Artículo completo
RESUMEN

Unos pocos pacientes afectados por enfermedades autoinmunes presentan un fenotipo clínico inusualmente complejo que afecta a varios órganos, que se manifiestan como síndromes hiperinmunes polirreactivos. Nuestro grupo recientemente estudió la muerte celular inducida por Fas y ceramida C2 en líneas de células T derivadas de tres pacientes con varios trastornos autoinmunes simultáneos, con el fin de definir si la regulación anormal de los mecanismos que gobiernan el programa de muerte celular del linfocito podría ser responsable de esta afección en niños. Se hallaron tres tipos de alteraciones: la primera se caracterizó por resistencia a Fas y ceramida C2; la segunda, por resistencia a Fas solamente y la tercera, por resistenia a ceramida C2, asociada a sensibilidad a Fas. A nivel molecular, en dos pacientes se halló una transcripción anormal, más larga, del intrón de retención 5 de la molécula Fas. Nuestros datos sugirieron que los síndromes autoinmunes polirreactivos pueden asociarse con alteraciones heterogéneas del sistema de inactivación de la respuesta inmunológica. Esta posibilidad fue confirmada por un estudio realizado en pacientes pediátricos con diabetes tipo 1 (DMT1), comprobando la resistencia a Fas en sujetos con DMT1 y una segunda enfermedad autoinmune. Una observación interesante fue hallar que el defecto también era frecuente en sujetos afectados de familias con elevada frecuencia de enfermedades autoinmunes (por ejemplo, con el síndrome autoinmune múltiple).

INTRODUCCIÓN

Unos pocos pacientes afectados por enfermedades autoinmunes presentan un síndrome hiperinmune polirreactivo, caracterizado por la manifestación diferentes enfermedades basadas en un mismo mecanismo autorreactivo.¹ La participación del sistema inmunológico en la patogenia de enfermedades autoinmunes individuales es una característica bien conocida. La relación con ciertos haplotipos HLA explica la predisposición a sufrir una enfermedad autoinmune individual;^2-4 no obstante, no se ha identificado el mecanismo íntimo que conduce en raros casos al desarrollo de hiperinmunidad polirreactiva. El primer ejemplo de estas afecciones hiperreactivas es el síndrome linfoproliferativo autoinmune (SLPA), caracterizado por autoinmunidad hematológica y linfadenopatías no malignas, con expansión de células T doblemente negativas (DN) TCR _/_ CD4-CD8-.^5-9 Este trastorno es congénito y se debe a mutaciones con pérdida de la función de los genes de Fas o de su ligando (FasL).La muerte celular programada o apoptosis es un mecanisno biológico finamente regulado, que ejerce una influencia supresiva sobre la respuesta inmunológica limitando la expansión clonal y participando en la selección negativa intratímica del repertorio de receptores de la célula T (TCR).^10-12 Fas es una molécula transmembrana perteneciente a la superfamilia del receptor TNF e interactúa con FasL, una molécula transmembrana tipo II. La unión a Fas induce la muerte celular programada en varias líneas de células linfoides y linfocitos T periféricos activados desde hace largo tiempo,¹³ mediante la activación de una vía de señalización de muerte que incluye a varias proteasas de cisteína conocidas como caspasas.^14,15 También se activa una ceramida productora de esfingomielinasa, que induce alteraciones mitocondriales probablemente mediadas por el gangliósido GD3,¹⁶ aunque su participación en la señalización de Fas aún es incierta.^17,18La deficiencia funcional de Fas también fue informada en niños con manifestaciones clínicas similares al SLPA, pero sin expansión de las células T DN ni mutaciones de Fas, indicando que la alteración de otras moléculas en la vía de señalización de Fas produce un síndrome semejante al SLPA.¹⁹ Esta posibilidad fue confirmada recientemente en dos pacientes con manifestaciones clínicas semejantes a las de aquel síndrome, en quienes se demostraron mutaciones de la caspasa 10.²⁰

