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RESUMEN

Hemos evaluado 3 métodos automatizados para la medición de ácido ascórbico (AAs) en suero o plasma en un analizador Cobas Mira S (Roche Diagnostic System, Inc., Montclair, NJ, USA). Los métodos evaluados son los de ascorbato oxidasa (ASO), 4-hidroxi-2,2,6,6-tetrametilpiperidiniloxi (TEMPO, un radical libre estable) y el método ASO-3. Todos estos métodos se basan en la oxidación del AAs pero emplean distintos cromógenos. El método ASO utiliza suero desproteinizado, y los métodos TEMPO y ASO-3 utilizan suero fresco o plasma y no requieren desproteinización. Todos los métodos arrojan linealidad espectrofotométrica para AAs entre los 0.8 mg/l y los 100 mg/l. Los coeficientes de variación (CV) fueron casi iguales para los 3 métodos: 0.9 a 3.6% para los ensayos realizados en el mismo día y 3.4 a 7.1% para los realizados en días diferentes. Para los 3 métodos el porcentaje de recuperación analítica varió entre 91% y 102%. Todo el AAs y el ácido dehidroascórbico (ADAs) reaccionaron en los métodos ASO y TEMPO, pero no todo el ADAs reaccionó en el método ASO-3. La bilirrubina, el ácido úrico y la glucosa en concentraciones muy por encima de lo normal no interfirieron con ninguno de los métodos. Aunque la hemoglobina destruye al AAs, esta interferencia puede ser reducida por desproteinización en los métodos ASO y TEMPO. Los resultados obtenidos con los 3 métodos correlacionaron significativamente con los medidos por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC, p < 0.001). Los 3 métodos fueron confiables; con la automatización facilitarán el análisis de un gran número de muestras en los laboratorios clínicos. La velocidad de procesamiento es de 65 ensayos por hora con los métodos ASO y TEMPO y de 110 ensayos por hora con el método ASO-3.
Palabras clave. Medición de vitamina C, ácido ascórbico, ensayo automatizado, concentraciones fisiológicas de vitamina C, ingesta diaria recomendada. SUMMARY

We evaluated three automated methods for the assay of ascorbic acid (AsA) in serum or plasma in a Cobas Mira S analyzer (Roche Diagnostic System, Inc., Montclair, NJ, USA). The methods are based on (1) ascorbate oxidase (ASO), (2) 4-hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidinyloxy, a stable free radical (TEMPO method), or (3) the ASO-3 method. The methods are all based on the oxidation of AsA but with different color-forming reagents. The ASO method uses deproteinized serum, and the TEMPO and ASO-3 methods use fresh serum or plasma and do not require deproteinization. All methods gave linear spectrophotometric results for AsA from 0.8 mg/L to 100 mg/L AsA. The coefficients of variation (CV) were nearly the same for the three methods: 0.9-3.6% for within-day assays and 3.4-7.1% for between-day assays. Analytical recoveries were between 91 and 102% for the three methods. All the AsA and the dehydro-AsA (DAsA) reacted in the ASO and TEMPO methods. In the ASO-3 procedure, all of the AsA but not all the DAsA reacted. Bilirubin, uric acid, and glucose at concentrations well above normal did not interfere with any of the methods. Hemoglobin destroys AsA, but this interference can be reduced in the ASO and TEMPO methods by deproteinization. Our results for all three methods were significantly correlated with an HPLC method (p < 0.001). We found that all three methods are reliable; with the automation, they will facilitate the analysis of a large numbers of specimens in clinical laboratories. The test rate is 65 tests per hour with the ASO and TEMPO methods, and 110 test per hour with the ASO-3 method. INTRODUCCIÓN

