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AbstractPreviously it was shown that early treatment with mycophenolate mofetil (MMF) attenuated renal inflammation, glomerulosclerosis (GS), and interstitial expansion in the 5/6 ablation (NX) model. Angiotensin II antagonists also mitigate renal injury in NX, presumably by lowering glomerular pressure (PGC). This study investigated: 1) whether combined MMF/angiotensin II antagonist treatment affords superior protection compared with the respective monotherapies; and 2) whether this association is effective even when instituted late in the course of the disease. Adult male Munich-Wistar rats underwent NX, remaining untreated for 30 d. BP, albuminuria, and the extent of GS, interstitial expansion, and macrophage infiltration were then determined in 17 rats. The remaining 118 rats received either inert vehicle or one of the following: MMF, 10 mg/kg by gavage once daily; losartan potassium (L), 20 mg/dl in drinking water; or combined MMF/L treatment. Sixty days after ablation, untreated NX rats exhibited marked glomerular hypertension, which was attenuated by MMF and, more effectively, by either L or combined MMF/L treatment. At 120 d, hypertension and albuminuria were worsened in untreated NX rats, which exhibited intense macrophage infiltration and severe glomerular and interstitial disease. L and, to a lesser extent, MMF monotherapies attenuated these abnormalities, without preventing their progression. In rats given combined MMF/L therapy, macrophage infiltration, GS and interstitial expansion remained at pretreatment levels. By acting on two distinct pathogenic mechanisms, combined MMF/L treatment arrested established renal injury in the NX model. Further investigation is needed to determine whether this association can prevent renal scarring in other models and in human disease.IntroduƒËoA patog„nese da nefropatia progressiva envolve a participaƒËo de fatores hemodin?micos e nËo hemodin?micos. A lesËo renal pode ser iniciada por agressões mec?nicas, como a hipertensËo e hipertrofia glomerulares e por agressões nËo mec?nicas como as imunológicas e tóxicas, ou ainda por diminuiƒËo na funƒËo da barreira glomerular (proteinúria). Após o insulto inicial, há uma intensa proliferaƒËo celular, recrutamento de células inflamatórias e produƒËo de matriz extracelular, com envolvimento de citocinas e de fatores de crescimento. Em estágios mais avanƒados da doenƒa, observa-se um processo de cicatrizaƒËo glomerular e intersticial que termina na perda total da funƒËo renal. Até o presente momento nËo há ainda um tratamento capaz de interromper esse processo de fal„ncia renal. Os tratamentos atualmente disponíveis, como por exemplo a restriƒËo proteica ou inibidores do sistema renina-angiotensina, retardam mas nËo interrompem a progressËo da lesËo renal.1,2 Um dos modelos experimentais que mais tem sido utilizado para o estudo desses mecanismos é a reduƒËo de 5/6 da massa renal (Nx). Esse modelo se caracteriza por apresentar precocemente (após 1 semana) alteraƒões hemodin?micas, como a hipertensËo glomerular3 e inflamatórias, como infiltraƒËo por linfócitos,10,17 macrófagos4-6 e miofibroblastos,6,7 além do aumento da expressËo de fatores de crescimento tais como transforming growth factor beta TGF8 e de moléculas de adesËo.9,10 Numa fase tardia (2 a 3 meses após Nx), os animais apresentam uma hipertensËo arterial sist„mica, uma albuminúria 40 vezes maior do que a encontrada em ratos normais (apesar da reduƒËo da massa renal), um índice de glomeruloesclerose (GS) 20 vezes maior do que o de ratos controle3 e uma área intersticial da córtex renal 10 vezes maior que a dos ratos normais.11 O bloqueio das alteraƒões hemodin?micas iniciais com o uso de drogas anti-hipertensivas, como os inibidores da enzima conversora da angiotensina II (ACEI)3,12 ou os bloqueadores competitivos dos receptores da angiotensina II (AIIRA)13 possibilita a atenuaƒËo das lesões renais. Estudos com ACEI e AIIRA sugerem a participaƒËo de AII nas etapas hemodin?mica e inflamatória.14,15 No entanto, nËo está claro se a aƒËo da AII no processo inflamatório nËo é apenas uma consequ„ncia da sua aƒËo na hemodin?mica renal. Recentemente demonstramos que é possível