MATERIAL Y METODOS

Evaluamos la muerte celular de linfocitos T inducida por Fas y ceramida en tres niños con diferentes enfermedades autoinmunes simultáneas para determinar si alguna alteración en el sistema de inactivación de estas células podría intervenir en la patogenia de la autoinmunidad polirreactiva intensa. Se seleccionaron dos pacientes con DMT1 por su asociación con trastornos autoinmunes severos que afectan a otros órganos. La paciente 1 tenía, además, enfermedad celíaca, enfermedad tiroidea autoinmune y artritis reumatoidea juvenil (ARJ) asociadas con DMT1. Presentaba anticuerpos antitiroideos circulantes. En el paciente 2 se diagnosticó DMT1 y esclerodermia localizada. Se identificaron anticuerpos antinucleares séricos. No se observaron otros signos de compromiso linforreticular. Una hermana de este niño desarrolló DMT1 pero no esclerodermia y no se detectaron autoanticuerpos antinucleares séricos. Sus padres no eran cosanguíneos. En la familia materna, dos personas sufrían AR y uveítis y tiroiditis autoinmune, respectivamente. El paciente 3 presentaba enfermedad celíaca, vasculitis, episodios recurrentes de fiebre con artritis e iridociclitis. Los tres presentaban hipergammaglobulinemia y en ninguno se detectó trombocitopenia o anemia hemolítica.Las moléculas de la superficie fueron evaluadas por inmunofluorescencia directa y análisis citofluorométricos. La muerte celular inducida por Fas o ceramida C2 fue estudiada, de acuerdo con lo informado anteriormente,¹⁹ en células T obtenidas mediante la activación de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) con fitohemaglutinina (PHA) en los días 0 y 15 y cultivadas en RPMI 1640 + FCS al 10% + interleuquina-2 recombinante (5 U/ml). La función de Fas se evaluó 6 días después de la segunda estimulación (21 días de cultivo) utilizando un anticuerpo monoclonal (MAb) anti-Fas (isotipo IgM). La supervivencia celular se examinó después de 18 horas contando las células vivas en cada placa mediante la prueba de exclusión de azul tripano y las apoptóticas, mediante la tinción con anexina V.

RESULTADOS

Debido a que la expansión de las células T DN es una característica de los ratones lpr/lpr y de los pacientes con SLPA, evaluamos estas células en los pacientes. Sólo uno presentaba un ligero aumento (5%), mientras que el otro tenía valores comparables con los controles sanos (< 1%). La evaluación funcional de la supervivencia celular se realizó analizando la muerte de células T inducida por Fas y ceramida. En todos los pacientes polirreactivos se observó una disminución de la respuesta de muerte celular ante el MAb anti-Fas, ceramida o ambos. No obstante, la naturaleza de la alteración fue diferente. En un paciente, ambos estímulos no indujeron en forma adecuada la muerte celular. En el otro, la inducción mediante el MAb anti-Fas estaba disminuida, mientras que la producida con ceramida fue normal. La muerte celular inducida por el MAb anti-Fas en el último paciente fue normal, pero la inducida por ceramida estaba disminuida. Los estudios moleculares del gen Fas revelaron que dos pacientes también tenían una transcripción más larga, con 152 bp, que conservaba el intrón 5, junto con el ADNc de tamaño normal. Esta transcripción anormal también era expresada por la madre y un hermano de un paciente. Por el contrario, el producto aberrante no pudo ser amplificado en controles normales. Es importante mencionar que la traducción del producto aberrante generaría una proteína que carece de la región transmembrana y que correspondería a una forma soluble de Fas.Debido a que dos de estos sujetos tenían DMT1, investigamos la función de Fas en las células T de 13 enfermos que sólo padecían DMT1 y de 19 con esta enfermedad y otras afecciones autoinmunes (DMT1 polirreactiva). Además, se estudiaron 19 sujetos con tiroiditis sola, debido a que la mayoría de los que presentaban DMT1 polirreactiva también sufrían tiroiditis. La frecuencia de la resistencia a la muerte celular inducida por Fas fue significativamente mayor en pacientes con DMT1 polirreactiva (73%) que en aquellos con DMT1 sola (23%), con tiroiditis sola (16%) o en controles normales (3%). Los niveles de Fas siempre se expresaron en valores normales y no se detectaron mutaciones en cuatro pacientes Fas-resistentes. La muerte celular inducida por ceramida en general fue normal. Varios familiares de dos pacientes Fas-resistentes también lo eran, sugiriendo que el defecto tiene un componente genético. Además, la fusión somática de células T de los sujetos Fas-resistentes y una línea celular continua Fas-sensible generó células híbridas Fas-resistentes, sugiriendo que la resistencia se debe a moléculas que ejercen un efecto dominante negativo sobre la función de Fas.El SLPA y la autoinmunidad polirreactiva serían modelos de patrones genéticos con fuerte tendencia a provocar autoinmunidad. Además, se caracterizan por perfiles autoinmunes heterogéneos, con el desarrollo de varias formas de autoinmunidad específica para cada órgano y de autoinmunidad sistémica. Una tercera manifestación con estas características es el síndrome autoinmune múltiple (SAM), que define a pacientes autoinmunes pertenecientes a familias con más de un caso de enfermedad autoinmune en familiares de primer o segundo grados. El análisis de la función de Fas en estos sujetos reveló una elevada frecuencia (alrededor de 50%) de resistencia a Fas.

