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RESUMEN

Recientemente se ha sugerido que la cistatina C (CC) humana, un potente inhibidor de las cisteinproteinasas, sería un marcador del índice de filtración glomerular (IFG) más eficiente que la creatinina. Con la finalidad de determinar como la enfermedad, la terapia, el ritmo circadiano y la función renal influyen sobre la concentración sérica de CC, se analizaron los patrones de concentración plasmática de la proteína y de creatinina en muestras obtenidas cada 4 horas durante 24 horas en sujetos con asma, dependientes e independientes de los corticoides, antes y después de una semana de tratamiento con metilprednisolona y ciclosporina A. Por primera vez se demostró en un estudio clínico el impacto de ambas drogas sobre la concentración sérica de CC: la metilprednisolona aumentó y la ciclosporina redujo los niveles de la proteína. El tiempo ejerció poco o ningún cambio sobre las concentraciones de CC y creatinina, en personas sanas y en pacientes asmáticos, lo que indica que el momento de la toma de la muestra no afecta los resultados de las mediciones cuantitativas a lo largo del día. En los enfermos con asma se detectaron niveles significativamente más altos de CC que en los controles. El fenómeno no se acompañó de modificaciones en la concentración sérica de creatinina, hecho que avala la realización de estudios para establecer el valor de la CC como marcador del IFG en asmáticos. A su vez, la mayor concentración de CC en enfermos sugiere su participación en la etiopatogenia de la enfermedad.
Drogas. Metilprednisolona, ciclosporina A.
Palabras clave. Cistatina C, creatinina, asma, suero, ritmo circadiano. ABSTRACT

Human cystatin C, a potent inhibitor of cysteine proteinases, has been recently proposed to be a better marker of glomerular filtration rate than creatinine. In order to determine the effect of asthma pathogenesis, therapy, circadian rhythm and renal function on serum cystatin C the 24-hour concentration patterns of cystatin C and creatinine were followed in samples collected every 4 h from steroid-independent and steroid-dependent asthmatics before and after one-week treatment with methylprednisolone and cyclosporin A. For the first time the effect of two drugs on cystatin C was demonstrated in a clinical study; methylprednisolone increased and cyclosporin A decreased serum cystatin C concentrations. Little or no significant effects of time on cystatin C and creatinine concentrations were observed in healthy and asthmatic sera indicating that the time of blood sampling does not compromise the results of quantitative measurements over the course of a day. Significantly higher cystatin C concentrations were found in asthmatic patients compared to controls accompanied by no apparent changes in serum creatinine, which supports the need for further evaluation of cystatin C as a marker of glomerular filtration rate determination in asthma. Additionaly increased serum concentrations of cystatin C in asthmatic patients suggests its role in the pathogenesis of asthma. CISTATINA C, UN POTENTE INHIBIDOR DE LAS CISTEINPROTEINASAS

