitosis presente solamente en el LBA no diagnostica la sarcoidosis ya que hay muchas otras enfermedades que también presentan aumento del número de linfocitos en las muestras del LBA (enfermedad pulmonar intersticial distinta a la sarcoidosis, infecciones pulmonares múltiples, inflamación pulmonar sin etiología infecciosa comprobable y una variedad de neoplsmas que comprometen el pulmón como mla hiperactividad bronquial).49 Se dispone de un informe que considera la sarcoidosis como una enfermedad mediada por la acumulación de linfocitos CD4+.50,52 Algunos reportes señalan que el cociente CD4/CD8 resulta útil para distinguir esta enfermedad de otras.50 Fue en este contexto que analizamos y comparamos las subpoblaciones de los linfocitos T en muestras obtenidas tanto por LBA como por esputo inducido en 19 pacientes con neumoconiosis28 y en 30 personas con enfermedad intersticial pulmonar.29 A pesar de que los porcentajes totales de CD3+, CD4+ y CD8+ resultaron más bajos en las muestras obtenidas por EI que en las provenientes del LBA hemos hallado que la proporción entre los subgrupos se correlacionóampliamente para ambas muestras.Nuestros datos proporcionan sustento al punto de vista que sostienen que las subpoblaciones de linfocitos T presentes en las muestras y recuperadas mediante el EI se correlacionan adecuadamente con las obtenidas a través del LBA y que el EI puede identificar de manera eficaz y no invasiva la inflamación con predominio de linfocitos CD4+ con el objetivo de diferenciar la sarcoidosis de otras enfermedades pulmonares intersticiales no granulomatosas. Más aún otros investigadores han demostrado que el cociente CD4/CD8 junto con los niveles de TNF alfa I acompaña los cambios en el trataento 48. Estos hallazgos contribuyen al debate actual acerca del valor predictivo del cociente CD4/CD8 ya que aporta un dato en favor de los investigadores que aseguran que una cifra elevada del cociente CD4/CD8 posee gran especificidad (>90%) y sensibilidad (50-60%), un valor positivo de predicción de 76% y un valor de predicción negativa de 85%.53,55 Esto se opone a los informes que sostienen la existencia de gran variabilidad del cociente CD4/CD8 entre los pacientes con sarcoidosis.56Un hallazgo muy interesante de esas investigaciones sobre EI fue que los resultados avalan el concepto de la recirculación ininterrumpida entre el tejido linfoide asociado a la mucosa y sus folículos linfáticos activados con los sitios efectores en el contexto del sistema inmune integrado de las mucosas. Se sabe que la población de linfocitos obtenidos mediante el LBA está compuesta por el balance dinámico entre la entrada y la salida de estas células desde otros compartimientos del pulmón.58 Resulta razonable asumir que en la sarcoidosis los linfocitos CD4+ circulan desde la lámina propia de los bronquios hacia el espacio broncoalveolar y que las células CD4+ son más propensas a la recirculación que otros subgrupos como los linfocitos B 59. Por cierto que la recirculación entre la mucosa bronquial y la intestinal puede explicar nuestros hallazgos recientes, que demostraron la acumulación de células CD4+ en el esputo inducido de un subgrupo de pacientes con enfermedad de Crohn.31–Cuál es la situación de otras enfermedades pulmonares no granulomatosas del pulmón (fibrosis pulmonar idiopática, neumonitis por hipersensibilidad) Hemos observado una buena correlación entre el cociente CD4/CD8 obtenido por EI y LBA en pacientes con diferentes tipos de infiltrados pulmonares difusos.Este hecho podría ser de crucial importancia, ya que en un trabajo previo hemos encontrado que el cociente CD4/CD8 mayor que la unidad posee valor pronóstico para el cálculo de una respuesta favorable a los esteroides.60–Puede el esputo inducido reemplazar al lavado broncoalveolar Consideramos que en quienes no está contraindicado el LBA, éste es el que debería efectuarse. Para quienes no pueden someterse a este procedimiento creemos que el EI proporcionará información