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ResumenSe analiza, en islotes pancreáticos de ratas inyectadas con estreptozotocina, el contenido de óxido nítrico (NO), prostaglandinas (PGs) y especies reactivas del oxígeno (ROS), y la eventual interrelación que existe entre ellos en el período temprano de la destrucción pancreática. Los niveles de ROS, NO, lipoperoxidación y prostanoides inflamatorios son mayores en islotes de ratas diabéticas que en los provenientes de animales sanos, y su producción se modula positivamente entre sí, sugiriendo la ausencia de mecanismos regulatorios que acoten el daño producido sobre las células ß. Los niveles de 15-deoxi-delta12,14 PGJ₂ (15dPGJ₂), ligando natural de PPARgamma cuya actividad antiinflamatoria se ejerce por inhibición de NOS inducible y de ciclooxigenasa 2, se encuentran disminuidos en islotes diabéticos. Su agregado al medio de cultivo de estos islotes origina un decremento en la síntesis NO y de PGE₂, así como una caída en la actividad de la enzima óxido nítrico sintetasa en islotes de animales sanos y diabéticos. Este compuesto parece modular negativamente la producción de PGE₂ y NO, que provocan la reacción inflamatoria en el modelo de rata diabética por estreptozotocina. Se pone en evidencia un desajuste de este mecanismo limitante en el animal diabético, que extiende y perpetúa la lesión del páncreas endocrino. Palabras clave: islotes, óxido nítrico, prostaglandinas, estrés oxidativo, 15-deoxi-delta12,14 PGJ₂.AbstractThe present study has been designed to evaluate the levels of nitric oxide (NO), prostaglandins (PGs) and oxygen reactive substances (ROS) and to explore their relationship in the early stage of streptozotocin-induced islet destruction in the rat. ROS, NO, lipoperoxidation and inflammatory prostanoids levels are higher in diabetic rat islets compared to control, and they seem to up-regulate each other\'s production, suggesting the lack of regulatory mechanisms limiting the damage produced on ß cells. 15-deoxy-delta12,14 PGJ2 (15dPGJ2), a natural ligand of PPARgamma, seems to inhibit inducible NOS and ciclooxygenase 2 activity. 15dPGJ2 levels are diminished in diabetic islets, and its addition to the culture medium diminishes NO and PGE2 production and nitric oxide synthase activity in islets from control and diabetic animals. 15dPGJ2 seems to down regulate PGE2 and NO production that originate the inflammatory reaction in the streptozotocin-diabetic rat model. A disarrangement of the modulatory mechanisms is evidenced in the diabetic animals, originating an extended and uncontrolled ( cell destruction. IntroducciónEn la diabetes mellitus tipo I, la destrucción de las células productoras de insulina es un proceso rápido e irreversible. Los signos y síntomas progresan en forma simultánea con el daño tisular. De tal forma, las posibilidades preventivas y terapéuticas son muy limitadas o insatisfactorias, ya que no ofrecen una cura para la enfermedad y son en su mayoría insuficientes para prevenir las complicaciones secundarias asociadas con la deficiencia de insulina. La terapia paliativa posterior tiene un alto costo humano y económico, y los procesos degenerativos subsecuentes a la desaparición de la función pancreática endocrina en el organismo suelen ser múltiples y progresivos. Por lo expresado, es interesante plantear la posibilidad de terapias preventivas a través del conocimiento de los mecanismos de daño celular que se activan en la fase temprana del proceso. En una primera fase de la diabetes autoinmune, se liberan citoquinas (interleuquina 1ß, factor de necrosis tumoral Ó, etc.),¹ que a su vez favorecen el incremento in situ de compuestos vasoactivos tales como óxido nítrico (NO),^2,3 prostaglandinas inflamatorias de tipo E (PGE)^4-6 y especies reactivas de oxígeno (ROS).