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RESUMEN

Antecedentes. La leucemia es la neoplasia infantil más frecuente y la leucemia linfoblástica aguda (LLA) es, entre ellas, la más común. En el 90% de los casos se alcanza la remisión, y mediante quimioterapia logran la curación 65% al 75% de los pacientes. Aún es un desafío comprender cómo ciertas alteraciones moleculares influyen en el pronóstico y, por lo tanto, establecer la mejor terapia posible. Algunos estudios sugieren que la alteración funcional del gen p53 o del oncogén MDM2 podría indicar progresión de la enfermedad en LLA. Material, métodos y resultados. En primer lugar evaluamos la expresión excesiva de p53 y MDM2 por inmunohistoquímica en un grupo no seleccionado de pacientes con LLA. Debido a que la mayor expresión de la proteína MDM2 se observó en niños de riesgo elevado, en un segundo estudio analizamos 29 muestras de médula ósea de pacientes con leucemia con pronóstico desfavorable. Se constató expresión de p53 en 12 enfermos y de MDM2 en 17 niños. Para comprender la importancia de la observación, también investigamos la expresión de p53/MDM2 en el momento del diagnóstico en 30 infantes con LLA en remisión prolongada. Se comprobó mayor expresión de MDM2 y de p53 en un porcentaje significativamente más alto de enfermos con recidiva de la neoplasia en comparación con los pacientes con remisión sostenida. Conclusión. Estas observaciones avalan la hipótesis de que la expresión de p53 y MDM2 está aumentada en las leucemias más agresivas. Se requieren investigaciones prospectivas para comprender si estas alteraciones representan cambios secundarios que aparecen durante la enfermedad o, en caso de estar presentes en el momento del diagnóstico, constituyen marcadores predictivos pronósticos. Palabras clave: leucemia infantil, MDM2, p53, inmunohistoquímica, proteínas proto-oncogénicas, marcadores tumorales biológicos. ABSTRACT

Background. Leukaemia is the most frequent neoplastic disease in childhood and acute lymphoblastic leukaemia (ALL) being the most common. Remission is achieved in 90 % of these children and chemotherapy will cure 65-75%.It remains a challenge to understand how molecular aberrations influence the prognosis and thus the optimal therapy.Some studies indicate that dysfunction of the p53 gene or the oncogene MDM2 could indicate disease progression in ALL. Material, methods and results: We first examined p53 and MDM2 protein overexpression by immunohistochemistry in an unselected group of ALLs.As MDM2 overexpression was observed in high-risk patients, in a second study we examined 29 bonemarrow samples in children with prognostically unfavourable leukaemias. p53 protein was expressed in12 and MDM2 in17 patients. To put this in perspective, we investigated p53/MDM2 expression at diagnosis in 30 children who had maintained a long-term-remission-ALL. MDM2 and p53 expression were seen in a significantly higher proportion in the relapsed patients than in the long-term remission-group. Conclusion: These observations support the hypothesis that p53 and MDM2 are overexpressed in more aggressive leukaemias. Prospective studies are needed to investigate whether p53/MDM2 alterations represent secondary changes appearing during disease, or when present at diagnosis, if they are indicators of a poor outcome.Key words: childhood leukaemia, MDM2, p53, immunohistochemistry, proto-oncogene proteins, biological tumor markers.INTRODUCCION

