Artículo completo
IntroducciónLa hormona gonadotrofina coriónica humana (hCG) pertenece a una familia de glicoproteínas y está compuesta por dos subunidades, alfa (Ó) y beta (ß), unidas no covalentemente. Su peso molecular es de 40.000 Da.La hCG es producida por el tejido trofoblástico, ya sea normal o patológico, a diferencia de los otros miembros de la familia (LH, hormona luteinizante; FSH, hormona foliculoestimulante; y TSH, hormona estimulante de tiroides) que son secretados por la hipófisis. Estas hormonas tienen en común la subunidad y varían en la, siendo esta última determinante de la especificidad.Dosajes cualitativos en orina son usados para el diagnóstico de embarazo. Dosajes cuantitativos en suero son usados para monitorear el progreso del embarazo, estimar semanas de gestación, confirmar embarazos ectópicos, molas hidatidiformes y síndrome de Down; también para seguimiento de enfermedad trofoblástica, cáncer testicular y ciertas enfermedades malignas no trofoblásticas.Estructura: la subunidad Ó contiene 92 aminoácidos, cinco puentes disulfuro y dos residuos oligosacáridos unidos a nitrógenos en las posiciones 52 y 78.La subunidad ß está compuesta por 145 aminoácidos, seis puentes disulfuro, dos residuos oligosacáridos unidos a nitrógeno en las posiciones 13 y 30, y cuatro unidos a oxígeno en la región del carboxilo terminal, rica en prolinas y serinas (posiciones 122 a 145) (figura 1).(INSERTAR LA FIGURA 1)Figura 1. Estructura primaria de la hCG.Heterogeneidad y metabolismo de la molécula de hCG en los fluidos biológicosActualmente está comprobada la existencia de distintas formas moleculares de la hCG, cuyos descubrimientos comenzaron a fines de la década pasada. En 1988, Kato y Braunstein1 encontraron que un pequeño fragmento de la subunidad ß (ß core) estaba presente en la orina y no en el suero de mujeres embarazadas. Evaluaron las proporciones de este fragmento inmunorreactivo pero biológicamente inactivo en quince gestantes. También observaron que este ß core era responsable del 90% de la inmunorreactividad en la orina, que carecía del epitope carboxilo terminal y que era inactivo en los bioensayos in vitro.También en ese mismo año Birken y cols.2 aislaron y determinaron la estructura del fragmento ß core, el cual está formado por dos cadenas polipeptídicas: dos residuos ß (6-40 y 55-92) unidos por puentes disulfuro (figura 2). Encontraron que éste difería de la subunidad ß en su contenido de carbohidratos, carecía de ácido siálico pero tenía una cantidad variable de galactosa.También observaron que formaba dímeros en solución de pH neutro y que no se combinaba con la subunidad Ó intacta.(INSERTAR LA FIGURA 2) Posee cinco puentes disulfuro y un PM que es aproximadamente la cuarta parte de la hCG (9000 Da).Figura 2. Esquema del fragmento ß core.En 1990 Wehman y cols.,3 usando una preparación altamente purificada de ß core de hCG y un RIA desarrollado para tal fin, investigaron las concentraciones y el comportamiento del mismo, tanto en suero como en orina. Concluyeron que las concentraciones de ß core sérico eran extremadamente bajas y que no existía una correlación entre la hCG sérica y la excreción de ß core urinario. La explicación que postularon como más probable era que el ß core provenía de la degradación de moléculas precursoras tales como hCG y ß hCG en el riñón y posiblemente en otros órganos.Kardana y Cole4 confirmaron mediante técnicas de filtración en geles e inmunoensayos que la concentración de ß core sérico era muy baja. A su vez demostraron que existía una especie de fragmento ß core formando parte de un complejo de PM elevado (PM > 60 000 Da), el cual al ser disociado producía una molécula que coincidía con un estándar de ß core, tanto por técnicas de filtración en gel (Mr 15 000) como por HPLC.Ellos concluyeron que la mayor parte del fragmento ß core encontrado en el suero