⁷ Estas sustancias participan en procesos necróticos y apoptóticos que tendrán por resultado la destrucción de las células ( de los islotes y la disfunción pancreática irreversible. Los modelos de diabetes experimental proveen una herramienta válida para analizar la presencia de agentes inflamatorios y los mecanismos de regulación en el desarrollo de la lesión del páncreas. La estreptozotocina (STZ) es un agente empleado para inducir diabetes experimental, dada su capacidad para dirigirse selectivamente y destruir las células ( de los islotes, productoras de insulina.⁸ Su efecto diabetogénico ha sido asociado a un incremento en las reacciones intracelulares de metilación y a una producción incrementada de NO y ROS.^9-12 Con la participación de nuestro grupo de trabajo hemos analizado los mediadores liberados en la destrucción de la célula ( por STZ en tejido pancreático e islotes aislados de rata. Se ha puesto especial énfasis en la evaluación del contenido de NO, Pgs y ROS, sus mecanismos modulatorios y la eventual interrelación que existe entre estos compuestos en el período temprano del proceso de destrucción pancreática. Trabajos recientes han informado que los ligandos naturales del receptor nuclear PPARgamma, tales como prostaglandina J2 (PGJ₂) y 15-deoxi-delta12,14 PGJ₂ (15dPGJ₂), de conocido efecto como promotores de la diferenciación de preadipocitos a adipocitos maduros¹³ y como moduladores del metabolismo lipídico,^14,15 pueden actuar también como inhibidores de enzimas como la NOS inducible y compuestos como el factor de necrosis tumoral (.^16,17 Aparecen in vivo durante la fase resolutiva de la inflamación, sugiriendo que podrían actuar como reguladores negativos de la respuesta inflamatoria. Se ha comprobado asimismo que PGJ₂ y sus derivados son capaces de inhibir la actividad de la enzima COX2 en varios tipos celulares, especialmente macrófagos, donde podrían bloquear la transcripción dependiente de NF(B.^18,19. En tal sentido, nuestro grupo ha postulado que los ligandos de PPARgamma podrían regular la producción pancreática de compuestos proinflamatorios tales como NO y Pgs, cuyos altos niveles originan y llevan a cabo la destrucción de las células ( en la patología diabética.Materiales y métodosAnimalesSe realizaron los experimentos con grupos de ratas hembras de la cepa Wistar sanas y con diabetes experimental tipo I, obtenidas mediante una única inyección de STZ i.p. de 60 mg.kg^-1 de peso. Las ratas fueron sacrificadas por dislocación cervical y el páncreas removido al quinto día posterior de la administración de STZ. Ciertos experimentos se realizaron aislando previamente los islotes pancreáticos luego de digestión tisular con colagenasa. Los tejidos control y diabéticos fueron previamente incubados en un baño metabólico con agitación bajo una atmósfera de 5% de CO₂ y 95% de O₂ durante 60 minutos, con el agregado de las sustancias indicadas en cada caso, y luego utilizados para los ensayos más abajo descriptos. Actividad de la enzima sintetizadora de óxido nítrico (NOS)La actividad de la NOS fue cuantificada en tejido pancreático y en islotes de ratas control y diabéticas con el agregado de (a) su inhibidor N^G-monometil-L-arginina (L-NMMA 600 (M), (b) la enzima removedora de radicales libres superóxido dismutasa (SOD), conjugada con polietilenglicol (PEG), con el objeto de optimizar su difusión y disminuir su tiempo de inactivación (1000 U/ml), (c) PGE₂ 10^-7 M, (d) indometacina (bloqueante de la enzima ciclooxigenasa, COX) 10^-6 M, o (e) 15dPGJ₂ (10^-5 M). Se realizó el dosaje mediante la evaluación de la conversión de ¹⁴[C]-arginina a ¹⁴[C]-citrulina, según fue descripto por Bredt y col.