igualmente satisfactoria para fines diagnósticos. En la sarcoidosis, los criterios actualizados para la identificación de la enfermedad activa se basan en criterios clínicos, radiografía y tomografía computarizada de tórax, un estudio con galio, pruebas de evaluación de la función pulmonar, LBA con biopsia transbronqial y marcadores séricos. Inclusive proponemos otra prueba inicial que puede agregarse a las recomendadas61 para la primera evaluación de los pacientes con sarcoidosis y otro marcador de actividad que puede adicionarse a los ya mencionados como medios auxiliares para el potencial diagnóstico o índices de activación61.En resumen, consideramos que el análisis de los subgrupos de células T obtenidos mediante el esputo inducido puede ser tan valioso como el realizado a través de la utilización del LBA para el diagnóstico de sarcoidosis, y que posee valor pronóstico en los pacientes con fibrosis pulmonar idiopática en quienes existan contraindicaciones clínicas para someterse a una broncoscopia o cuando por cualquier razón no se disponga de muestras de tejido.Bibliografía1. Bickerman HA, Sproud EE, Barach AL. An aerosol method of producing bronchial secretions in human subjects: a clinical technique for detection of lung cancer. Dis Chest 1958; 4:347-362.2. Khajotia RR,Mohn A, Pokieser L, Schalleschak J, Vetter N. Induced sputum and cytological diagnosis of lung cancer. Lancet 1991 338:976-7.3. Tockman MS, Erozan YS, Gupta P, Piantadosi S, Mulshine JL, Ruckdeschel JC. The early detection of second primary lung cancers by sputum immunostaining. Chest 1994; 106:385S-390S.4. Steven FS, Katsumi T, Payne PW, Denton J. evidence for the induction of a tumor associated cell surface protease on cytologically normal epithelial cells present in the sputum of patients possessing lung tumors. Anticancer Research 1999; 19:3491-3.5. Tockman MS. Advance in sputum analysis for screening and early detection of lung cancer. Cancer Control 2000; 7:19-24. 6. Yue WY, Cohen SS. Sputum induction by newer inhalation method in patients with pulmonary tuberculosis. Dis Chest 1967; 51:614-620.7. Li LM, Bai LQ, Yang HL, Xiao CF, Tang RY, Chen YF, Liu SS, Zhang SN, Ou YH, Niu TI. Sputum induction to improve the diagnostic yield in patients with suspected pulmonary tuberculosis Int J Tuberc Lung Dis 1999; 3:1137-98. Leigh TR, Hume C, Gazzard B, Parsons P, Hussain OAN, Collins JV. Sputum induction for the diagnosis of Pneumocystis carinii pneumonia. Lancet 1989; ii:205-206.9. Khan MA, Farrag N, Butcher P. Diagnosis of Pneumocystis carinii pneumonia: immunofluorescence staining, simple PCR or nPCR J Infect 1999; 39:77-8010. Cartwright CP, Nelson NA, Gill VJ. Development and evaluation of a rapid and simple procedure for detection of Pneumocystis carinii by PCR J Clin Microbiol 1994; 32:1634-1638.11. Caliendo AM, Hewitt PL, Allega JM, keen A, Ruoff KL, Ferraro MJ. Performance of a PCR assay for detection of Pneumocystiss carinii from respiratory specimens. J Clin Microbiol 1998; 36:979-982.12. Pizzichini E, Pizzichini MMM, Efthimiadis A, Morris MM, Squilaced V, Gleich GJ, Dolovich J, Hargreave FE. Indices of airway inflammation in induced sputum: reproducibility and validity of cell and fluid phase measurements. Am J Respir Crit Care Med 1996:154:808-817.13. Iridale MJ, Wanklyn SAR, Philips IP Krauz T, Ind PW. Non-invasive assessment of bronchial inflammation in asthma: no correlation between eosinophilia of induced sputum and bronchial responsiveness to inhaled hypertonic saline. Clin Exp Allergy 1994; 24:940-945. 