La cistatina C (CC) humana es una proteína básica, no glucosilada y de bajo peso molecular, perteneciente a la superfamilia de los inhibidores de las cisteinproteinasas [1,2]. La CC es el inhibidor más potente de las proteinasas lisosomales: catepsinas B, H, L y S, aparentemente con constante de inhibición por debajo de concentraciones nanomolares, lo cual también fue demostrado en nuestros estudios cinéticos con CC humana recombinante [1,3]. Se ha propuesto que la CC, junto con otras cistatinas, participa en los mecanismos primarios de defensa contra la destrucción proteolítica tisular mediante la formación de complejos inhibitorios con las cisteinproteinasas. Debido a la amplia distribución extracelular de la CC y por su función antiviral en experimentos con poliovirus, herpes simplex y coronavirus, se le ha atribuido un papel antimicrobiano y antiviral [4-7]. Sin embargo, también hemos reportado un modo no inhibitorio de interacción entre la CC y las cisteinproteinasas. En el modelo, la catepsina L corta a la CC a nivel de Gly11-Gly12 después de la formación del complejo [8]. Asimismo, se observó una amputación distinta N-terminal de la CC en varios estados patológicos, lo cual se asoció con pérdida significativa de su afinidad por la enzima blanco [9,10]. La formación de dímeros de CC se acompaña de una pérdida completa de su actividad biológica [11]. Los eventos tendrían una gran importancia fisiológica al controlar el grado de inhibición de las cisteinproteinasas en procesos patológicos. Una función adicional de la CC parece ser la inhibición de la legumaína humana, otra cisteinproteinasa la cual, al igual que la catepsina S, estaría involucrada en la presentación de antígenos por moléculas de histocompatibilidad clase II [12-14]. Además, se ha sugerido que la CC ejerce un papel regulatorio en los procesos inflamatorios al reducir el estallido respiratorio, asociado con la fagocitosis, en neutrófilos. La respuesta quimiotáctica de estas células también se reduciría [15]. También se ha propuesto que la CC podría aumentar la expresión de óxido nítrico en macrófagos peritoneales [16]. La CC se expresa en la mayoría de los tejidos y se la ha encontrado en cantidades apreciables en todos los fluidos corporales [2,17,18]. En algunos compartimientos (como el líquido cefalorraquídeo) la CC representa más del 90% de los inhibidores de cisteinproteinasas mientras que, en plasma, sólo representa un pequeño porcentaje de la capacidad inhibitoria de aquellas. Se ha visto que la concentración de CC en fluidos extracelulares tiene importancia clínica. Así, el nivel anormalmente bajo de CC en líquido cefalorraquídeo podría ser un marcador diagnóstico de la angiopatía amiloide hereditaria por CC, una enfermedad hereditaria transmitida en forma dominante caracterizada por el depósito de CC como fibrillas amiloides en los vasos sanguíneos. El fenómeno originaría la muerte por hemorragia cerebral [19,20]. A su vez, se han encontrado niveles elevados de CC en el suero de pacientes con enfermedades autoinmunes y sujetos dializados [1, 21]. El hecho de que la CC, una proteína de bajo peso molecular, se produce en forma estable en todas las células nucleadas, se filtra libremente en los glomérulos renales y se reabsorbe y cataboliza casi por completo en los túbulos proximales ha sugerido que su concentración sérica podría ser un marcador potencialmente útil del IFG. De hecho, recientemente se comprobó que la CC plasmática es un marcador del IFG igual o superior a la creatinina en suero, especialmente en pacientes con disminución leve o moderada del IFG [22,23]. Más aún, a diferencia de la creatinina, la CC no está influida por el sexo y la masa muscular; y su producción estaría afectada por factores extrarrenales en menor grado que la de creatinina. EFECTO DE LA PATOLOGÍA ASMÁTICA SOBRE LOS NIVELES SÉRICOS DE CISTATINA C