²⁰Actividad de la enzima superóxido dismutasa Se determinó la actividad de SOD según el método de Yamanaka y col.,²¹ modificado por Sun y col.²² Las muestras dosadas fueron incubadas previamente con la adición del dador de NO spermine NONOate (SN) 100 (M o con el inhibidor de la enzima NOS (L-NMMA) 600 (M, de acuerdo con el método de Yamanaka y col.,²¹ modificado por Sun y col.²² Peroxidación lipídicaLa evaluación del índice de peroxidación de lípidos, que origina malondialdehído, fue llevada a cabo mediante su cuantificación por ácido tiobarbitúrico (TBARs).²³ Las muestras fueron incubadas previamente en presencia de SN 100 (M o L-NMMA 600 (M. Cuantificación de nitratos/nitritos tisularesEstos productos estables de metabolización de NO reflejan los niveles originales del compuesto. Se han evaluado en tejido pancreático e islotes aislados incubados previamente en presencia de L-NMMA (600 (M), PEG-SOD (1 000 U/ml), indometacina (10^-6 M), PGE₂ (10^-7 M) y 15dPGJ₂ (10^-5 M), con previa reducción de nitratos a nitritos, por el método de Green.²⁴ Metabolismo del ácido araquidónico (AA)Se determinó el porcentaje de conversión de ácido araquidónico exógeno a diferentes eicosanoides: 6-ceto-PGF_1Ó, reflejando los niveles de prostaciclina (PGI₂), PGE₂, PGF_2Ó2 y TXB₂ (metabolito estable de TXA₂) por parte de tejido pancreático de ratas control y diabéticas, como se describió previamente.25 A los diferentes grupos se agregó L-NMMA 600 (M, SN 100 (M, o indometacina 10^-6 M al medio de incubación Determinación de PGE₂Se cuantificaron los niveles de PGE₂ en islotes aislados de ratas sanas y diabéticas con el agregado de 15dPGJ₂ (10^-5 M) al medio de incubación, mediante la técnica de radioinmunoanálisis. Cuantificación de 15dPGJ₂Se realizó mediante la técnica de enzimoinmunoensayo en islotes aislados de animales control y diabéticos, utilizando un equipo comercial para dicha determinación. EstadísticaLos resultados se expresan como promedios ( error estándar. Las comparaciones entre grupos se realizan empleando el test t de Student al comparar dos grupos de valores, y análisis de varianza de un factor al comparar más de un tratamiento, evaluado con el test de Tukey. En todos los casos la diferencia entre medias se considera significativa cuando el valor de p es igual o menor que 0.05 (n = número de preparados tisulares de animales diferentes).Resultados y discusiónI. Oxido nítrico en tejido pancreáticoNuestros resultados muestran que el contenido tisular de nitratos/nitritos, compuestos estables de óxido nítrico y la actividad de NOS es mayores en islotes aislados de ratas diabéticas por estreptozotocina que en animales sanos. Los datos sugieren, asimismo, que el agregado de sustancias antioxidantes al medio de cultivo de tejido pancreático origina un descenso significativo en los niveles de nitratos/nitritos y en la actividad de NOS en animales diabéticos (figuras 1A y 1B). Figura 1. Acción de los antioxidantes sobre los niveles de NO en el páncreas. (INSERTAR LAS FIGURAS 1A Y 1B)Panel A. Influencia de PEG-SOD sobre los niveles de nitratos/nitritos pancreáticos. Producción de nitrates/nitrites (nmol.mg.prot^-1) por tejido pancreático de rata sana (barras claras) y diabéticas (barras oscuras) incubado solo y en presencia de PEG-SOD (1 U.ml^-1). Los resultados se expresan como promedios y error estándar. (*) p < 0.05 vs. control; (#) p < 0.05 vs. diabéticos. Panel B. Influencia de PEG-SOD sobre la actividad pancreática de NOS. La actividad de NOS (Ca²⁺ dependiente, barras rayadas; Ca²⁺ independiente, barras claras) en pmol NO min^-1 por 100 mg de peso húmedo, de tejido pancreático de ratas control y diabéticas incubado solo o en presencia de PEG-SOD (1 U.ml^-1). Condiciones y detalles como en el panel A. (*) p < 0.05 vs. niveles basales de tejido incubado sin agregados. Si las porciones pancreáticas son incubadas en presencia de PGE₂, los niveles de nitratos/nitritos y la actividad de la sintetasa se incrementa, mientras dicho aumento es bloqueado por el agregado de indometacina, inhibidor de la enzima de síntesis de prostaglandinas. (figuras 2A y 2B). Figura 2. Efecto de la PGE₂ sobre la producción pancreática de óxido nítrico.