14. Claman DM, Boushey AH, Liu J, et al. The analysis of induced sputum to examine the effects of prednisone on airway inflammation in asthmatic subjects. J Allergy Clin Immunol 1994; 94:861-869.15. Lemmiere C, Pizzichini MMM, Balkissoon R, Clelland L, Efthimiadis D, Shaughnessy D, Dolovich J, Hargreave FE. Diagnosing occupational asthma: use of induced sputum. Eur Respir J 1999; 13:482-488.16. Peleman RA, Rytilya PH, Kips JC, Joos GF, Pauwels RA. The cellular composition of induced sputum in chronic obstructive pulmonary diseases. Eur Respir J 1999; 13:839-843.17. Gibson PG. Use of induced sputum to examine airway infalmmation in childhood asthma J Allergy Clin Immunol 1998; 102:S100-1.18. Zimmerman B, Silverman FS, Tarlo SM, Cahpman KR, Kubay JM, Urch B. Induced sputum: comparison of postinfectious cough with allergic asthma in children 2000; 105:495-9.19. Twaddell SH, Gibson PG, Carty K, Woolley KL, Henry RL. Assessment of airway inflammation in children with acute asthma using induced sputum Eur Respir J 1996; 10:2104-8.20. Leigh R, Sharon PT, Efthimiadis A, Kamada D, Hargreave FE, Kitching AD. Diagnosing left ventricular dysfunction from induced sputum examination lancet 1999; 353:833-834.21. Parameswaran K, Anvari M,, Efthimiadis A, Kamada D, Hargreave FE, Allen CJ. Lipid Laden macrophages in induced sputum are a marker of gastric oropharyngeal reflux and possible aspiration. Eur Respir J 2000 (in press).22. Stoller JK, Rankin AJ, Reynolds HY. The impact of bronchoalveolar lavage cell analysis and clinician diagnostic reasoning about interstitial lung diseases. Chest 1987; 92:839-843.23. Fahy JV, Wong H, Liu J, Boussly HA. Comparison of samples collected by sputum induction and bronchoscopy from asthmatic and healthy subjects. Am J Respir Crit Care Med 1995; 152:53-58.24. Lensmar C, Elmberger G, Sangren P, Skold CM, Eklund A. Leukocyte counts and macrophage phenotype in induced sputum and bronchoalveolar lavage fluid from normal subjects. EurRespir J 1998; 12:595-60025. Maestrelli, P. Saett M, Di Stefano A, Calcagni PG, Turato G, Ruggier IP Mapp CE, Fabbri LM. Comparison of leukocyte counts in sputum, bronchial biopsies and bronchoalveolar lavage. Am Rev Respir Crit Care Med 1995; 152:1926-1931.26. Keatings VM, Evans DJ, O\'Connor BJ, Barnes PJ. Cellular profiles in asthmatic airways:a comparison of induced sputum, bronchial washings and bronchoalveolar lavage fluid. Thorax 1997; 52:372-373.27. Rutgers SR, Timens W, Kaufmann HF, van der Mark TW, Koeter GH, Postma DS. Comparison of induced sputum with bronchial wash, bronchoalveolar lavage and bronchial biopsies in COPD. Eur Respir J 2000; 15:109-115.28. Fireman E, Greif J, Bologovov E, Schwarz Y, Man A, Ganor E, Ribak Y, Lerman Y. Evaluation of occupational lung diseases by induced sputum compared to bronchoalveolar lavage. Chest 1999; 11:1720-1728.29. Fireman E, Topilsky I, Greif J, Schwarz Y, Man A, Lerman Y, Topilsky M. Evaluation of interstitial lung diseases by induced sputum compared to bronchoalveolar lavage. Respir Med 1999; 93:827-834.30. D\'Ippolito R, Foresi A, Chetta A, Casalini A, Castagnanao A, Leone C, Olivieri A. Induced sputum in patients with newly diagnosed sarcoidosis. Chest 1999; 115; 1611-1615.31. Fireman Z, Osipov A, Kivity S, Kopelman Y, Sternberg A, Fireman E. The use of induced sputum in the assessment of pulmonary involvement in Crohn\'s Diseases. Am J of Gastroenterol 2000; 95:730-734.32. Popov TA, Pizzzichini MMM, Pizzichini E, Kolendovich R, Puntakee Z, Dolovich J, Hargreave FE. Some technical factors influencing the induction of sputum for cell analysis. Eur Respir J 1995; 8:559-565.33. Pavord I. Sputum induction to assess airway inflammation: is it an inflammatory stimulus Thorax 1998; 53:79-80.34. Wong HH,ahy JV. Safety of one method of sputum induction in asthmatic subjects. Am J Respir Crit Care Med 1997; 156:299-303.35. de la Fuente TP, Romagnoli M, Godard P, Bousquet J, Chanez P. Safety of inducing sputum in-patients with asthma of varying severity. Am J Respir Crit Care Med 1998; 157:1127-1130.36. Bhowmik A, Seemungal T, Sapsford RJ, Devalia JL, Wedzica JA. Comparison of spontaneous and induced sputum for the investigation of airway inflammation in chronic obstructive pulmonary disease. Thorax 1998; 53:953-956.37. Castagnaro A, Chetta A, Foresi D\'Ippolito R, Malorgio R, Olivieri D. Effect of sputum induction on spirometric measurements and arterial oxygen saturation in