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Necesidad de mejorar los factores pronósticos en pacientes con cáncer de mama y ganglios negativosLos resultados de un metaanálisis reciente indican un beneficio significativo de la quimioterapia adyuvante en mujeres con cáncer de mama y ganglios negativos (The Lancet 352:930-942, 1998). En base a esas y a otras observaciones previas, el consenso internacional de 1998 estableció varias recomendaciones para el tratamiento de mujeres con esta patología (J Natl Cancer Inst 90:1601-1608, 1998). Las enfermas fueron divididas en tres categorías de riesgo según los factores pronósticos conocidos: tamaño del tumor, estado de receptores estrogénicos y grado histológico. Mientras que en el grupo de alto riesgo se recomendó la administración de quimioterapia, las opciones de tratamiento para el grupo de riesgo intermedio (tamaño del tumor entre 1 y 2 cm, receptor estrogénico positivo y grado histológico 1 o 2) fueron dejadas a criterio del médico y de la paciente. Los efectos beneficiosos potenciales de la quimioterapia en este último grupo, con una sobrevida a los 10 años de casi un 90%, deben balancearse con la toxicidad y el costo de tal tratamiento. Esto es particularmente cierto en mujeres de más de 50 años, en las que el beneficio absoluto proyectado de la quimioterapia sobre la sobrevida se estima en sólo un 1% (The Lancet 352:930-942, 1998). Obviamente, el descubrimiento de nuevos factores independientes con poder pronóstico contribuiría, de modo importante, con la toma de decisiones en mujeres con cáncer de mama y ausencia de compromiso ganglionar consideradas con riesgo intermedio. Con la introducción de los estudios mamográficos de rutina en el rastreo de la enfermedad en muchos países, la incidencia de aparición de tumores pequeños con ganglios negativos está en aumento y por este motivo resulta aún mayor la necesidad de disponer de nuevos marcadores pronósticos. Valor pronóstico de la mutación del gen p53Se han propuesto numerosas alteraciones somáticas como marcadores biológicos con potencialidad pronóstica; la mayoría de ellos involucra aberraciones de genes que regulan la proliferación celular. Debido a los múltiples roles en funciones celulares vitales como reparación del ADN dañado y apoptosis, la alteración del gen supresor de tumor p53 ha recibido la mayor atención como candidato para ser utilizado con poder pronóstico útil desde el punto de vista clínico. Se han realizado por lo menos 48 estudios ­7É3 que incluyeron a 11 mil mujeres con cáncer de mama para evaluar el valor pronóstico de la acumulación anormal de la proteína p53 detectada mediante inmunohistoquímica (IHQ) (Mod Pathol 11:155-168, 1998). Muchos de ellos, aunque no todos, refirieron una asociación entre la marcación del p53 y peor sobrevida, con inclusión de pacientes sin compromiso ganglionar en varios ensayos. A pesar de los resultados por lo general coincidentes, el principal obstáculo en la introducción de la detección de la acumulación de p53 como factor pronóstico ha sido la dificultad en la estandarización de la técnica de IHQ. Aunque escasos, los estudios que evaluaron el valor pronóstica de la mutación del gen p53 por técnicas moleculares han mostrado resultados más concordantes en comparación con la IHQ. Un metaanálisis de 11 estudios sobre 2 319 tumores mostró que el riesgo de una menor sobrevida, en pacientes con la mutación del gen p53, era del doble en todos los cánceres y de 1.7 veces más en los casos sin compromiso ganglionar (Br J Cancer 80:1968-1973, 1999). En los dos estudios más recientes de tumores con ganglios negativos, incluyendo uno de nuestro laboratorio, sólo la mutación del p53 (Cancer Res 58:1451-1455, 1998) o la mutación en este gen más el tamaño tumoral (Clin Can Res 4:1597-1602, 1998) se encontró que fueron factores pronósticos independientes en el análisis de variables múltiples que incluyó el estado de receptor estrogénico, el grado histológico y los marcadores de proliferación celular. Resulta obvio a partir de los estudios previamente mencionados que la mutación del gen p53 es un factor pronóstico reproducible y de valor en mujeres con cáncer de mama y, por lo tanto, podría ser de suma utilidad para ayudar a decidir, en caso de patología de riesgo intermedio, el tratamiento con quimioterapia y su potencial beneficio. Los mayores obstáculos en la introducción de esta prueba, en el uso rutinario, han sido sus dificultades técnicas y el elevado costo de los análisis. –Qué técnica molecular utilizar en el rastreo de rutina de la mutación del gen p53Las tres técnicas de biología molecular que se han utilizado con esta finalidad son el estudio de secuencia del ADNc, la electroforesis en gel constante desnaturalizado (CDGE) y el polimorfismo conformacional de cadena simple (SSCP). La primera de ellas, a pesar de ser considerada como la técnica estándar para la detección de mutaciones genéticas, es demasiado costosa y tediosa como para que pueda introducirse en el estudio rutinario del estado p53. La CDGE y sus múltiples modificaciones son difíciles de estandarizar debido a las complejidades técnicas de los sistemas de gel empleados, lo cual hace que tampoco sea adecuada desde el punto de vista rutinario. El método más divulgado utilizado para rastrear grandes cantidades de tumores ha sido la técnica SSCP, relativamente simple. La sensibilidad estimada del procedimiento se acerca al 95% para la detección de mutaciones del p53 (Oncogene 9:1739-1743, 1994). Una de las principales ventajas para la búsqueda de mutaciones de este gen en muestras tumorales es que no se necesita maximizar el contenido de células tumorales antes del estudio, debido a que la ­7É3 técnica es capaz de detectar hasta un mínimo de 5% de mutación en la secuencia de ADN en comparación con el ADN normal. Además, no