inibir apenas o processo inflamatório, mantendo a hipertensËo glomerular ao longo do estudo, o que possibilitou verificar a participaƒËo das células inflamatórias na progressËo da lesËo renal. Num primeiro estudo inibimos a ciclooxigenase16 e num outro inibimos a proliferacËo de linfócitos.17 Demonstramos nesses estudos uma participaƒËo importante dos fatores envolvidos no processo inflamatório na progressËo da lesËo renal nesse modelo experimental.O objetivo do presente estudo foi responder a duas questões: 1) a associaƒËo de dois tratamentos, um inibindo a etapa hemodin?mica do processo lesivo (Losartan) e o outro inibindo a etapa inflamatória (MMF), promove uma maior proteƒËo renal do que as respectivas monoterapias 2) Se esse tratamento combinado fosse iniciado após instalaƒËo da lesËo renal, simulando o que observamos na clínica, obteríamos sucesso na proteƒËo renalMateriais e métodosUtilizamos neste estudo 135 ratos Munich-Wistar machos e adultos pesando entre 240 e 270 gramas. Após a anestesia com pentobarbital sódico (hypnol) na dose de 50 mg/kg, o rim direito foi removido e dois ramos da artéria renal esquerda ligados afim de obtermos reduƒËo de 5/6 da massa renal total (grupo Nx). Todos os tratamentos foram iniciados após 30 dias de Nx.Trinta dias após Nx foram realizadas medidas de pressËo arterial por medida indireta (TCP) e a taxa diária de excreƒËo urinária de albumina (UalbV). Foram incluídos no estudo apenas os animais que apresentaram TCP>130 mmHg e UalbV>20 mg/24 h. Os rins de 17 ratos foram perfundidos e fixados com Dubosq-Brazil, após perfusËo com soluƒËo salina, e o tecido renal preparado para a quantificaƒËo de GS, expansËo intersticial e infiltraƒËo de macrófagos. Esse grupo de animais denominado Nxpré, serve para estimar o grau de lesËo renal após 30 dias de Nx e também para avaliar a efici„ncia dos tratamentos iniciados nesta fase da doenƒa. Os ratos Nx restantes foram subdividos em 4 grupos experimentais: Nx+V, ratos Nx que receberam apenas o veículo; Nx+M, ratos Nx que receberam MMF; 10 mg/kg v.o uma vez ao dia, Nx+L, ratos Nx que receberam Losartan potassium (L), 30 mg/kg; Nx+L+M, ratos Nx que receberam o tratamento combinado de MMF e Losartan. Os animais do grupo sham (S) foram anestesiados e o pedículo do rim esquerdo foi apenas manipulado sem remoƒËo da massa renal. Após 30 dias de tratamento (60 dias de Nx), avaliamos a hemodin?mica renal, o que incluiu a medida da pressËo hidráulica glomerular (PGC) em 8 ratos de cada grupo. Após 90 dias de tratamento (120 dias de Nx), um estudo histológico (quantificaƒËo de lesËo glomerular e intersticial) e imunohistoquímico (infiltraƒËo de macrófagos) foi realizado nos animais restantes.Resultadosd e discussËoA albuminúria, GS e expansËo intersticial, que já eram evidentes 30 dias após Nx foram progredindo ao longo do estudo. Após 120 dias (Nx+V), os animais sem tratamento apresentavam alto índice de GS, refletindo a frequ„ncia e a extensËo desse tipo de lesËo. As lesões intersticiais e a intensa infiltraƒËo de macrófagos ilustram a contribuiƒËo do fenŠmeno inflamatório és lesões renais desse modelo experimental.Após0 dias, a monoterapia com losartan (Nx+L) e, em menor extensËo, a monoterapia com MMF (Nx+M), atenuaram a hipertensËo sist„mica e glomerular, o infiltrado macrofágico e a albuminúria. Apesar de as duas monoterapias promoverem atenuaƒËo nas lesões glomerulares e intersticiais, os grupos Nx+L e Nx+M ainda apresentavam valores maiores que o grupo pré-tratamento. Esses resultados sugerem que tanto o tratamento com losartan como com o MMF apresentam um efeito na hemodin?mica e na inflamaƒËo sem no entanto impedir a progressËo das lesões renais. Esses achados estËo aparentemente em contradiƒËo com os resultados obtidos anteriormente no nosso laboratório17 e por outros3,10,12,13 que demonstraram a eficácia desses tratamentos. Deve-se notar que, ao contrário de estudos anteriores, em que os tratamentos foram iniciados 1-7 dias após Nx, no presente estudo as monoterapias foram iniciadas somente 30 dias após Nx. Esses achados, também descritos em outros estudos18,19 sugerem que os tratamentos iniciados quando a doenƒa renal já está instalada sËo menos eficientes do que os instaurados logo após a Nx. O