Se ha sugerido que las cisteinproteinasas y sus inhibidores estarían asociados con la etiopatogenia de diversas entidades, pero la influencia que ejercen los estados patológicos sobre su concentración aún no se ha estudiado ampliamente. Se reportó que la CC circulante no se altera durante procesos inflamatorios o patología neoplásica. Sin embargo, nuestras observaciones revelaron una correlación significativa entre el incremento de los niveles de CC y la progresión del melanoma y cáncer colorrectal [24-26]. Posteriormente extendimos el estudio a individuos con asma, en quienes se determinó la concentración de CC con un equipo comercial de enzimoinmunoensayo (ELISA) específico y sensible, desarrollado en nuestro laboratorio (Krka d.d., Novo mesto, Eslovenia; http://www.krka.si/en/zdravila/imuno/). En el estudio, los enfermos asmáticos se dividieron en dos grupos. Uno incluyó pacientes sin dependencia esteroidea y sin uso regular de esteroides sistémicos, mientras que el otro abarcó enfermos con asma atópica dependientes de esteroides y con necesidad continua de corticoides por vía oral, durante más de 10 años, en promedio. La patología asmática es una de las enfermedades crónicas más frecuentes en todo el mundo. Se caracteriza por inflamación crónica de la vía aérea, acumulación de plasma en la luz bronquial, secreción local anormal de proteínas y remodelamiento de la pared bronquial. La gravedad aún está escasamente definida y la enfermedad es difícil de manejar y controlar. El papel exacto de las enzimas proteolíticas, en asma, aún no se comprende por completo. Los datos avalan la teoría de que tanto las serinproteinasas como las metaloproteinasas intervienen en la etiopatogenia del asma. Sin embargo, se ha prestado poca atención a la participación de las cisteinproteinasas (catepsinas B, H, L y S) y sus inhibidores endógenos, como estefina A y B y CC. Debido a que se ha demostrado su relación con inflamación, remodelamiento tisular y estados patológicos caracterizados por excesiva respuesta inmune frente a antígenos exógenos, no es improbable que participen también en asma.Ciertamente, nuestro último estudio encontró alteraciones en el balance entre las cisteinproteinasas séricas y sus inhibidores en pacientes con asma, en comparación con controles [27,28]. También demostramos el efecto de la enfermedad sobre la concentración de CC [29]. Los niveles séricos de CC se estudiaron en controles normales y en personas con asma dependiente e independiente de esteroides, con la finalidad de establecer su posible utilidad diagnóstica. El análisis comparativo indicó que la concentración de CC permitía distinguir entre controles y enfermos con asma; la CC fue 1.5 veces superior en los últimos. Asimismo, se detectó un aumento significativo de la concentración de CC en pacientes asmáticos dependientes de esteroides en comparación con sujetos sin dependencia de corticoides. En los controles y en los pacientes, la concentración molar de inhibidores de bajo peso molecular, especialmente CC, estuvo significativamente por encima de la de sus blancos: catepsina B, H, L y S con lo que se asegura una inhibición eficaz. Recientemente reportamos una mayor concentración de catepsina H en asmáticos [27]. Si bien es demasiado pronto para sugerir un papel de las cisteinproteinasas y sus inhibidores en la etiopatogenia del asma, podemos especular que el incremento de la CC coincide con los mayores niveles de catepsina H y sugeriría la participación de ambas en la patogenia del asma. La catepsina H podría intervenir en los eventos proteolíticos del remodelamiento tisular, un hallazgo común en la enfermedad. Por otro lado, observamos una tendencia a valores más bajos de catepsina S en el suero de asmáticos en comparación con controles. Debido a que en la enfermedad asmática hay exageración de las respuestas inmunes, el balance entre la catepsina S y la CC podría ser importante por el papel propuesto de la primera en la presentación antigénica [13]. Otro estudio que avala esta teoría sugiere que la CC interviene en la maduración de las moléculas de histocompatibilidad clase II durante la presentación antigénica en las células dendríticas derivadas de la médula ósea al inhibir la catepsina S [30]. EFECTO DEL TRATAMIENTO SOBRE LA CISTATINA C SÉRICA

Comparamos la concentración de CC en el suero de enfermos con asma antes y después del tratamiento farmacológico. Después de una semana con dosis bajas de metilprednisolona oral o ciclosporina A se observó un efecto atribuible a las drogas en la concentración de CC. De hecho, la metilprednisolona generó un aumento significativo en los niveles de CC mientras que la cislosporina A tendió a asociarse con un efecto opuesto. En nuestro conocimiento, éste fue el primer estudio clínico que demostró el efecto de los fármacos sobre el nivel de CC. Se ha sugerido que el incremento en la producción de CC por células HeLa, inducido por esteroides, se debe al aumento de la transcripción génica mediada por promotor. Por lo tanto, no podemos excluir la posibilidad de que los cambios en los niveles de esteroides afectaran la concentración plasmática de CC. CISTATINA C SÉRICA COMO MARCADOR DEL IFG EN ASMA

Recientemente publicamos que la CC sérica está aumentada en varias enfermedades malignas, incluyendo melanoma metastásico y cáncer colorrectal [24-26]. Los valores de creatinina en estos enfermos no se modificaron significativamente lo que indica que las concentraciones de CC en el suero de pacientes con cáncer no es expresión de alteración de la función renal sino de mayor producción durante la progresión del tumor. Para evaluar el concepto de que la CC y la creatinina son marcadores del IFG, medimos la concentración de ambas proteínas en el suero de pacientes asmáticos y controles [29]. Se observó una mayor correlación entre los niveles de CC y creatinina en el suero de sujetos normales y en pacientes asmáticos dependientes de esteroides, en comparación con asmáticos esteroideo independientes. Las diferencias pudieron ser expresión de una mayor concentración de CC como consecuencia de factores no renales, como progresión de la enfermedad o efecto del tratamiento. El incremento en los niveles de CC, sin cambios aparentes en la concentración de la creatinina en suero, podría ser reflejo de la patogenia del asma. Sin embargo, la interpretación definitiva de los resultados sólo será posible mediante la valoración del IFG por depuración de inulina o EDTA marcado con Cr⁵¹. Así se podrá establecer si el incremento en la concentración de CC en pacientes con enfermedad asmática progresiva se debe a la mayor producción o a la menor eliminación renal. Los resultados avalan estudios más amplios para establecer con certeza el valor de la CC sérica como marcador del IFG en asma. CARACTERÍSTICAS CIRCADIANAS DE LA CISTATINA C