se requiere de un cuidado especial en la manipulación del material genético y el método funciona igualmente bien en secciones fijadas con formalina o en tejido embebido en parafina (Mod Pathol 10:252-258, 1997). Esto es particarmente importante en tumores de pequeño tamaño y en cánceres en estadio temprano donde los anatomopatólogos no son proclives a dar muestras de tejido para estudio de ADN debido a las posibilidades de subdiagnóstico. La SSCP se basa en que el ADN que contiene una mutación, por ejemplo una secuencia alterada de nucleótidos, tiene una movilidad electroforética diferente en geles de acrilamida no desnaturalizados debido a que aquella adopta una conformación terciaria distinta de la del ADN con secuencia normal. Los dos sistemas de señalización que habitualmente se utilizan para detectar el ADN son la marcación radioisotópica y la fijación con plata. Ambos son, sin embargo, no aptos para laboratorios de patología de rutina debido a aspectos vinculados con la seguridad en el primero de ellos y por lo laborioso en el segundo. La SSCP con fluorescencia (F-SSCP) es un método estandarizado y de rutina para el análisis de las mutaciones del p53La F-SSCP es una variación del método original (Genome Research 2:10-13, 1992) que brinda varias ventajas en relación con la utilización de productos radioisotópicos o plata. El producto de PCR marcado con fluoresecencia brinda la señal la cual se lee con láser sobre el gel de electroforesis (figura 1). Estos geles pueden correrse en analizadores de fragmentos de ADN relativamente económicos los cuales se calibran para que tengan condiciones constantes de corrida, en especial en relación con la temperatura; por lo tanto, aseguran la reproducibilidad de los resultados entre los laboratorios. La utilización de geles comerciales de calidad controlada también contribuye a que se logren condiciones estandarizadas. Finalmente, el rendimiento del sistema F-SSCP es tal que un solo técnico con un simple equipo puede estudiar hasta quince muestras tumorales por día para detectar mutación del p53. Esto brinda beneficios económicos en estudios rutinarios en escala. Conclusiones e implicaciones en el manejo de mujeres con cáncer de mama sin compromiso ganglionar con riesgo intermedioLos factores pronósticos que actualmente se utilizan tales como tamaño tumoral, estado del receptor estrogénico y grado histológico permite la identificación de mujeres afectadas por cáncer de riesgo intermedio y con una sobrevida a los 10 años de casi un 90% (figura 2A). Este amplio y creciente grupo de enfermas que comprende aproximadamente un tercio de todas las pacientes con cáncer de mama representa un dilema en relación con los beneficios versus riesgos de la quimioterapia. Por ello se requieren nuevos factores pronósticos para tomar mejores decisiones. Las mutaciones del gen p53 han demostrado brindar información pronóstica reproducible e independiente en cáncer de mama, incluyendo el subgrupo de mujeres con ganglios negativos. ­7É3 Este factor identifica un subgrupo tumoral con casi dos veces peor sobrevida en comparación con aquellas enfermas que no presentan la mutación. En otras palabras, las mujeres con cáncer y riesgo intermedio con mutación del gen p53 tienen una sobrevida a los 10 años de casi el 82% en comparación con el 91% en aquellas con p53 normal (figura 2B).Nosotros hemos desarrollado un ensayo sensible basado en fluorescencia para la detección de la mutación del gen p53 el cual es fácilmente estandarizable y, por lo tanto, apto para estudios de rutina. El F-SSCP no necesita enriquecimiento tumoral y puede realizarse en secciones finas de tejido fijadas con formalina o embebidas en parafina. Proponemos que este método estandarizado sea utilizado para la detección del estado p53 de tumores en estudios prospectivos aleatorizados que evalúen los beneficios de la quimioterapia en cáncer de mama en estadios tempranos. Esto permitirá la confirmación de la mutación del gen p53 como un factor pronóstico así como el establecimiento de su valor predictivo en respuesta al tratamiento quimioterápico. Se requieren estudios futuros que analicen la eficacia de este marcador junto con la de otras alteraciones genéticas que permitan la identificación del subgrupo global del 10% de pacientes con cáncer de mama en estadio temprano con un muy alto riesgo de recidiva (figura 2C). En este caso estaría indicado el tratamiento adyuvante, mientras que en el 90% restante lo favorable del pronóstico no justifica la instauración de esta terapia. *************************************** (FIGURAS 1 Y 2)(EPIGRAFES)Figura 1: Método estandarizado de F-SSCP para la detección de mutaciones del gen p53 en muestras de tumores de mama fijadas en formalina y embebidas en parafina. Las flechas en los números 2, 4, 6, 8 y 10 señalan bandas adicionales con migración alterada que indican la presencia de mutaciones del gen p53. Figura 2: Curvas de sobrevida en pacientes con cáncer de mama con riesgo intermedio, sin compromiso ganglionar según los factores pronósticos convencionales de tamaño tumoral, estado de receptor estrogénico y grado histológico (A). Este grupo de pacientes tiene una sobrevida aproximada, a los 10 años, del 90%. Según el estado del p53, las enfermas pueden ser subdivididas en aquellas con casi un 91% (p53 normal) o un 82% (p53 mutante) de sobrevida a los 10 años (B). El objetivo, en el futuro, sería descubrir marcadores moleculares adicionales con valor pronóstico que permita la identificación del subgrupo de mujeres (10%) con riesgo intermedio y peor sobrevida (C) de forma tal que se les pueda ofrecer terapias más agresivas. (PEGOTES FIGURA 2)(1) Sobrevida (%)(2) marcadores establecidos(3) con marcador p53(4) otros(5) Tiempo posterior a la cirugía (años) ­7É3 **********************************************