La alteración del gen supresor de tumor TP53 y la mayor expresión de la proteína codificada por él, p53, se asocian con interrupción del ciclo normal de proliferación celular y apoptosis.^1-3 Es la mutación más común en cáncer humano.^1,2 De hecho, las mutaciones en la p53 se han involucrado en la etiología de varios tipos de tumores sólidos y podrían tener significado pronóstico en neoplasias hematológicas del adulto.^4,5 En las leucemias agudas infantiles, las mutaciones de p53 son infrecuentes en el momento del diagnóstico de la patología pero tienden a conferir un pronóstico desfavorable.^6-16 Uno de los mecanismos propuestos en la inactivación de la p53 tipo natural es la interacción con MDM2, una proteína de tumor que anula la función supresora de tumores de p53, con lo cual se forma un circuito de autorregulación.^17-19 En algunos casos de neoplasias hematológicas malignas del adulto se observa mayor expresión de MDM2 y este fenómeno se asocia con pronóstico adverso.²⁰ Marks y colaboradores refirieron que la expresión anormal de p53/MDM2 en el momento del diagnóstico era un hallazgo más frecuente en la LLA con falta de respuesta temprana al tratamiento que en niños con remisión prolongada. Asimismo, encontraron que 3 de 10 pacientes con LLA de pronóstico desfavorable tenían mutaciones en el gen de la p53 y otros cuatro expresaban en exceso la proteína MDM2. En dos de estos cuatro enfermos, el nivel de ARN mensajero (ARNm) de MDM2 era normal. Los autores pusieron énfasis en la importancia de la medición de dicha proteína y en un posible mecanismo nuevo de regulación postranscripcional en el nivel de la proteína MDM2.^21-22 Zhout y colegas refirieron la expresión exagerada de ARNm de MDM2 en algunos casos pediátricos de LLA con células que expresaban el tipo salvaje de la p53. También constataron que la mayor expresión de MDM2 en niños con LLA se correlacionaba en forma significativa con resistencia a la doxorrubicina y con recidiva.^23-24 El objetivo del estudio fue evaluar la expresión de p53 y de MDM2 en células leucémicas de niños con LLA en remisión sostenida y comparar los hallazgos con los de pacientes con LLA internados para trasplante de médula ósea como consecuencia de hallazgos indicadores de pronóstico desfavorable, esencialmente recidiva. MATERIAL Y METODOS

Pacientes
Se revisaron muestras de médula ósea obtenidas en el momento del diagnóstico de LLA en 30 niños que habían permanecido más de 5 años sin recidiva. Además se estudiaron 15 pacientes internados para ser sometidos a trasplante de médula ósea (TMO), quienes representaron el grupo de pronóstico desfavorable. En 7 de ellos se dispuso de muestra de médula ósea en el momento del diagnóstico inicial. Como controles se evaluaron biopsias medulares de 11 pacientes sin patología neoplásica. En todos los casos se dispuso de muestras de médula ósea embebidas en parafina. Métodos
Las muestras de médula ósea se analizaron con inmunohistoquímica para determinar la expresión de p53 y MDM2. La presencia de células leucémicas se estableció morfológicamente y con el uso de marcadores inmunológicos CD3 y CD79a. Se utilizaron los anticuerpos primarios anti-p53, clon DO-7, un anticuerpo murino monoclonal que reconoce los aminoácidos 17 a 29 de la región aminoterminal de la proteína humana p53 (Dakopatts) y el anti-MDM2, clon SMP14, un anticuerpo monoclonal murino contra la secuencia de aminoácidos 154-167 de la proteína MDM2 humana (Santa Cruz Biochemistry). La marcación se efectuó en TechMateTM 500, Dakopatts según procedimientos estandarizados. La fijación de los anticuerpos se visualizó mediante reacción enzimática con diaminobenzidina-peróxido. Las muestras se tiñeron débilmente con hematoxilina y se prepararon controles negativos con la omisión del anticuerpo primario. Se incluyeron controles positivos -muestras de amígdalas embebidas en parafina- con expresión conocida de p53 y MDM2 (figura 1). Con la finalidad de optimizar el procedimiento de detección de MDM2, se utilizó la línea celular C6 con expresión exagerada inducida de MDM2. INSERTAR FIGURA 1 Figura 1. Detección por inmunohistoquímica de p53 en amígdala normal.En cada preparado se contaron 500 células y se determinó la frecuencia de células mononucleares con expresión de p53 y MDM2. Las muestras con menos de un 10% de células positivas se consideraron negativas. La intensidad de la positividad para p53 y MDM2 se estableció como leve (+), intermedia (++) o intensa (+++). Las diferencias estadísticas entre los grupos se calcularon con la prueba de Chi cuadrado con corrección de Yates. El protocolo de estudio fue aprobado por el comité de ética médica del Instituto Karolinska. RESULTADOS Y DISCUSION

