Capillary electrophoresis for analysis of sulfonylureas in human serum

Abstract
Diagnosis of "factitious hypoglycaemia" is essentially based on the disclosure of hypoglycaemic agents in blood or urine. Aim of this study was to check the performance of capillary electrophoresis as a quantitative method for determination of chlorpropamide, tolbutamide, glipizide, gliclazide, glibenclamide in serum. Samples were added with the internal standard, purified by solid phase extraction and analysed by micellar electrokinetic capillary chromatography. Pharmacokinetics of gliclazide (80 mg tablet) in a diabetic patient was assayed by capillary electrophoresis and gave results superimposable to the one found by HPLC. Two hypoglycaemic patients positive by HPLC analysis to unreported gliclazide and tolbutamide overdosage, were screened also by capillary electrophoresis that confirmed the HPLC diagnosis of surreptitious abuse of sulfonylurea drugs. Linearity (r² ³ 0.998) and recovery (³ 80%) were good for all the sulfonylurea drugs tested demonstrating its usefulness also for a quantitative application.

Key words
Capillary electrophoresis, sulfonylureas, plasma

Artículo completo
Introducción
La hipoglucemia es un trastorno grave y potencialmente mortal, desencadenado por niveles exagerados de insulina en ayunas.¹ No obstante, antes de diagnosticar un tumor secretante de insulina (insulinoma), el principal diagnóstico diferencial es la administración clandestina de agentes hipoglucemiantes orales o de insulina, que producen un cuadro clínico y hallazgos bioquímicos similares a los causados por la presencia del tumor. La identificación de sobredosis de fármacos hipoglucemiantes orales no informados puede evitar una laparotomía innecesaria o la pancreatectomía parcial por un presunto insulinoma. En los pacientes bajo sospecha, habitualmente se utiliza la técnica de HPLC para la identificación en sangre de los derivados de la sulfonilureas (SU), incluidas tolbutamida (TL), clorpropamida (CL), glipizida (GP), gliclazida (GL) y glibenclamida (GB), en un único análisis.^2,3El objetivo del estudio fue presentar un método de cromatografía electrocinética micelar capilar (CECC) capaz de identificar y cuantificar las concentraciones séricas de las SU administradas con mayor frecuencia, para ser utilizado además de la HPLC en el diagnóstico rápido y preciso de hipoglucemia medicamentosa. Para validar la metodología, se estudió por electroforesis capilar (EC) y por HPLC la farmacocinética sérica de la GL administrada por vía oral a un paciente con diabetes tipo 2. Además, se estudiaron con EC dos pacientes internados, con resultados positivos para abuso de SU, de acuerdo con la determinación por HPLC, confirmándose la presencia del agente hipoglucemiante con la técnica en estudio.Materiales y métodos
Electroforesis capilar
Un sistema P/ACE 5010 (Beckman Instrument, Palo Alto, CA), equipado con un detector ultravioleta monocromático, se ajustó a 200 nm y se controló con el software System Gold 8.1. El capilar de sílice fundido, de 50 µm de diámetro interno y 27 cm de longitud (20 cm hasta el detector), se colocó en un cartucho Beckman (apertura de la hendidura, 200 x 400 µm). Como amortiguadores (buffers) de almacenamiento se prepararon soluciones amortiguadoras de borato (0.5 mol/l, pH = 8.5) y fosfato (0.5 mol/l). Los amortiguadores de la corrida se prepararon a partir de los amortiguadores de almacenamiento por dilución a 0.005 mol/l y adición de 0.075 mol/l de colato de sodio, como se describió con anterioridad.⁴ Los amortiguadores de lavado se prepararon a partir de los amortiguadores de almacenamiento por dilución a 0.05 mol/l. Todos los amortiguadores se prepararon con agua bidestilada y se pasaron por un filtro de 0.45 µm antes de ser utilizados. El esquema analítico consistió en un prelavado a alta presión (20 psi) del amortiguador de corrida durante 3 minutos, inyección de la muestra a baja presión (0.5 psi) durante 2-5 segundos, inyección del amortiguador de corrida durante 1 segundo, separación a voltaje constante de +10 kV (alrededor de 37 µA), enjuague durante 1 minuto con amortiguador de lavado y enjuague durante 1 minuto con 0.1 mol/l de hidróxido de sodio. La temperatura capilar fue de 25 °C.Extracción de fase sólida
Se acidificaron muestras de suero (1 ml) con 1 mol/l (0.2 ml) de ácido clorhídrico, se agregaron al estándar interno (10 µl, véase más adelante) y se diluyeron 1:1 en agua. Se utilizaron cartuchos de extracción OASIS^TM HLB (3 ml, 60 mg) (Waters, Milford, MA) preactivados con 1 ml de MeOH y 1 ml de agua. Las muestras diluidas se cargaron en las columnas, lavándolas con agua (1 ml), agua:MeOH 95:5 (1 ml), 80:20 (1 ml), 70:30 (1 ml), 60:40 (1 ml). Después de lavar con aire durante 1 minuto se extrajeron las drogas con una mezcla de MeOH:CH₃CN 1:1 (1 ml), secándolas al vacío. Las muestras secas se reconstituyeron con 30-60 µl de una mezcla de CH₃CN:agua 60:40, se cargaron en la bandeja de muestras y se inyectaron.Curvas de calibración
Se prepararon soluciones estándar de almacenamiento de TL, CL, GP, GL y GB a 1 mg/ml en metanol, manteniéndolas a -20 °C. Las soluciones de trabajo de 0.2, 0.05 y 0.02 mg/ml se prepararon por dilución en agua bidestilada. Como estándar interno para la determinación de GP, GL y GB se utilizó TL (0.2 mg/ml), en tanto que para TL y CL se utilizó N-acetil-5-(2,3-diclorofenil ureido) benceno sulfonamida (0.5 mg/ml). Las curvas de calibración se prepararon agregando cantidades crecientes de SU y una cantidad fija del estándar interno a 1 ml de suero de control, tratándolos como se describió con anterioridad.Farmacocinética de gliclazida en suero
Se extrajo sangre de un paciente de sexo masculino con diabetes de tipo 2 en tratamiento crónico con GL (40 mg tres veces por día, antes de las comidas, durante 1 año) inmediatamente antes de la administración oral de un comprimido de 80 mg en horas de la mañana y después de 0.5, 1, 2, 3, 4, 6 y 8 horas. Las muestras de suero se estudiaron con HPLC y EC.Casos clínicos
Paciente 1: una mujer de 58 años concurrió a un consultorio externo por obesidad grave. Refería taquicardia, sudoración, debilidad y algunos episodios recientes de hipoglucemia. Se sospechó fuertemente un tumor secretante de insulina, pero después de 6 días de internación no había sido posible determinar la causa de la hipoglucemia. El esposo de la paciente era diabético y estaba medicado con GL. Se solicitó un rastreo para descartar abuso clandestino de SU.Paciente 2: una mujer de 44 años, afectada de epilepsia postraumática, asma, gastritis crónica y depresión, fue internada por episodios recientes de hipoglucemia. La paciente presentaba problemas familiares y psicológicos. Su padre era diabético y se encontraba en tratamiento con SU. La búsqueda de insulinoma fue negativa y, debido a las características clínicas de la enferma, se sospechó fuertemente el consumo encubierto de SU. Se obtuvo una muestra de suero que se envió al laboratorio para su evaluación.Resultados
La figura 1 muestra la corrida electroforética obtenida tras la inyección de una mezcla estándar (0.033 µg/µl) de GP, GL, TL, CL, GB y N-acetil-5-(2,3-diclorofenil-ureido) benceno sulfonamida como estándar interno. La identificación de los picos en las muestras de suero se realizó por comparación con un calibrador externo y en relación con el tiempo de migración del estándar interno (M_t). Cuando se analizó un suero de control bajo las condiciones descriptas, ningún pico de interferencia fue evidente en el M_t de todas las SU estudiadas (datos no presentados). La concentración mínima detectable (CMD) en suero fue de 0.2 µg/ml para GB y 0.1 µg/ml para el resto de las SU.