CONCLUSIONES

Nuestros pacientes presentaron varias características similares al SLPA, aun cuando podrían intervenir diversos mecanismos patogénicos. Esta diversidad de alteraciones en los mecanismos reguladores de la supervivencia celular refleja la heterogeneidad de los mecanismos patogénicos responsables del SLPA. Una clasificación reciente designó como enfermedad tipo Ia y tipo Ib a la que se presenta con mutaciones de Fas y FasL, respectivamente; y como SLPA tipo II, a la variedad que carece de mutaciones de estos genes.²² Se describió disminución de la función de Fas en el SLPA tipo Ia con mutaciones del gen correspondiente y en el SLPA tipo II sin estas mutaciones.Por lo tanto, en los pacientes descriptos en este trabajo, la enfermedad manifiesta y la disminución de la función de la vía de muerte celular activada por ceramida (en 2 de ellos) podrían explicarse por la interferencia de otros genes que ejercerían su función después del paso correspondiente a Fas. También cabe mencionar que otras moléculas, como TNF, TRAIL y los sistemas de granzimas, participan en el programa de la muerte celular y utilizan vías apoptóticas que se superponen parcialmente con la de Fas.^23,24 En lo que respecta a la transcripción aberrante observada en dos pacientes, que conserva el intrón 5, codificaría una proteína trunca que carece de las regiones transmembrana e intracelular. Por el momento no es posible interpretar en forma concluyente este hallazgo, debido a que la misma alteración estaba presente en la madre y un hermano sanos del paciente. No obstante, la falta de concordancia entre la forma aberrante y el estado patológico es similar a la observada en pacientes con SLPA de tipo I, cuyos progenitores portadores de la mutación Fas suelen ser sanos, sugiriendo que la expresión completa de la función en cierta forma es redundante. Podría tratarse de una variante fisiológica o intervenir en la patogenia del síndrome. La producción de la forma putativa soluble de Fas podría inhibir su función in vivo y sería un cofactor para el desarrollo de enfermedad autoinmune polirreactiva cuando se asocia con otros factores genéticos o ambientales.En conclusión, opinamos que los síndromes autoinmunes polirreactivos son diferentes de las enfermedades autoinmunes individuales y que podrían estar asociados con diversas alteraciones del sistema de inactivación de la respuesta inmune. Modificaciones similares podrían producirse en el SLPA y el SAM.