(INSERTAR LAS FIGURAS 2A Y 2B)Panel A. Producción de nitratos/nitritos (nmol.mg.prot^-1) por tejido pancreático de rata control (barras claras) y diabético (barras oscuras) incubado solo y en presencia de indometacina (INDO) (10^-6 M) o PGE₂ (10^-7 M). Los valores se expresan como promedios y error estándar. (*) p < 0.05 vs. niveles basales; (#) p < 0.001 vs. control. Panel B. Actividad de NOS (Ca²⁺ dependiente, barras claras; Ca²⁺ independiente, barras oscuras) expresada como pmol NO min^{-1 por 100 mg de peso húmedo, en tejido pancreático aislado de ratas sanas y diabéticas por STZ, incubados solo o en presencia de INDO (10-6 M) o PGE₂ (10-7 M). Condiciones y detalles como en el panel A. (*) p < 0.05 vs. niveles basales; (**) p < 0.001 vs. niveles basales; (#) p < 0.001 vs. control.Estos resultados muestran que la alta producción de óxido nítrico en páncreas de ratas diabéticas por STZ parece ser el resultado de una capacidad antioxidante disminuida y de la modulación positiva de prostanoides inflamatorios de tipo E. Este efecto no se evidencia en tejidos de animales sanos. II. Prostaglandinas en tejido pancreáticoEn la figura 3 puede observarse que la producción de PGE₂, PGF_2Ó y TXB₂ a partir de ácido araquidónico exógeno se encuentra incrementada en tejidos provenientes de ratas diabéticas en relación a los niveles producidos por ratas sanas, mientras que la síntesis de 6-ceto PGF_1Ó se encuentra disminuida. El agregado de sustancias generadoras de NO en el medio de incubación (spermine NONOate) produce un incremento en la síntesis de TXB₂ en páncreas de animales sanos, mientras que PGF_2Ó, PGE₂ y TXB₂ aumentan en tejidos diabéticos (figura 3A). Cuando se agregan inhibidores de síntesis de NO (L-NMMA) al medio de incubación, la conversión de ácido araquidónico a 6-keto PGF_1Ó y a TXB₂ es menor en tejido sano, y la producción de PGF_2Ó, PGE₂ y TXB₂ disminuye en páncreas de ratas diabéticas (figura 3B). Figura 3. Prostanoides en tejido pancreático: influencia del óxido nítrico.(INSERTAR LAS FIGURAS 3A Y 3B) Panel A. Efecto de dadores de NO. Conversión de prostanoides a partir de [14C]-AA a 6-ceto PGF₁₍, PGF₂₍, PGE₂ y TXB₂ (en % cpm. 400 mg ph-1) por tejido pancreático aislado de ratas control y diabéticas, incubado solo (barras blancas) o en presencia de spermine NONOate (SN) 100 (M (columnas negras). Los valores se expresan como promedios y error estándar. (*) p < 0.01 vs. niveles basales; (#) p < 0.05 vs. control.Panel B. Efecto de inhibidores de NOS. Producción de prostanoides a partir de [14C]-AA a 6-keto PGF₁₍, PGF₂₍, PGE₂ y TXB₂ (en % cpm. 400 mg ph-1) por tejido pancreático aislado de ratas sanas y diabéticas, incubado solo (barras claras) o en presencia de SN 100 (M (columnas grises). Detalles y condiciones como en el panel A. (*) p < 0.05 vs. niveles basales; (#) p < 0.05 vs. control. Estos datos permiten concluir que los compuestos derivados del óxido nítrico incrementan la producción de prostaglandinas inflamatorias y aumentan la relación TXA₂:PGI₂, favoreciendo la síntesis de compuestos vasoconstrictores y antiagregantes en tejido pancreático proveniente de ratas diabéticas por STZ. III. Estado oxidativo en tejido pancreáticoNuestros resultados muestran