El análisis de la vitamina C (ácido ascórbico, AAs) en suero o plasma es importante como indicador del estado nutricional de AAs. Aunque en la literatura se informan métodos para medir AAs por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), los mismos son muy laboriosos y no adecuados para el análisis de muchas muestras. Uno de nuestros objetivos fue evaluar 3 métodos espectrofotométricos automatizados para la medición de AAs en suero o plasma (figura 1) [1-3]. (INSERTAR LA FIGURA 1)Figura 1. Reacciones que tienen lugar en los 3 métodos automatizados para la medición de ácido ascórbico en suero o plasma. ASO, ascorbato oxidasa; AAs, ácido ascórbico; ADAs, ácido dehidroascórbico; OPD, o-fenilendiamina; TEMPO, 4-hidroxi-2,2,6,6-tetrametilpiperidiniloxi, radical libre; MCDP, 10-N-metilcarbamoil-3,7-dimetilamino-10H-fenotiazina; HRP, peroxidasa. El método de la ascorbato oxidasa (ASO) se basa en la oxidación del AAs a ácido dehidroascórbico (ADAs), el cual reacciona con la o-fenilendiamina (OPD) para formar derivados de quinoxalina que absorben a 340 nm. El incremento de absorbancia a 340 nm es proporcional a la concentración de AAs [1]. El segundo método (TEMPO), comercializado por Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA o por Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japón, se basa en la oxidación de AAs por el radical libre estable 4-hidroxi-2,2,6,6-tetrametilpiperidiniloxi. La reacción con OPD para formar derivados de quinoxalina es igual que en el método ASO [2]. El tercer método (ASO-3) se basa en l oxidación del AAs a ADAs y peróxido de hidrógeno por ASO recientemente formada (ASO-3). El peróxido de hidrógeno que se forma es cuantificado con peroxidasa de rábano picante y con el cromógeno 10-N-metilcarbamoil-3,7-dimetilamino-10H-fenotiazina (MCDP). El incremento de la absorbancia se debe al azul de metileno que se forma y se mide a 660 nm [3]. Para evaluar el desempeño analítico de los 3 métodos utilizamos el autoanalizador Mira S de Roche Diagnostic System, Inc., Montclair, NJ, USA). MATERIALES Y MÉTODOS

Método ASO
Se mezclan 20 µl de una solución de ácido metafosfórico al 40%, utilizada para desproteinizar las muestras, con 200 µl de suero, plasma o calibrador. Se incuba a 25 °C por 10 minutos y se centrifuga a 12,000 x g por 5 minutos o hasta que se obtiene un sobrenadante claro. Se dispensan en cada cubeta de reacción 200 µl de la solución de ASO (80 mg/l en buffer fosfato 0.1 M, pH 6.5). Se agregan 25 µl de la muestra desproteinizada y se enjuaga la pipeta con 10 µl de buffer fosfato que se agregan a la misma cubeta. El autoanalizador realiza el mezclado en forma automática. Se incuba por 5 minutos a 37 °C para permitir la oxidación de todo el AAs a ADAs. Se agregan 85 µl de OPD (5 mg de OPD en 10 ml de buffer fosfato 0.1M, pH 6.5), seguido del enjuague de la pipeta como se describiera anteriormente. Se mide la absorbancia a 340 nm cada 25 segundos durante 5 minutos. El cambio de absorbancia es directamente proporcional a la concentración de AAs (figura 2, panel izquierdo). Se utiliza el buffer fosfato como blanco de reacción para corregir cualquier cambio inespecífico en la absorbancia y se usa una solución de AAs de 25 mg/l como calibrador. La concentración de esta última se controla midiendo su absorbancia a 245 nm, la longitud de onda correspondiente al pico de absorción del AAs en soluciones ácidas; se utiliza 1.22 x 104 como índice de extinción molar [4]. Método TEMPO