estaría asociado a otras macromoléculas, las cuales enmascararían el epitope de éste para los anticuerpos anti-ß hCG. Las mediciones hechas en este complejo disociado concordarían con los niveles de ß core hallados en la orina de mujeres embarazadas. Kardana, Cole, Birken y cols., en 1991, publicaron tres trabajos5-7 que tenían como tema común el estudio de la heterogeneidad de hCG. En el primero caracterizaron esta heterogeneidad peptídica en trece muestras individuales de la hormona. Usaron seis orinas provenientes de mujeres embarazadas y siete de pacientes con enfermedad trofoblástica. Las estudiaron usando procedimientos cromatográficos y detectaron por primera vez la variabilidad de estructuras peptídicas entre distintas muestras.Ellos reportaron que:  En la estructura de la hCG se observaban rupturas (nicks) en la subunidad ß, preferentemente entre los residuos 47-48 y con menor frecuencia en 44-45 ó 46-47.  El contenido de nicking variaba ampliamente entre las diferentes preparaciones (0-100% de las moléculas).  Sólo en las muestras con enfermedad trofoblástica (0-28% de las moléculas) existía heterogeneidad en el segmento N-terminal de la subunidad ß; secuencias que comenzaban con Asp (Ó3) y Val (Ó4).  Ausencia del segmento carboxilo terminal de la subunidad ß en dos de las trece muestras.  En una de las trece, existía una ruptura (nicking) entre los residuos 70-71 de la subunidad Ó.Por lo tanto concluyeron que esta variabilidad individual no había sido apreciada en los pooles de hCG, que era el material estudiado hasta la fecha.En el segundo, estudiaron estos nicks en preparaciones estándar de referencia de hCG, las cuales fueron obtenidas purificando productos comerciales de pooles de orinas provenientes de mujeres embarazadas, con el fin de detectar a las enzimas responsables de estos clivajes.Los resultados obtenidos concordaban con los del trabajo anterior: los estándares de referencia tenían contenidos similares de rupturas en ambas posiciones: ß 47-48 y ß 44-45.Los porcentajes de nicking variaron en estas preparaciones entre un 10 y un 20%. Postularon que la elastasa leucocitaria humana podría clivar específicamente la unión ß 44-45 y, con tiempos de incubación más prolongados, también las uniones ß 48-49 y ß 51-52, pudiendo, por lo tanto, originar alguna de estas rupturas tanto en las muestras individuales como en las preparaciones de referencia.En el tercero, estudiaron la actividad biológica e inmunológica de la nicked hCG, para lo cual examinaron ocho muestras de orina; se hallaron diferentes porcentajes de molécula intacta, como se observar en la tabla 1.Tabla 1.(INSERTAR LA TABLA 1)Aunque no observaron correlación entre el porcentaje de hormona intacta y la unión a receptores específicos (actividad biológica r < 0.5), sí la hallaron cuando compararon el porcentaje de hormona intacta con la actividad esteroideogénica in vitro (98% de correlación). Esto diferenciaría los efectos del nicking e indicaría que mientras múltiples factores influencian la unión al receptor, solamente los clivajes suprimen la actividad esteroideogénica de la hCG.Usando distintos inmunoensayos, de los cuales uno medía hCG total y el otro sólo la molécula intacta, concluyeron que aproximadamente un cuarto de la hCG sérica y urinaria estaría como nicked.Este hallazgo resaltaría la importancia de este nuevo componente con actividad esteroideogénica mínima y sus implicancias fisiológicas.Estos mismos autores realizaron en 1993 un estudio de la desactivación de la hCG a causa del nicking.10 Como se había mencionado anteriormente, la ruptura en la posición 44-45 o 47-48 de la cadena de la hCG suprimía la actividad esteroideogénica. Investigaron el origen del nicking incubando estándares de hCG con sangre entera durante 18 hs a 37 °C. No observaron variaciones en el porcentaje de ruptura. Por lo tanto, propusieron que el nicking ocurría antes o inmediatamente después de la secreción por el tejido trofoblástico, pudiendo deducir la prevalencia del nicking como se puede ver en la figura 3.