En la mayoría de los organismos mayores se registran variaciones diurnas y nocturnas. La variación circadiana intraindividual es un fenómeno común al hierro, tirotrofina, marcadores asociados con tumor, etc. Sin embargo, la mayoría de los elementos se mantiene en forma relativamente estable en cualquier momento del día. Los ritmos conocidos de variación circadiana también son importantes para interpretar los resultados de pruebas diagnósticas y monitorear enfermos y terapias. En nuestro estudio evaluamos los patrones circadianos de cisteinproteinasas y de sus inhibidores de bajo peso molecular, mediante el estudio de 7 muestras de sangre tomadas cada 4 horas durante todo un día, en sujetos aparentemente normales y en un grupo de pacientes con asma [27-29,32,33]. Con el objetivo de minimizar los factores que pueden influir en la variación, como postura, actividad, ingesta de comidas, estrés, luz diurna o nocturna, sueño y despertar, cada voluntario debió mantener un mismo patrón de actividades durante el día de estudio y en los dos días anteriores al mismo. No se les indicó restricción hídrica con excepción de los 30 minutos previos a la toma de la muestra. En cambio, debieron abstenerse de ingerir otros líquidos o alimentos entre las comidas. Se realizó análisis de varianza (ANOVA), el cual validó diferencias aparentes al comparar distintos puntos en el tiempo. Debido a que el ANOVA puede fracasar en la obtención del punto más alto del ritmo, los datos se analizaron individualmente y en forma grupal mediante análisis de cosenos, el cual implica el ajuste a una curva de cosenos con período de 24 horas según el método de los cuadrados mínimos [34]. Establecimos las características circadianas basales de la CC en voluntarios clínicamente sanos con la finalidad de determinar posibles modificaciones en el patrón circadiano de la CC, atribuibles a la patología asmática y en respuesta a varias modalidades terapéuticas ya que la falta de variabilidad en personas sanas no puede extrapolarse a los enfermos. De 8 personas supuestamente sanas (cinco mujeres y tres hombres) se observó variación circadiana significativa de los niveles séricos de CC sólo en un sujeto. Sin embargo, a nivel grupal, el tiempo no tuvo efecto significativo. Se obtuvieron resultados similares en distintos grupos de asmáticos. A nivel individual, sólo se detectó variabilidad dependiente del tiempo en un pequeño número de enfermos mientras que, a nivel grupal, el análisis de cosenos no reveló un ritmo circadiano significativo. Por lo tanto, la enfermedad o el tipo de tratamiento no parecen influir en las características circadianas de los niveles séricos de CC, tal como ocurre con ciertas funciones respiratorias, en algunas de las cuales el ritmo circadiano se detecta más en pacientes que en normales y con mayor amplitud aún en asma. CONCLUSIONES

El trabajo claramente demuestra que el momento en que se toma la muestra para la valoración de la CC en plasma, en personas normales y pacientes, no compromete los resultados. El tratamiento con metilprednisolona o ciclosporina tampoco parece influir en la determinación, lo cual avala la utilidad de la medición. A su vez, el aumento en la concentración de CC sin cambios aparentes en el nivel sérico de creatinina justifica mayor investigación sobre la utilidad de la CC como marcador del IFG en asma. Por otra parte, el nivel elevado de CC en asmáticos podría reflejar cambios locales en la expresión y secreción de este inhibidor de cisteinproteinasa así como también la respuesta sistémica a la enfermedad. Los resultados, junto con nuestras observaciones anteriores en relación con otros inhibidores de cisteinproteinasas de bajo peso molecular, estefinas A y B y sus enzimas blanco, catepsinas B, H, L y S, nos permiten establecer la hipótesis de que estos sistemas participarían en la patogenia del asma. BIBLIOGRAFÍA

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