Para el método TEMPO, todas las condiciones del autoanalizador son las mismas que en el método ASO, salvo que se reemplaza la solución de ASO por una solución de TEMPO de 200 mg/l en buffer fosfato. Dado que tanto ASO como TEMPO oxidan AAs a ADAs [5] y que el ADAs endógeno en suero también reacciona con OPD, los valores obtenidos con ambos métodos corresponden al AAs total, es decir a la suma de AAs y ADAs. En el método TEMPO se analizaron muestras de suero o plasma heparinizado sin desproteinización previa (figura 2, panel central). Método ASO-3
En el método ASO-3 se dispensan en las cubetas 180 µl de reactivo tamponado conteniendo MCDP 0.073 mM en buffer de Good pH 5.5. A continuación se agregan 3 µl de suero, plasma o calibrador y se enjuagan las pipetas con 10 µl de agua destilada. Luego del mezclado automático en el aparato, se incuba por 3 minutos a 37 °C. Se agregan 90 µl del reactivo de inicio, que contiene 200 kU/l de ASO-3 y 1 kU/l de peroxidasa en buffer de Good pH 5.5. Se enjuaga la pipeta con 5 µl de agua destilada. Se mide la absorbancia a 660 nm cada 25 segundos por 4 minutos; el cambio es proporcional a la concentración de AAs. En este método sólo se mide la forma reducida de AAs (figura 2, panel derecho). En el método ASO-3 la formación de azul de metileno es rápida y la reacción se completa en 60 segundos.(INSERTAR LA FIGURA 2)Figura 2. Perfiles temporales de las reacciones para ácido ascórbico en el autoanalizador Mira S de Roche. El reactivo tamponado en el método ASO contiene ascorbato oxidasa (ASO), mientras que en el método TEMPO contiene al reactivo del mismo nombre. En ambos métodos el reactivo disparador es OPD. En el método ASO-3 el reactivo tamponado contiene MCDP y el reactivo disparador tiene ASO-3 y peroxidasa. Método HPLC
Se utilizó HPLC para confirmar los valores de AAs obtenidos con los métodos espectrofotométricos automatizados. El aparato de HPLC tiene una bomba LC-10A, un detector electroquímico LC-4C y un sistema controlador SCL-10A, todos de Shimadzu (Kyoto, Japón). Para el análisis de AAs total se combinan 100 µl de suero con 50 µl de solución de ditiotreitol (10 g/l) y 50 µl de ácido metafosfórico al 10%. Se mezclan 100 µl de suero o calibrador con 100 µl de ácido metafosfórico al 5%. Luego de reposar por 10 minutos a temperatura ambiente se centrifuga la mezcla a 12000 xg por 5 minutos o hasta obtener un sobrenadante claro. Se diluye el sobrenadante 10 a 20 veces con ácido metafosfórico 0.5% y se inyectan 100 µl en una columna de HPLC Inertsil ODS-2. Las mejores separaciones se lograron con elución isocrática con una solución de fosfato potásico 30 mM pH 2.3 que contenía 100 mM de EDTA a un flujo de 0.7 ml/minuto. Para monitorear el eluido se utilizó un detector amperométrico con un potencial de 600 mV.RESULTADOS

Curso temporal de los cambios de absorbancia
En la figura 2 se muestran las variaciones de absorbancia a lo largo del tiempo con los 3 métodos analizados. En los métodos ASO y TEMPO el autoanalizador monitorea el cambio de absorbancia y utiliza el intervalo en el que la velocidad se vuelve constante dentro de ciertos límites. La línea de mejor linealidad se calcula con un programa del autoanalizador que emplea cuadrados mínimos. Límite de detección y linealidad
Se prepararon una serie de diluciones de AAs en agua destilada entre 0.2 mg/l y 10.0 mg/l y se las ensayó 5 veces con los 3 métodos para determinar la media y los desvíos estándar (DE) de cada dilución. Los métodos arrojaron resultados lineales hasta cerca de 0.4 mg/l. El límite de detección se estimó en 0.8 mg/l ya que los rangos de media ± 2DE de las soluciones 0.4 mg/l y 0.8 mg/l se superponían levemente. La linealidad de los 3 métodos fue suficiente para cubrir una amplio espectro de valores de AAs, desde una concentración deficiente hasta valores mucho mayores que los hallados en individuos normales. Absortividad