(INSERTAR LA FIGURA 3)Figura 3.Finalmente, estudiaron la estabilidad de la molécula intacta y de la nicked y observaron que mientras la primera se disociaba con un t_1/2 de 700 h, la nicked lo hacía en 22 ± 5.2 h.También investigaron los niveles en sangre y orina de las subunidades de la hCG libres generadas a partir de una rápida disociación de las moléculas nicked (t_1/2 dis.: 22 h). Hallaron que los niveles de las subunidades libres en orina (incluido el fragmento ß core) aumentaban en forma proporcional al contenido de nicking, lo que no ocurría en suero, donde el porcentaje de subunidad libre permanecía estático o disminuía. Por lo tanto, propusieron en base a estudios anteriores que la ß libre nicked, junto con el fragmento ß core, formaba parte de un complejo de alto peso molecular, el cual enmascararía su detección.4 Las mediciones realizadas en sueros previamente tratados con tiocianato de amonio que disocian el complejo, arrojaban valores comparables con los medidos en orina. La ß libre nicked sería el sustrato para la síntesis del fragmento ß core. En numerosos trabajos de investigación se han estudiado las formas carbohidratadas de la hCG, observándose también una heterogeneidad considerable. Esta hormona posee un 30% en peso de carbohidratos y contiene tanto uniones N-asparagina como O-serina. Cada carbohidrato termina teóricamente en ácido siálico pero se han encontrado formas desialadas.13El contenido de carbohidratos es de gran importancia para la actividad biológica, pero no son particularmente antigénicos comparados con la proteína misma. La única área de la hCG que ha generado anticuerpos con especificidad por los carbohidratos es la del COOH-terminal cuando se la conjuga con proteínas transportadoras.14,15Nishimura y col. estudiaron orinas provenientes de pacientes sanos y con enfermedad trofoblástica; hallaron en las muestras patológicas una mayor heterogeneidad en el contenido de carbohidratos.13 Como conclusión, se pueden encontrar las siguientes formas moleculares :* hCG intacta* hCG nicked* hCG variantes carbohidratadas* ß hCG sin el COOH terminal * ß hCG libre* ß core hCG * Ó hCG libreLa hCG biológicamente activa (intacta) tiene una vida media de 36 h. La concentración en suero y orina aumenta durante el primer trimestre de embarazo en forma exponencial, duplicándose cada 48 horas hasta alcanzar un pico en la décima semana de gestación. Decrece durante las seis semanas siguientes y se mantiene hasta el final del embarazo en un valor aproximado al veinte por ciento del medido en el pico.La hCG nicked posee una ruptura en la subunidad ß, entre los residuos 47 y 48 o, menos común, entre 43 y 44 o 44 y 45.11El fragmento ß core es el producto terminal de la degradación de la hCG.En mujeres embarazadas o con enfermedad trofoblástica, se encuentran niveles altos de este fragmento en orina, pero en suero son prácticamente indetectables.Dos formas de Ó libre hCG se encuentran en suero y orina: la regular, que es la misma que la subunidad Ó, y la Ó libre grande. Esta última está hiperglicosilada, es solamente producida por las células trofoblásticas y no se incorpora a la hCG.En el embarazo, el mayor componente sérico es la hCG intacta, los porcentajes de la hCG nicked varían de acuerdo a la edad gestacional (0-59% en el primer trimestre); también se dosan pequeñas cantidades de subunidad ß libre y variantes carbohidratadas. La subunidad Ó hCG libre aumenta llegando hasta un 30% en la gesta a término.Proporciones mayores y con más variantes de la hCG nicked, subunidad ß libre, subunidad Ó libre y fragmento ß core se hallaron en muestras de suero y orina de embarazos Down, preeclampsia, enfermedad trofoblástica y cáncer.En la