tratamento combinado com losartan e MMF (Nx+L+M) reverteu a hipertensËo sist„mica, albuminúria, infiltraƒËo de macrófagos e manteve a intensidade das lesões glomerulares e intersticiais próxima équela obtida antes do início do tratamento (Nxpré). Esse efeito protetor nËo pode ser explicado apenas pela aƒËo da terapia combinada sobre a hemodin?mica glomerular, pois os valores da pressËo hidráulica glomerular foram semelhantes aos obtidos no grupo Nx+L. Além disso o efeito anti-inflamatório do MMF nesse grupo deve ter sido id„ntico ao observado nos ratos tratados apenas com MMF. Portanto, a grande eficácia da terapia combinada losartan/MMF deve ter resultado de uma interaƒËo entre as drogas. Embora tanto o losartan quanto o MMF exerƒam efeitos hemodin?micos e nËo-hemodin?micos, eles podem agir em fases distintas na sequ„ncia de eventos que levam é cicatrizaƒËo glomerular. A aƒËo simult?nea de terapias combinadas sobre diferentes mecanismos patog„nicos pode promover uma interrupƒËo mais eficiente da nefropatia, conforme sugerem os dados deste estudo e de estudos anteriores.20,21 Refer„ncia1. Lewis EJ, Hunsicker LG, Bain RP, Rohde RD: The effect of angiotensin-converting-enzyme inhibition on diabetic nephropathy. The Collaborative Study Group [see comments] [published erratum appears in N Engl J Med 1993 Jan 13;330(2):152]. N Engl J Med 329:1456-1462, 1993.2. Maschio G, Alberti D, Janin G, Locatelli F, Mann JF, Motolese M, Ponticelli C, Ritz E, Zucchelli P: Effect of the angiotensin-converting-enzyme inhibitor benazepril on the progression of chronic renal insufficiency. The Angiotensin-Converting- Enzyme Inhibition in Progressive Renal Insufficiency Study Group [see comments]. N Engl J Med 334:939-945, 1996.3. Anderson S, Meyer TW, Rennke HG, Brenner BM: Control of glomerular hypertension limits glomerular injury in rats with reduced renal mass. J Clin Invest 76:612-619, 1985.4. Floege J, Alpers CE, Burns MW, Pritzl P, Gordon K, Couser WG, Johnson RJ: Glomerular cells, extracellular matrix accumulation, and the development of glomerulosclerosis in the remnant kidney model. Lab Invest 66:485-497, 1992.5. 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Na década de 80 os trabalhos do grupo do Brenner mostraram a import?ncia dos fatores hemodin?micos e os benefícios do seu bloqueio farmacológico em diferentes nefropatias progressivas (Nx e DM). Na década de 90, tem-se demonstrado a import?ncia dos fenŠmenos inflamatórios nas nefropatias progressivas de origem nËo-imunológica. Nós e outros temos demonstrado que o bloqueio do processo inflamatório, através do uso de anti-inflamatórios nËo esteroidais ou de uma droga inibidora da proliferaƒËo de linfócitos, atenua significativamente o processo inflamatório e a lesËo renal característicos do modelo Nx.O presente estudo e outros tem sugerido novas definiƒões e conceitos a respeito dos fenŠmenos que envolvem a nefropatia progressiva:  O processo inflamatório participa de uma maneira efetiva nas nefropatias progressivas de origem nËo-imunológica e, uma vez deflagrado, é muito difícil interromp„-lo.  Os efeitos nËo-hemodin?micos da angiotensina II tal como aumento da proliferaƒËo das células mesangiais, miofibroblastos, células T e aumento na expressËo de moléculas de adesËo tem reforƒado a idéia de que a AII é uma subst?ncia relevante na patog„nese das nefropatias progressivas.  Fica cada vez mais claro que, para o tratamento de doenƒas renais progressivas, as monoterapias sËo insuficientes e que há necessidade de combinar diferentes drogas que atuam em diferentes etapas ou vias. Talvez seja necessária a associaƒËo de 3 ou 4 drogas para que possa impedir a progressËo das doenƒas renais crŠnicas.O presente estudo foi publicado em fevereiro de 2000, por isso consideramos ter havido pouco tempo para observarmos a repercussËo do estudo ou avaliarmos sua relev?ncia. No entanto, o trabalho já foi citado na revista Current Opinion in Nephrology and Hypertension 9:323-331, 2000, e o Prof. Dr. Roberto Zatz, Coordenador do Grupo, foi convidado a apresentar uma mini-confer„ncia no American Society of Nephrology (Toronto/2000): «Mycophenolate Mofetil and other antiinflammamtories: New perspectives in management of progressive nephropathies».