Se determinó la absortividad (coeficiente de extinción molar) de los 3 métodos utilizando soluciones de AAs de 1.0 mg/l y cubetas de 1 cm de paso. A 25 °C el coeficiente fue de 0.0015 para los métodos ASO y TEMPO y de 0.0034 para el método ASO-3. Este último arrojó la mayor cantidad de color por mg de AAs. Reproducibilidad
Se prepararon 2 pooles de sueros, a uno de los cuales se les agregó AAs y al otro no. Ambos fueron alicuotados y conservados a -80 °C hasta el momento del análisis. Estas muestras fueron analizadas 10 veces cada día por cada uno de los 3 métodos para determinar el DS dentro del día, y fueron analizadas 1 vez al día durante 10 días para determinar la variación entre días. Los datos de control de calidad se muestran en la tabla 1. La imprecisión es mayor entre días que dentro del mismo día, probablemente por algún grado de pérdida de AAs durante el decongelamiento de las alícuotas. (INSERTAR LA TABLA 1)Estudios de recuperación
Se realizaron estudios de recuperación analítica mediante el agregado de 0.5 ml de soluciones de AAs de 8.0 mg/l y 16.0 mg/l a 0.5 ml de 2 pooles de suero con concentraciones endógenas cercanas a 2.0 mg/l y 7.2 mg/l. Se determinó la concentración total de AAs por los métodos ASO y TEMPO. La recuperación analítica varió entre 95% y 101% con el método ASO y entre 91% y 102% con el método TEMPO. Con el método ASO-3, los porcentajes de recuperación variaron entre 96% y 99%. Cuando se analizaron por los 3 métodos soluciones acuosas de AAs y ADAs se recuperó el 100% del AAs; la recuperación de ADAs fue del 100% con los métodos ASO y TEMPO pero fue menor al 2% con el método ASO-3. Esto indicaba que los métodos ASO y TEMPO arrojan la concentración total de AAs (AAs más ADAs) mientras que el método ASO-3 sólo mide AAs. Evaluación de posibles interferencias
Se investigó el efecto de posibles interferencias (hemoglobina, bilirrubina, ácido úrico y glucosa) en los 3 métodos. La hemoglobina humana a concentraciones de hasta 5 g/l no tuvo efecto sobre los valores de AAs medidos con el método ASO. En el método TEMPO, los valores de AAs fueron disminuidos por la presencia de hemoglobina; la recuperación fue del 94% con niveles de hemoglobina de 1.25 g/l y del 68% con niveles de hemoglobina de 5 g/l. En el método ASO-3, los valores de AAs también fueron reducidos por la hemoglobina. A concentraciones de hemoglobina de 1.25 g/l la recuperación fue del 94%, mientras que con niveles de 5 g/l fue del 51%. La hemoglobina a concentraciones de 2.5 g/l y 5 g/l tuvo menor efecto cuando se utilizaron muestras de suero o plasma desproteinizadas en el método TEMPO: la recuperación fue del 99% y el 97%, respectivamente. Sin embargo, dado que la oxihemoglobina puede oxidar el AAs a ácido 2,3 diceto-L-gulónico, en los especímenes conservados a temperatura ambiente por 2 horas y analizados por el método ASO la pérdida de AAs ante niveles de hemoglobina de 1.25 mg/l, 2.5 mg/l y 5 mg/l fue del 8%, el 29% y el 66%, respectivamente. También se halló que la bilirrubina a 56 mg/l en NaOH 0.1 M, el ácido úrico a 80 mg/l en NaOH 0.1 M y la glucosa a 3 g/l no tuvieron efectos significativos sobre los valores de AAs medidos con los 3 métodos. Correlación con los valores obtenidos por HPLC