revisión publicada por L. Cole en 199711 se presentó el siguiente esquema (figura 4): (INSERTAR LA FIGURA 4)Figura 4. Esquema resumido del trabajo original (sin representación de estructuras). Resultados discordantes en el dosaje de hCG medida por diferentes metodologíasEn 1992, Cole y Kardana reportaron resultados discordantes entre los diferentes inmunoensayos de hCG.8Ellos analizaron cuarenta muestras de suero con diez diferentes métodos para el dosaje de hCG. Los resultados obtenidos variaban considerablemente. Si comparaban promedios para los distintos kits, los resultados podían incrementarse desde 1.4 veces para los sueros de mujeres embarazadas (n = 20) hasta 2.2 veces para los sueros de pacientes con enfermedad trofoblástica (n = 20).Para averiguar las causas de estas discordancias prepararon estándares para cada una de las formas moleculares encontradas ymidieron las reactividades con los mismos diez kits utilizados anteriormente.La reactividad de la subunidad ß libre varió desde una falta de reconocimiento (los kits que dosan antiß-antiÓ) hasta un reconocimiento máximo (un kit que tenía cinco veces mayor afinidad por la subunidad ß que por la hCG).Los kits con anticuerpos dirigidos contra el COOH terminal no detectaron al estándar de hCG preparado sin este epitope, siendo esta molécula la encontrada en la enfermedad trofoblástica. Los kits con anticuerpos anti-hCG dímero fallaron en el reconocimiento de la nicked hCG, que es aproximadamente un 25% de todas las muestras séricas.Profundizaron este estudio en un trabajo posterior,9 donde analizaron un número mayor de muestras (242 sueros y 125 orinas de embarazos tempranos). En él evaluaron la composición y el diseño de los distintos kits comerciales. Estos abarcaban desde el clásico RIA hasta los más sofisticados tests con anticuerpos múltiples, en los cuales se incluían ensayos de tipo «sandwich», que poseían los siguientes diseños (tabla 2):* un anticuerpo anti-subunidad Ó y uno anti-subunidad ß.* anticuerpos contra dos epitopes en la subunidad ß.* anticuerpo anti-hCG dímero y anticuerpo anti-subunidad ß. En estos tests, el primer anticuerpo se encontraba inmovilizado y el segundo poseía una marca enzimática o radiactiva; en la figura 5 se observa el mapeo antigénico reportado por Cole y col.9(INSERTAR LA FIGURA 5)Figura 5.Tabla 2.(INSERTAR LA TABLA 2)En un principio, la discordancia de resultados había sido atribuida a los diferentes estándares de hCG, a la reacción cruzada con LH o a factores inespecíficos. Posteriormente, si bien los inmunoensayos prácticamente no poseían reacción cruzada con LH y estaban referidos a estándares puros de hCG (1st IRP y 3rd ambos hechos del CR 119 hCG), los problemas continuaban.Del estudio realizado pudieron concluir que no son interconvertibles los resultados provenientes de kits que dosan hCG total, no nicked y subunidad ß.Las diferentes cantidades de esas formas moleculares presentes en las distintas muestras individuales serían las responsables de losresultados discordantes. En 1997, L. Cole publicó una revisión en la cual estudió el reconocimiento de las moléculas relacionadas por los diferentes inmunoensayos.11Este autor recalcó la importancia en la elección del inmunoensayo y recordó que se venden más de 100 kits comerciales para dosar hCG. Cada uno de ellos dosa la molécula intacta y una de siete combinaciones de las moléculas relacionadas. Además concluyó que ésta es la fuente de las discordancias entre los ensayos, siendo la variación menor para los embarazos normales y mucho mayor para gestaciones irregulares o enfermedades tumorales.En este trabajo también figura una tabla donde se presentan algunos ejemplos de inmunoensayos comerciales cuantitativos de hCG que se venden en EE.UU., la combinación de Ac. empleados y la molécula que detectan. En 1998, este mismo autor17 publicó una revisión donde destacaba