que la inhibición de NOS produce un incremento en los niveles de SOD (disminuidos en ratas inyectadas con STZ), efecto evidenciado sólo en animales diabéticos (figura 4A). Se observa también que los niveles de lipoperoxidación son más altos en tejido pancreático de ratas diabéticas que en ratas sanas. El agregado de L-NMMA al medio de incubación produce una disminución en los niveles de lipoperóxidos, semejante a la que se observa en presencia de antioxidantes, la cual a su vez es abolida por la presencia de dadores de NO (figura 4B). Figura 4. Acción de compuestos nitridérgicos sobre el perfil oxidativo pancreático.(INSERTAR LAS FIGURAS 4A Y 4B)Panel A. Efecto de compuestos nitridérgicos sobre la actividad de SOD. Se determinó la actividad de la enzima superóxido dismutasa en tejido pancreático de ratas sanas (barras blancas) y diabéticas (barras negras) (U.mg.prot-1) en presencia de dadores de NO (SN 100 (M) y de inhibidores de su síntesis (L-NMMA 600 (M). Los valores se expresan como promedios y error estándar. (*) p < 0.05 vs. control; (#) p < 0.05 vs. diabéticos. Panel B. Efecto de compuestos nitridérgicos sobre la peroxidación lipídica pancreática. Se determinó el contenido de lipoperóxidos en tejido pancreático de ratas sanas (barras blancas) y diabéticas (barras negras) (nmol.mg.prot-1) en presencia de dadores de NO (SN 100 (M) y de inhibidores de su síntesis (L-NMMA 600 (M). Detalles y condiciones como en el panel A. (*) p < 0.05 vs. control; (#) p < 0.05 vs. diabéticos. Estas determinaciones parecen indicar que el bloqueo en la síntesis de NO produce una mejoría del estado oxidativo en tejido pancreático de animales STZ-diabéticos, no observándose efecto alguno en los tejidos de animales control. En conclusión, el desencadenamiento del daño pancreático por estreptozotocina parece involucrar el incremento de compuestos similares a los liberados en el tejido durante la fase temprana de la diabetes autoinmune insulinodependiente. En este modelo experimental observamos que en el animal diabético existe una regulación positiva entre los elevados niveles de óxido nítrico, prostaglandinas y especies reactivas de oxígeno, sugiriendo la ausencia de mecanismos de control que acoten el daño producido sobre las células ( pancreáticas, los cuales parecen en cambio estar presentes en la rata sana.IV. Ligandos de PPARgamma en islotes diabéticosHan sido cuantificados los niveles de 15-deoxi-delta12,14 PGJ₂ (15dPGJ₂) en plasma y en islotes aislados de ratas control y diabéticas por STZ (tabla 1), determinándose que el contenido de 15dPGJ₂ es menor en islotes de ratas diabéticas que en los animales sanos. (INSERTAR LA TABLA 1)La incubación de los islotes en presencia de 15dPGJ₂ exógena, origina un descenso en los niveles de nitratos/nitritos y en la actividad de NOS (figuras 5A y 5B, respectivamente), así como también una disminución en el contenido de PGE₂ en islotes de animales sanos y diabéticos (figura 6). Figura 5. Acción de 15dPGJ₂ en islotes pancreáticos aislados.(INSERTAR LAS FIGURAS 5A Y 5B)Panel A. Actividad de la NOS (Ca2+ dependiente, barras claras; Ca2+ independiente, barras oscuras, expresada como pmol NO min-1 por 100 mg de proteínas, en islotes de ratas sanas y diabéticas por STZ, incubados solos o en presencia de 15dPGJ₂ 10-5 M. Detalles y condiciones como en la figura 4. (*) p < 0.05 vs. niveles basales; (**) p < 0.001 vs. niveles basales; (#) p < 0.01 vs. control. Panel B. Niveles de nitritos/nitratos (en nmol.(g.prot-1) en islotes de ratas sanas y diabéticas por STZ, incubados solos o en presencia de 15dPGJ₂ 10-5 M. Detalles y condiciones como en la figura 4. (*) p < 0.05 vs. niveles basales; (**) p < 0.01 vs. niveles basales; (#) p < 0.05 vs. control. Figura 6. Efecto de 15dPGJ₂ sobre la síntesis de PGE₂.