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RESUMEN

La arritmia cardíaca sigue siendo la principal causa de muerte en el mundo occidental. La hipoxia desencadena una serie de respuestas celulares y moleculares y es un factor iniciador de arritmia. Sin embargo, aún no se comprende cómo las células captan las modificaciones en la tensión de oxígeno. El impacto de la hipoxia sobre los canales de Ca²⁺ tipo L se investigó en cardiomiocitos de cobayos mediante la técnica del clampeo en parches. La hipoxia inhibe la corriente basal en una forma que sugiere que la actividad está modulada por modificaciones en los residuos de cisteína del canal. Además, la sensibilidad del canal a la estimulación del receptor ß adrenérgico aumenta significativamente durante la hipoxia. Se discuten posibles mecanismos involucrados en dichas las respuestas. Los resultados brindan nueva luz en relación con la reacción de los cardiomiocitos a la hipoxia y el papel del canal cardíaco de Ca²⁺ tipo L.Palabras clave: hipoxia, canales iónicos, estimulación del receptor ß adrenérgico. ABSTRACT

Cardiac arrhythmia remains the leading cause of death in the western world. Hypoxia elicits a variety of responses both at the cellular and molecular level and is a common trigger of arrhythmia. However it is not understood how cells sense changes in oxygen tension. The effect of hypoxia on the L-type Ca²⁺ channel current was examined in guinea pig cardiac myocytes using the patch-clamp technique. Hypoxia inhibits the basal current in a manner that suggests that the activity is modulated through a modification of cysteine residues on the channel. In addition, the sensitivity of the channel to -adrenergic receptor stimulation is significantly increased during hypoxia. Possible mechanisms for the responses are discussed. These results provide some insight into the way in which cardiac myocytes respond to hypoxia and the role of the cardiac L-type Ca²⁺ channel.Key words: hypoxia, ion channels, -adrenergic receptor stimulationANTECEDENTES