la presencia de una mayor heterogeneidad o cantidad de moléculas degradadas en la enfermedad gestacional trofoblástica comparada con el embarazo normal.En ese mismo año, Butler y cols.18 estudiaron la estabilidad de la molécula de hCG y de sus fragmentos durante el almacenamiento en distintas condiciones. Encontraron que hay una disociación constante en función del tiempo, siendo este proceso mayor a temperaturas más altas; que la hCG nicked se disocia más rápidamente que la molécula intacta y que la glicosilación reduce la velocidad de disociación.En 1999, Kovalevskaya y cols.19 han reportado el desarrollo y caracterización de un inmunoensayo IRMA para la medición directa de la fracción nicked en sangre y orina.HALLAZGOS EN NUESTRO LABORATORIOTeniendo en cuenta las conclusiones obtenidas en este trabajo, procesamos las muestras usando estas dos metodologías: Kit EspecificidadAccess System hCG intacta + nicked + ß libre (+ a core ) Serono MAIAclone * Intacta + ß libre* Actualmente Wiener.El fundamento del sistema Access se basa en un inmunoensayo con dos sitios inmunoactivos (sandwich). La muestra se coloca en un tubo de reacción con anticuerpos de conejo contra hCG conjugada con fosfatasa alcalina, y partículas paramagnéticas recubiertas con anticuerpos de cabra anti-IgG de ratón, de tipo monoclonal. Se adiciona un sustrato quimioluminiscente y la luz generada en la reacción es medida con un luminómetro; la señal luminosa es directamente proporcional a la cantidad de hCG en la muestra.La tecnología de hCG MAIAclone incorpora tres anticuerpos monoclonales de alta afinidad en un sistema inmunorradiométrico. Dos anticuerpos marcados con 125I se unen a un punto único de la molécula de hCG y de su subudad ß.Un tercer anticuerpo monoclonal, marcado con fluoresceína, se une a otro epitope de la subunidad ß de hCG formando un sandwich. La radiactividad medida es directamente proporcional al antígeno presente.Encontramos resultados discordantes en tres pacientes con tumores a células germinales, a saber: Paciente 1: hombre de 60 años con formación tumoralmetastásica en retroperitoneo. (Tumor primitivo: seminoma) Paciente 2: mujer de 30 años con diagnóstico de disgerminoma. Este es un tumor poco común, que representa entre el 1 y el 2% de las neoplasias ováricas primarias y del 3 al 5% de los carcinomas ováricos. El disgerminoma puede ocurrir a cualquier edad, desde la infancia hasta la vejez; pero la mayoría de ellos se observa en la adolescencia y en el comienzo de la edad adulta. Está formado por células germinales indiferenciadas. En algunos casos contiene células gigantes aisladas sinciciotrofoblásticas que producen gonadotrofinas. Se puede hallar un nivel elevado de hCG sérica en estas pacientes.16 Paciente 3: hombre de 40 años con metástasis testicular contralateral con diagnóstico de seminoma. El seminoma es el tumor más frecuente en forma pura; suele aparecer entre los 25 y 55 años, y su incidencia máxima se produce a los 35 años. Aproximadamente un 10% de los seminomas están acompañados de niveles elevados de hCG en suero. En la mayoría de los casos de seminoma, el hallazgo de niveles elevados de hCG (atribuibles a focos iniciales diseminados de carcinoma embrionario o coriocarcinoma en el tumor) se debe a la presencia de células del sinciciotrofoblasto o a la existencia de depósitos metastásicos que contienen carcinoma embrionario o coriocarcinoma; pero un estudio exhaustivo del tumor primario puede no dar una explicación acerca de la producción de hCG, y las metástasis tumorales pueden entoces no ser detectadas.12 Los valores hallados figuran en la tabla 3 y están representados en los gráficos correspondientes a las figuras 6, 7 y 8. (Las muestras está0n cronológicamente ordenadas).(INSERTAR FIGURAS 6, 7, 8)Tabla 3.