(INSERTAR LA FIGURA 6)Producción de PGE₂ por islotes de ratas sanas y diabéticas por STZ (en pg.(g.prot-1), incubados solos o en presencia de 15dPGJ₂ 10-5 M. Detalles y condiciones como en la figura 4. (*) p < 0.05 vs. niveles basales; (**) p < 0.001 vs. niveles basales; (#) p < 0.01 vs. control.En conclusión, 15dPGJ₂, análogo de PPARgamma, parece modular la producción de compuestos como PGE₂ y NO, que originan la reacción inflamatoria, necrosis y apoptosis de las células ( pancreáticas en la diabetes mellitus autoinmune y en la diabetes experimental. Los niveles de 15dPGJ2 se encuentran disminuidos en islotes aislados de ratas diabéticas por estreptozotocina, lo cual podría evidenciar un desajuste de este mecanismo limitante, extendiendo y perpetuando la lesión del páncreas endocrino en estos animales. Estos resultados forman parte de las siguientes publicaciones: * Elida González, Alicia Jawerbaum, Débora Sinner, Carolina Pustovrh, Carme Xaus, Gloria Gómez, Carmen Peralta, Joan Roselló-Catafau, Martha Gimeno (1999). «Evolution of streptozotocin-pancreatic damage in the rat: modulatory effect of endothelins on nitridergic and prostanoid pathway», Nitric Oxide 3(6):459-66, 1999. * González Elida, Jawerbaum Alicia, Sinner Debora, Pustovrh Carolina, Vela Jorge, Xaus Carme, Peralta Carmen, Roselló-Catafau Joan, Gimeno Martha. «Pancreatic nitric oxide and oxygen free radicals in early stages of streptozotocin diabetes mellitus in the rat», Braz J Med Biol Res 33:1335-1342, 2000.* Elida González, Joan Roselló-Catafau, Alicia Jawerbaum, Jorge Vela, Débora Sinner, Carolina Pustovrh, Verónica White, Carme Xaus, Carmen Peralta, Martha A.F. Gimeno. «Involvement of inducible isoforms of COX and NOS in streptozotocin-pancreatic damage in the rat: interactions between nitridergic and prostanoid pathway», Prost Leuk and Ess Fatty Acids 64(6):34-6, 2001. * Elida González, Alicia Jawerbaum, Débora Sinner, Carolina Pustovrh, Verónica White, Evangelina Capobianco, Carme Xaus, Carmen Peralta, Joan Roselló-Catafau. «Streptozotocin-Pancreatic Damage in the Rat: Modulatory effect of 15-deoxy-delta12,14 Prostaglandin J₂ on nitridergic and prostanoid pathway», Nitric Oxide (en prensa). ReconocimientosEste trabajo ha sido realizado con la participación de los integrantes del Laboratorio de Reproducción y Metabolismo del Cefybo (Dra. Alicia Jawerbaum, Lic Débora Sinner, Lic. Carolina Pustovrh, Lic. Verónica White y Lic. Evangelina Capobianco) y en colaboración con los Dres. Joan Roselló-Catafau, Carmen Peralta y Carmen Xaus del Instituto de Bioanalítica Médica de Barcelona, a quienes agradezco su valioso apoyo. Ha contado también con la excelente asistencia técnica de la Srta. María Ester Castro. Bibliografía1. Welsh N, Sandler S. Interleukin-1( induces nitric oxide production and inhibits the activity of aconitase without decreasing glucose oxidation rates in isolated mouse pancreatic islet. Biochem Biophys Res Commun 1992 182(1):333-40.2. Wilson GL, Patton NJ, McCord JM, Mullins DW & Mossman BT . Mechanisms of streptozotocin and alloxan-induced damage in rat (-cells. Diabetologia 1984, 27: 587-596. 3. Thomas WH, Kay, Helen E.Thomas, Leonard C Harrison, Janette Allison. The beta cell in autoimmune diabetes: many mechanisms and pathways of loss. TEM 2000 11 (1): 11-15. 4. Robertson RP. Dominance of cyclooxygenase-2 in the regulation of pancreatic islet prostaglandin synthesis. Diabetes 1998, 47: 1379-1383. 5. González E., Roselló-Catafau J., Suburo A., Jawerbaum A., Novaro V., Gimeno M.A.F. Effect of HOE 140 and L-NAME in metabolic impairment due to streptozotocin diabetes in rat. 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