Los niveles de AAs medidos por los métodos ASO y TEMPO en 56 sueros fueron comparados con los obtenidos mediante HPLC (figura 3, izquierda y centro). Los resultados del método ASO correlacionaron bien con los medidos por HPLC en valores que iban de 2.3 mg/l a 15.9 mg/l. La ecuación de regresión para el método ASO es Y = 0.94 X (método HPLC) + 0.4, r = 0.969, p < 0.001, Sy.x = 0.7 mg/l. Para el método TEMPO, la ecuación es Y = 0.79 X (método HPLC) + 2.4, r = 0.953, p < 0.001, S y.x = 0.7 mg/l. En promedio, los valores obtenidos con los métodos ASO y TEMPO fueron 0.8 mg/l mayores que los medidos por HPLC. También se compararon los valores obtenidos con el método ASO-3 con los medidos por HPLC. La correlación se muestra en la figura 3, panel derecho: Y = 0.97 X (método HPLC) + 1.1, r = 0.955, p < 0.001, Sy.x = 0.8 mg/l. En promedio, los valores obtenidos con el método ASO-3 fueron 0.9 mg/l superiores a los medidos por HPLC (p < 0.001). (INSERTAR LA FIGURA 3)Figura 3. Comparación entre las concentraciones de AAs en 56 sueros medidas por los 3 métodos automatizados y las obtenidas por HPLC. AAs total significa AAs más ADAs. Concentraciones de AAs en voluntarios
Como nutriente necesario, el AAs debe estar presente en la dieta de los humanos ya que éstos no pueden sintetizarlo. Investigamos la cantidad de AAs que debe ser ingerido diariamente por los japoneses adultos para alcanzar los niveles plasmáticos totales de AAs medidos por nosotros con los 3 métodos. Además, queríamos estimar si el AAs presente en una dieta controlada es suficiente para incrementar los niveles plasmáticos hasta las concentraciones recomendadas. Se determinaron los niveles séricos totales de AAs en 54 mujeres universitarias jóvenes sanas (18 a 22 años) antes y después de que consumieran una dieta controlada. Las participantes tomaron 90 mg de AAs en los 3 días previos al comienzo de la dieta controlada. En ese momento, sus niveles plasmáticos de AAs total medidos por HPLC iban de 4.7 a 19.3 mg/l (media 9.7 mg/l, DE 2.7 mg/l) y los valores medidos por el método ASO variaban entre 4.9 y 16.6 mg/l (9.9 ± 2.6 mg/l). La variación interindividual, expresada como 100 x DE/media, fue del 29% por HPLC y del 26% por el método ASO. Los niveles plasmáticos de AAs correlacionaron escasamente con la cantidad de AAs en la dieta de 90 mg diarios; la ecuación de regresión fue Y (AAs por el método ASO) = 0.013 X (ingesta diaria media de AAs) + 8.6, r = 0.373, p < 0.01, Sy.x = 2.4 mg/l (figura 4). (INSERTAR LA FIGURA 4)Figura 4. Relación entre la ingesta de AAs y las concentraciones plasmáticas totales de AAs. La ingesta de AAs fue calculada a partir de la dieta consumida por las participantes en los 3 días previos al inicio de una dieta controlada de 150 mg diarios de AAs. Las concentraciones plasmáticas de AAs fueron determinadas por el método ASO. La ecuación de regresión es Y (AAs plasmático) = 0.013 X (ingesta diaria promedio de AAs) + 8.6, r = 0.373, p < 0.01, Sy.x= 2.4 mg/l. Luego de la administración por 3 días sucesivos de una dieta controlada que contenía 150 mg de vitamina C, la variación interindividual de AAs total se redujo al 17% en las mediciones por HPLC y al 15% en el método ASO. La concentración plasmática total de AAs pasó a variar entre 6.2 y 13.5 mg/l (10.4 ± 1.7 mg/l) por HPLC y entre 5.8 y 12.5 mg/l (10.0 ± 1.5 mg/l) por el método ASO. A partir de estos datos se estimó que el rango de referencia de AAs es de 7.0 a 13.8 mg/l (media ± 2 DE) con HPLC y de 7.0 a 13.0 mg/l con el método ASO. Entre las voluntarias, 48 (89%) tuvieron una concentración plasmática total de AAs mayor a 7.0 mg/l antes del inicio de la dieta controlada, tanto por HPLC como por método ASO. Seis voluntarias tenían deficiencia de AAs (tabla 2). (INSERTAR LA TABLA 2)Una dieta que aportaba 150 mg de AAs diarios es