BIBLIOGRAFIA

1- Jonsson V, Svendsen B, Vorstrup S et al; Multiple autoimmune manifestations in monoclonal gammopathy of undetermined significance and chronic lymphocytic leukemia; Leukemia 1996; 10:327-332.2- Brown MA, Wordsworth BP; Genetic studies of common rheumatological diseases; Br J Rheumatol 1998; 37:818-823.3- Nepom GT, Kwok WW; Molecular basis for HLA-DQ associations with IDDM; Diabetes 1998; 47:1177-1184.4- Fernandez-Arquero M, Caldes T, Casado E, Maluenda C, Figueredo MA, De La Concha EG; Polymorphism within the HLA-DQB1*02 promoter associated with susceptibility to coeliac disease; Eur J Immunogenet 1998; 25:1-3.5- Fisher GN, Rosenberg FJ, Straus SE et al; Dominant interfering Fas gene mutations impair apoptosis in a human lymphoproliferative syndrome; Cell 1995; 81:935-946.6- Rieux-Laucat F, Le Deist F, Hivroz C, Roberts IAG, Debatin KM, Fischer A, de Villartay JP; Mutations in Fas associated with human lymphoproliferative syndrome and autoimmunity; Science 1995; 268:1347-1349.7. Drappa J, Vaishnaw AK, Sullivan KE, Chu JL, Elkon KB; Fas gene mutation in the Canale-Smith syndrome, an inherited lymphoproliferative disorder associated with autoimmunity; N Engl J Med 1996; 335:1643-1649.8- Bettinardi A, Brugnoni D, Quiros-Roldan E, Malagoli A, La Grutta S, Correra A, Notarangelo LD; Missense mutations in the Fas gene resulting in autoimmune lymphoproliferative syndrome: A molecular and immunological analysis; Blood 1997; 89:902-909.9- Pensati P, Costanzo A, Ianni A et al; Fas/Apo1 mutations and autoimmune lymphoproliferative syndrome in a patient with type 2 autoimmune hepatitis; Gastroenterology 1997; 113:1384-1389.10- Blackman M, Kappler J, Marrack P; The role of the T cell receptor in positive and negative selection of developing T cells; Science 1990; 248:1335-1341.11- MacDonald HR, Lees RK; Programmed death of autoreactive thymocytes; Nature 1990; 343:642-644.12- Raff MC; Social controls on cell survival and cell death; Nature 1992; 356:397-400.13- Nagata S; Apoptosis by death factor; Cell 1997; 88:355-365.14- Cohen GM; Caspases: The executioners of apoptosis; Biochem J 1997; 326:1-16.15- Salvesen GS, Dixit VM; Caspases: intracellular signaling by proteolysis; Cell 1997; 91:443-446.16- De Maria R, Lenti L, Malisan F et al; Requirement for GD3 ganglioside in Fas and ceramide-induced apoptosis; Science 1997; 277:1652-1655.17- Hsu SC, Wu CC, Luh TY, Chou CK, Han SH, Lai MZ; Apoptotic signal of Fas is not mediated by ceramide; Blood 1998; 91:2658-2663.18- Watts JD, Gu M, Polverino AJ, Patterson SD, Aebersold R; Fas-induced apoptosis of T cells occurs independently of ceramide generation; Proc Natl Acad Sci USA 1997; 94:7292-7296.19- Dianzani U, Bragardo M, DiFranco D et al; Deficiency of the Fas apoptosis pathway without Fas gene mutations in pediatric patients with autoimmunity/lymphoproliferation; Blood 1997; 89:2871-2879.20- Wang J, Zheng L, Lobito A et al; Inherited human Caspase 10 mutations underlie defective lymphocyte and dendritic cell apoptosis in autoimmune lymphoproliferative syndrome type II; Cell 1999; 98:47-58.21- Brewer EJ, Bass J, Baum J; Current proposed revision of JRA criteria; Arthrit Rheum 1977; 20:195-199.22- Straus SE, Sneller M, Leonardo MJ, Puck JM, Strober W; An inherited disorder of lymphocyte apoptosis: the autoimmune lymphoproliferative syndrome; Ann Intern Med 1999; 130: 591-601.23- Cronin CC, Shanahan F; Insulin-dependent diabetes mellitus and coeliac disease; Lancet 1997; 349:1096-1097.24- Golstein P; Cell death: TRAIL and its receptors; Curr Biol 1997; 7:750-753.