Figura 1. Separación de las sulfonilureas por electroforesis capilar. Una mezcla estándar de 0.033 g/l en metanol de seis SU se inyectó a presión durante 2 segundos (alrededor de 4.4 ml). La separación se realizó en 5 mmol/l de borato, 5 mmol/l de fosfato, 75 mmol/l de amortiguador de colato de sodio, pH = 8.5, 2.5% de metanol. El capilar de sílice fundido (20 cm x 50 µm) se conectó a un termostato a 25 °C y se realizó la separación aplicando un potencial de +10 kV (aproximadamente 37 µA). CL, clorpropamida; TL, tolbutamida; GP, glipizida; GL, gliclazida; GB, glibenclamida; EI, N-acetil-5-(2,3-diclorofenil ureido) benceno sulfonamida utilizada como estándar interno.

Se inyectaron mezclas de tres SU diferentes (0.066 µg/µl) 10 veces por día durante 10 días. Cuando se corrigieron las áreas de las SU para el estándar interno, el coeficiente de variación (CV%) diario de la relación del área fue inferior a 1% para todas las SU estudiadas.La figura 2 muestra las curvas de calibración obtenidas para GL, TL y GB en suero. Las ecuaciones de regresión se calcularon graficando la relación entre el área de las SU/estándar interno en comparación con la concentración sérica. Se utilizó TL (2 µg/ml de suero) como estándar interno para las determinaciones de GL y GB, en tanto que la N-acetil-5-(2,3-diclorofenil ureido) benceno sulfonamida (5 µg/ml de suero) se utilizó para la cuantificación de TL.