Un estudio anterior analizó la expresión de p53 y MDM2 por inmunohistoquímica en muestras de médula ósea de 23 niños con LLA.²⁵ En un caso se constató mayor expresión de la proteína p53 mientras que en 5 enfermos hubo expresión exagerada de MDM2. Estos 6 pacientes con expresión excesiva de MDM2/p53 pertenecían a un grupo con hallazgos compatibles con pronóstico adverso en el momento del diagnóstico. Con la finalidad de comprender mejor el valor pronóstico de la expresión de p53/MDM2, estudiamos muestras de médula ósea de niños con LLA en recaída, internados para estudio pretrasplante de médula ósea. Encontramos elevada incidencia de expresión aumentada de las proteínas p53 y MDM2 en comparación con los controles sin leucemia.²⁶ El objetivo del tercer estudio fue poner estas observaciones en perspectiva mediante el análisis de la expresión de p53/MDM2 en un grupo de niños con LLA que sobrevivieron más de 5 años luego del diagnóstico. Además, se volvieron a estudiar las muestras de médula ósea originales y las obtenidas durante la recaída en el grupo con evolución desfavorable. Sólo 4 de los 30 niños con LLA en remisión prolongada expresaban p53 mientras que este fenómeno se observó en 8 de 15 enfermos con recidiva (p = 0.01). Cuatro pacientes con remisión prolongada también expresaron MDM2 versus 10 de los 15 niños con recaída leucémica (p = 0.0007). En las muestras originales de médula ósea, la expresión exagerada de MDM2 fue más común en el grupo que presentó recidiva que en el grupo con remisión a largo plazo (p = 0.002). Lo mismo ocurrió con la expresión simultánea de ambas proteínas (p = 0.028). En el grupo control, hubo expresión de MDM2 en sólo un niño con enfermedad por depósito de lípidos (figuras 2, 3 y 4). INSERTAR FIGURAS 2 y 3 UNA AL LADO DE LA OTRAFigura 2. Detección por inmunohistoquímica de p53 en células de médula ósea en el momento del diagnóstico de leucemia linfoblástica aguda. Figura 3. Detección por inmunohistoquímica de MDM2 en células de médula ósea en el momento del diagnóstico de leucemia linfoblástica aguda. INSERTAR FIGURA 4Figura 4. (a) expresión de p53 y (b) expresión de MDM2 en células leucémicas en 30 pacientes con leucemia linfoblástica aguda con sobrevida prolongada (buena evolución) y en 15 enfermos con patología avanzada (evolución desfavorable). En el grupo control está compuesto por 11 pacientes con trastornos no malignos. Estos hallazgos coinciden con estudios moleculares en cuanto a que la alteración en la expresión de las proteínas p53 y MDM2 en el momento del diagnóstico era más frecuente en leucemias infantiles asociadas con fracaso terapéutico que en el grupo de enfermos con remisión prolongada.^6-16 En la mayoría de las investigaciones anteriores, la expresión de p53 y MDM2 se evaluó a nivel del ADN y ARN sin descripción de la expresión proteica. Algunos autores, por ello, enfatizaron la importancia de analizar las proteínas ya que p53/MDM2 pueden detectarse sin amplificación genética.^21-23 Un estudio reciente también reveló que el análisis genómico de tejidos conservados, fijados en formalina, se relaciona con el hallazgo de mutaciones artificiales.²⁵ Se requieren estudios prospectivos para conocer si las alteraciones de p53/MDM2 en el momento de la recidiva representan modificaciones secundarias de aparición durante la enfermedad o si en caso de estar presentes en el momento del diagnóstico constituyen marcadores de evolución desfavorable. BIBLIOGRAFIA

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