(INSERTAR LA TABLA 3)Comentario finalComo se puede observar al comparar los resultados obtenidos, la metodología que dosa más formas moleculares de la hCG fue más útil en la detección temprana del marcador.Nuestro próximo objetivo será procesar todas las muestras por una tercera metodología que determine subunidad ß libre únicamente.En base a lo expuesto y a nuestra experiencia nos sumamos a las recomendaciones publicadas en el trabajo de Cole sobre la importancia de especificar la metodología empleada y las moléculas detectadas con el fin de evitar confusiones en la interpretación de los resultados.AgradecimientosAgradecemos al Sr. Jorge O. Santos por su valiosísima e incondicional colaboración y a la Dra. María Gabriela Ropelato por su aporte en la diagramación y corrección de este trabajo.Bibliografía1. Yoshio Kato and Braunstein GD «b Core Fragment Is a Major Form of Immunoreactive Urinary Chorionic Gonadotropin in Human Pregnancy», J.Clin Endocrinol Metab 1988, 66:1197-1201.2. Birken S, Armstrong G, Gawinowicz Kolks MA, Cole L et al. «Structure of the Human Chorionic Gonadotropin b subunit Fragment from Pregnancy Urine», Endocrinology 1988 123:572-583.3. Wehmann R, Blithe D, Akar A, Nisula B. «Disparity between b core Levels in Pregnancy Urine and Serum: Implications for the Origin of Urinary b Core» J Clin Endocrin Metab 1990, 70:371-377.4. Kardana A, Cole L. «Serum HCG b Core Fragment is Masked by Associated Macromolecules», J Clin Endocrin Metab 1990, 71:1393-1395. 5. Kardana A, Birken S, Cole L et al. «The Heterogeneity of Human Chorionic Gonadotropin (hCG). I. Characterization of Peptide Heterogeneity in 13 Individual Preparations of hCG», Endocrinology 1991, 129:1541-1550.6. Kardana A, Birken S, Cole L et al. «The Heterogeneity of Human Chorionic Gonadotropin (hCG). II. Characteristics and Origins of Nicks in hCG Reference Standards», Endocrinology 1991, 129:1541-1557.7. Kardana A, Birken S, Cole L et al. «The Heterogeneity of Human Chorionic Gonadotropin (hCG). III. The Ocurrence and Biological and Immunological Activities of Nicked hCG», Endocrinology 1991, 129:1559-1567.8. Cole L and Kardana A. «Discordant Results in Human Chorionic Gonadotropin Assays», Clinical Chemistry 1992, 38:263-269.9. Cole L, Seifer D, Kardana A and Braunstein GD. «Selecing Human Chorionic Gonadotropin Immunoassays: Consideration of cross -reacting molecules in first-trimester pregnancy serum and urine», Am J Obstet Gynecol 1993, 168:1580-1586.10. Cole L, Seifer D, Kardana A, Park S and Braunstein GD. «The Deactivation of hCG by Nicking and Dissociation», J Clin Endocrinol Metab 1993, 76:704-710.11. Cole L. «Immunoassay of Chorionic Gonadotropin, its free subunits, and metabolites», Clinical Chemistry 1997, 43(12):2233-2243.12. De Groot. «Endocrinology», 3° Ed. 1995. 2442-2448.13. O\'Connor JF, Birken S y col. «Recent Advances in the Chemistry and Inmunochemistry of Human Chorionic Gonadotropin: Impact on Clinical Measurements«, The Endocrine Society 1994, 15:650-683.14. Birken S y col. «Preparation and Caracterization of an Improved b-COOH-Terminal inmunogen for generation of specific and sensitive antisera to human chorionic gonadotropin», Endocrinology 1982, 110:1555-1563.15. Birken S, Cole L y col. «Characterization of antisera distinguishing carbohydrates structures in the b-carboxyl-terminal region of human chorionic gonadotropin», Endocrinology 1988, 122:2054-2063.16. DiSaia Creasman. «Ginecología Oncológica», Ed. 1991. 306-308.17. Cole L. «hCG, its free subunits, and metabolites», J Reprod Med 1998, 43:3-10.18 - Butler S, Cole L y col. «Disociation of human chorionic into its free subunits is dependent on naturally ocurring molecular structural variation, sample matrix and storage conditions», Ann Clin Biochem 1998, 35:754-760.19. Kovalevskaya G, Birken S y col. «Evaluation of nicked human chorionic gonadotropin content in clinical specimnes by a specific inmunometric assay» Clin Chem 1999, 45:68-77.