asthmatic patients, smokers and healthy subjects. Chest 1999, 116:941-94538. Popov T, Gottschalk R, Kolendowich R, Dolovich J, Powers P, Hargreave FE. The evaluation of a cell dispersion method of sputum examination. Clin Exp Allergy 1994; 24:778-783.39. Spavenello A, Beghe B, Bianchi A, Migliore GB, Ambrosetti M, Neri M, Ind PW. Comparison of two methods of processing induced sputum: selected vs entire sputum. Am J Respir Care Med 1998; 157:665-668.40. Holtz O, Kips J, Magnussen H. Update on sputum methodology Eur Respir J 2000; 16:355-359.41. Pizzichini E, Pizzichini MM, Kidney JC, Efthimiadis A, Hussack P, Popov T, Cox G, Dolovich J, O\'Byrne P, Hargreave FE. Induced sputum, broncho- alveolar lavage and blood from mild asthmatics - inflammatory cells, lymphocyte subsets and soluble markers compared Eur Respir J 1998;11:828-834.42. Cohen C, Fireman E, Ganor E Man A, Ribak J, Lerman Y. Accelerated silicosis with mixed dust pneumoconiosis in a hard metal grinder. J Occup Environ Med 1999; 41:480-485.43. Maestrelli P, Calcagni PG, Saetta M, Man A, Ribak J, Lerman Y. Sputum eosinophilia after asthmatic responses induced by isocyanates in sensitized subjects. Clin Exp Allergy 1994; 24:29-34.44. Michaylov MA, Pressyanov DS, Kalinov KB. Bronchial dysplasia induced by radiation in miners exposed to 222Rn progeny. Occup Environ Med 1995; 52:82-85.45. Teschler H, Thompson AB, Dollenkamp R, Konietzko N, Costabel U. Relevance of asbestos bodies in sputum. Eur Respir J 1996; 9:680-686.46. Sulotto F, Capellaro E, Chiesa A, Villari S, Bontempi S, Scansetti G. Relationship between asbestos bodies in sputum and the number of specimens. Scand J Work Environ Health 1997; 23:48-53.47. Rosenberg G, Harrison R. Biological monitoring. In: LaDou J, Ed. Occupational and Environmental Medicine. 2nd edn. NY Appleton and Lange, 1997:637-646.48. Moodley YP, Dorasamy T, Venketasamy S, Naicker V, Laloo UG. Correlation of CD4/CD8 ratio and TNF ( levels in induced sputum with broncholaveolar lavage fluid in pulmonary sarcoidosis. Thorax 2000, 55:696-699.49. Rosen Y, Vulentin JC, Perschuck LP, Silverstein E. Sarcoidosis: from the pathologist\'s vantage point. Pathol Annu 1979; 14:405-439.50. Hunninghake GW, Crystal RG. Pulmonary sarcoidosis: a disorder mediated by excess helper T-lymphocyte activity at sites of disease activity. N Engl J Med 1981; 305:429-434.51. Fireman EM, Topilsky MR. Sarcoidosis: an organized pattern or reaction from immunology to therapy. Immunol Today 1994; 15:199-201.52. Newman LS, Cecile RS, Maier LA. Sarcoidosis. N Engl J Med 1997; 17:1224-1225.53. Winterbauer RH, Lammert J, Selland M, Wu R, Corley D, Steven C, Springmeyer SC. Bronchoalveolar lavage cell population in the diagnosis of sarcoidosis. Chest 1993; 104:352-361.54. Costabel U. 1992. Sensitivity and specificity of BAL findings in sarcoidosis. Sarcoidosis 9 (Suppl. 1) 211-214.55. Costabel U. CD4/CD8 ratios in bronchoalveolar lavage fluid: of value for diagnosing sarcoidosis. Eur Respir J 1997; 10:2699-2700.56. Kantrow SP, Meyer KC, Kidd P, Raghu G. The CD4/CD8 ratio in BAL fluid is highly variable in sarcoidosis. Eur Respir J 1997; 10:2716-2721.57. Pabst R, Tschering T. Lymphocyte dynamics: caution in interpreting BAL numbers. Thorax 1997; 52:1078-108058. Brandtzaeg P, Farstad I. Guttorn H. Regional specialization in the mucosa immune system: primed cells do not always home along the same track. Immunol Today 1999; 6:267-277.59. Young AJ. The physiology of lymphocyte migration through the single lymph node in vivo. Semin Immunol 1999; 11:73-83.60. Fireman E, Vardinon N, Burke M, Spizer S, Levin S, Endler A, Stav D, Topilsky M, Man A, Schwarz Y, Kivity S, Greif J. The prognostic and diagnostic value of T-lymphocytes subtypes analysis in idiopathic pulmonary fibrosis. Eur Respir J 1998; 11:706-711.61. Statement on Sarcoidosis -The Joint Statement of the ATS, ERS and WASOG adopted by the ATS and ERS executive committee, february 1999 Am J Respir Crit Care Med 1999; 160:736-755.