Figura 2. Linealidad del análisis de las sulfonilureas por EC. Los parámetros de las ecuaciones de la regresión lineal estimados mediante mínimos cuadrados fueron: Y = 0.438X - 0.073, r² = 0.9990 para GL; Y = 0.298X - 0.004, r² = 0.9997 para TL; Y = 0.447X + 0.028, r² = 0.9983 para GB. Se utilizó TL (2 mg/l de suero) como estándar interno para las determinaciones de GL y GB, en tanto que la N-acetil-5-(2,3-diclorofenil ureido) benceno sulfonamida (5 mg/l de suero) se utilizó como estándar interno para la cuantificación de TL.

En la figura 3 se presenta la curva farmacocinética en suero obtenida después de la ingesta oral de GL en un paciente con diabetes tipo 2. La concentración sérica de GL se cuantificó simultáneamente por HPLC y EC. Ambas curvas demostraron una tendencia similar y algunos puntos fueron prácticamente idénticos. Este resultado fundamentó la confiabilidad de la EC como técnica cuantitativa. Este mismo experimento también demostró que la concentración de GL necesaria para asegurar un control metabólico adecuado en un paciente diabético se encontraba en el rango de 0.7 a 1.2 µg/ml.

Figura 3. Farmacocinética de gliclazida en suero. La sangre se obtuvo en los momentos indicados antes (tiempo 0) y después de la administración de un comprimido de 80 mg de gliclazida a un paciente con diabetes tipo 2 en tratamiento crónico con ese medicamento (40 mg tres veces por día). La concentración de GL se determinó por HPLC y por electroforesis capilar.

La investigación de la presencia de SU por HPLC, con derivación y sin ella,^2,3 en el suero de la paciente 1 reveló la presencia de glicazida en una concentración de 12.1 µg/ml (datos no presentados). La corrida electroforética de la EC presentada en la figura 4 confirmó, en la misma muestra de suero, la presencia de un pico correspondiente al M_t de GL (3.9 minutos). Se utilizó TL como estándar interno y la cuantificación en relación con la curva de calibración correspondiente dio como resultado una concentración de 12.6 µg/ml.

Figura 4. Identificación de gliclazida en el suero de la paciente 1 por electroforesis capilar. Se agregó TL (2 mg/l) como estándar interno. Sólo se extrajeron 0.2 ml de suero para la curva de la paciente y la del estándar. Los extractos secos se reconstituyeron con 30 µl de una mezcla de CH₃CN:H₂O (60:40, v:v) y se inyectaron durante 5 segundos a baja presión. La concentración estimada del pico a un M_t de GL fue de 12.6 mg/l.
( __ ) Corrida electroforética obtenida del suero con extracción de fase sólida de la paciente 1.
( --- ) Corrida electroforética de un suero de control con agregado del estándar de GL (1 mg/l).

La autoadministración encubierta de TL revelada en la paciente 2 mediante el análisis con HPLC con derivación y sin ella (datos no presentados), también se confirmó en el análisis por EC, como se observa en la figura 5, por la presencia de un pico correspondiente al M_t de TL (3.55 minutos) y con una concentración de 14.1 µg/ml. Se utilizó N-acetil-5-(2,3-diclorofenil ureido) benceno sulfonamida (5 µg/ml) como estándar interno. El pico a un M_t de 3.77 minutos, probablemente una farmacoterpia concomitante o un metabolito más polar, no correspondió a ningna de las SU analizadas y no fue evidenciada por la HPLC.

Figura 5. Identificación de tolbutamida en el suero de la paciente 2 por electroforesis capilar. Se agregó N-acetil-5-(2,3-diclorofenil ureido) benceno sulfonamida como estándar interno (5 mg/l) (EI). Los extractos secos se reconstituyeron con 60 µl de una mezcla de CH₃CN:H₂O (60:40, v:v) y se inyectaron a baja presión durante 2 segundos. La concentración estimada del pico en el M_t de TL fue de 14.1 mg/l. El pico a M_t de 3,77 minutos no correspondió a ninguna de las SU analizadas.
( __ ) Corrida electroforética obtenida en el suero extraido por fase sólida (1 ml) de la paciente 2.
( --- ) Corrida electroforética obtenida de un suero de control (1 ml) enriquecido con TL y estándar de GB (2 mg/l).

Conclusiones
La técnica de EC resultó una prueba muy rápida (menos de 6 minutos por análisis), relativamente firme, poco costosa (bajo volumen de amortiguadores y reactivos) y bastante reproducible con el uso de un estándar interno adecuado.La EC exhibió respuesta lineal excelente para todas las drogas estudiadas en el rango terapéutico y supraterapéutico y puede reemplazar fácilmente a la HPLC en los estudios farmacocinéticos. La EC confirmó el diagnóstico de hipoglucemia ficticia realizado por HPLC y demostró su utilidad para revelar el abuso encubierto de SU.Para ayudar al médico en el diagnóstico de insulinoma, actualmente seguimos un abordaje de identificación multiescalonado que incluye diferentes técnicas tales como RP-HPLC con detección UV directa, RP-HPLC con derivación a una precolumna y electroforesis capilar. Sólo cuando persiste la ambigüedad de los resultados o éstos no coinciden con las pruebas bioquímicas y las características clínicas solicitamos la confirmación con espectrometría de masa, más específica pero menos disponible.