levemente superior a la ingesta diaria recomendada de 100 mg diarios de AAs para los japoneses adultos [7]. Luego de la dieta controlada, las concentraciones plasmáticas de AAs total de 5 de las voluntarias con deficiencia pasaron a ubicarse dentro del rango de referencia de 7.0 a 13 mg/l (tabla 2). Unas pocas voluntarias con niveles de AAs superiores a 13 mg/l volvieron a valores dentro del rango de referencia al cabo de 3 días de dieta controlada. Se estima que entre el 97% y el 98% de las personas con una cantidad adecuada de AAs en su dieta deberían tener concentraciones normales de AAs en plasma o suero [7]. En 53 voluntarias (98%) las concentraciones plasmáticas de AAs total se ubicaron dentro del rango de referencia a las 72 horas de iniciada la dieta controlada. (INSERTAR LA TABLA 2)DISCUSIÓN

Vuilleumier y Keck [6] desarrollaron un ensayo automatizado para la medición de AAs utilizando un analizador centrífugo (Cobas Bio, Roche Diagnostic Systems, Inc.) con la capacidad de medir fluorescencia. Su método se basa en la oxidación de AAs a ADAs por la ASO; el ADAs es condensado con OPD para formar un derivado de quinoxalina que constituye el fluoróforo. Dado que la mayoría de los autoanalizadores de los laboratorios clínicos no están equipados con un detector de fluorescencia, nosotros medimos la absorbancia a 340 nm del derivado de quinoxalina. El método TEMPO es menos oneroso que el método ASO; el costo de los reactivos para el primero es cercano a 1 centavo de dólar por ensayo. El autoanalizador Mira permitió ensayar 65 muestras por hora y ambos reactivos fueron estables a 4 °C por al menos 4 semanas. No se necesita preparar cada día las soluciones de TEMPO, OPD y buffer fosfato. Sin embargo, el calibrador de AAs fue preparado fresco cada día y se confirmó su concentración mediante absorbancia UV. También evaluamos un método de ASO-3 (Kyowa Medex, Tokio) que incluye todos los reactivos y un calibrador estable de AAs. En este método, el reactivo tamponado y la solución de inicio fueron estables por al menos 2 semanas luego de reconstituidos y el analizador Mira permitió el análisis de 110 muestras por hora. En los métodos TEMPO y ASO-3 se omitió la desproteinización. La hemoglobina de los sueros hemolizados interfiere con los 3 métodos. El método TEMPO permite el análisis de sueros desproteinizados con ácido metafosfórico, lo cual no es posible con el método ASO-3 porque las reacciones con el MCDP y la peroxidasa se inhiben a pH ácido. El AAs fue bastante estable en el suero desproteinizado. En el suero hemolizado, el AAs exhibió un disminución cercana al 5% por hora a 4 °C cuando la concentración de hemoglobina era de 1.25 g/l. Los resultados obtenidos por HPLC a partir de suero desproteinizado fueron comparables a los valores arrojados por el método TEMPO; la ecuación de regresión es Y (método TEMPO) = 1.00 X (HPLC), r = 0.994, p < 0.001, Sy.x = 0.3 mg/l (no mostrado). Los métodos basados en HPLC pueden ser altamente precisos pero son demasiado laboriosos como para ensayar un gran número de muestras. Además, el equipamiento necesario no siempre está disponible en los laboratorios clínicos de rutina. Los 3 métodos aquí descriptos son confiables y con la automatización facilitarán el análisis de un gran número de muestras en los laboratorios clínicos.AGRADECIMIENTOS

Los autores agradecen al Dr. John A. Lott, profesor de patología en la Ohio State University, Medical Center, Columbus, por su ayuda en la preparación de este trabajo y las útiles sugerencias para su mejoramiento. BIBLIOGRAFÍA

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