La muerte súbita asociada con enfermedad coronaria sigue siendo la principal causa de muerte en el mundo occidental. Se estima que unas 250 mil personas fallecen cada año por patología coronaria en los Estados Unidos, dentro de la hora del inicio de los síntomas y antes de la llegada al hospital.¹ Estas muertes súbitas a menudo obedecen al desarrollo de fibrilación ventricular. A pesar de los múltiples trabajos en relación con las causas y efectos de la enfermedad cardíaca, los mecanismos que desencadenan arritmias que ponen en peligro la vida siguen sin comprenderse aún. Actualmente se dispone de información en relación con el origen genético de las arritmias heredadas.² La mayoría involucra defectos en las subunidades de los canales iónicos cardíacos que se acompañan de alteración de la conductancia a través del canal. Sin embargo, habitualmente se considera que la inducción de una arritmia cardíaca requiere un sustrato y de un factor desencadenante.³ La hipoxia puede ser uno de ellos,^4-6 pero los mecanismos por los cuales la hipoxia induce arritmia aún no se comprenden. Con la introducción de la técnica del clampeo en parches, ahora se sabe que la función de los canales iónicos puede modularse por modificaciones en la tensión de oxígeno. Los primeros canales que demostraron ser sensibles a los cambios en el nivel de oxígeno fueron los canales de K⁺ tipo 1 del cuerpo carotídeo.⁷ Desde entonces se han caracterizado canales iónicos sensibles al oxígeno en la vasculatura pulmonar, varias células neurosecretoras, músculo liso, neuronas del sistema nervioso central y cardiomiocitos.^8-13 Los canales iónicos no son las únicas proteínas que pueden modificar su función en respuesta a cambios en la tensión de oxígeno. La hipoxia desencadena una serie de respuestas a nivel celular y molecular. Ya sea que la hipoxia induzca liberación de neurotransmisores y factores de crecimiento o genere vasoconstricción arteriolar, el inicio de la respuesta a la hipoxia requiere de un sensor celular al oxígeno que detecte modificaciones en su concentración y que origine una secuencia de eventos que culmine en una respuesta funcional. La identidad del sensor de oxígeno que podría participar en las respuestas celulares agudas secundarias a cambios en el nivel de oxígeno es incierta. Varios estudios sugieren que la concentración local de oxígeno parecen afectar los canales iónicos que podrían actuar como sensores de oxígeno. La capacidad de modificar el comportamiento de un canal en un segmento de membrana en el cual los componentes citosólicos son mínimos sugiere que el proceso se limita a la membrana.^14,15En 1997, Fearon y colaboradores¹¹ demostraron que la subunidad recombinante ALFA_1c del canal cardíaco de Ca²⁺ tipo L es inhibida por la hipoxia. Asimismo, la capacidad de detectar cambios en la concentración de oxígeno se localizó en una región de 39 aminoácidos en el dominio C-terminal.¹³ Este fue el primer trabajo que identifica una región sensible al oxígeno en un canal iónico y que brinda algo de información en relación con la función directa del canal como sensor de los cambios en el nivel de oxígeno. Sin embargo, se remarcó que los parches de membrana que muestran cambios en la actividad de los canales en respuesta a la hipoxia también tienen mitocondrias y que estas podrían ser las responsables de las modificaciones funcionales del canal.¹⁶ Las mitocondrias pueden actuar como sensores de oxígeno ya que el transporte de electrones y la fosforilación oxidativa cesan en ausencia de oxígeno. Además, por su amplia distribución es razonable asumir que las mitocondrias puedan ser sensores universales de oxígeno. No obstante, no se sabe cómo las mitocondrias pueden actuar como sensores. Una posible explicación es que la hipoxia altera el estado redox de la mitocondria al descender la V_máx de la citocromo oxidasa.^16,17 Esto significa que los transportadores de electrones operan en el estado reducido, acelerando la producción de especies reactivas del oxígeno (ROS), como superóxido y peróxido de hidrógeno. Las ROS actúan luego como una señal en la respuesta a la hipoxia. Las señales de oxidación detectadas por colorantes fluorescentes como el 2’, 7'-diclorofluorescina (DCFH) indicaron que las ROS aumentan con la exposición de los cardiomiocitos a isquemia.¹⁸ Empero, también se ha encontrado una menor producción de ROS en respuesta a la hipoxia utilizando el mismo indicador fluorescente.^{19, 20} Las observaciones sugieren, entonces, que los mecanismos en la producción de ROS pueden ser más complejos que la simple alteración en la función de la citocromooxidasa. Otros sitios sugeridos como sensores de oxígeno incluyen una proteína hem o el complejo NADP(H)-oxidasa. Se considera que la regulación de los canales de K⁺ dependientes de Ca²⁺ de las células tipo I del cuerpo carotídeo involucra a una proteína hem.^21,22 En estos estudios, el monóxido de carbono revierte por completo la inhibición de los canales de K⁺ por hipoxia tanto a nivel celular como en parches con células fijadas, lo cual indica que la interacción del oxígeno con el canal no requiere mediadores citoplasmáticos. También se ha sugerido, sin embargo, que la modificación redox de las proteínas por la NADP(H)-oxidasa participa en las respuestas a la hipoxia y que la NADP(H) es per se el sensor de oxígeno. El sistema de la NADP(H)-oxidasa está integrado por subunidades ensambladas del complejo catalítico unido a la membrana, la gp91^phox y la p22^phox, que juntas forman la flavo citocromo b₅₅₈ y un componente citosólico regulador integrado por la p47^phox y la p67^phox. Los electrones que derivan de la NADPH se unen al oxígeno mediante la oxidasa lo cual se asocia con un incremento en la producción de ROS, superóxido y peróxido de hidrógeno. Las ROS actúan posteriormente como segundos mensajeros ligando la oxidasa a la proteína blanco. Se cree que en la vasoconstricción pulmonar hipóxica participa la NADP(H) oxidasa.²³ Sin embargo, los ratones transgénicos que carecen de la subunidad gp91^phox de la NADP(H) tienen menor generación de ROS a pesar de que la inhibición de los canales de K+ por la hipoxia y la vasoconstricción pulmonar hipóxica se mantienen.²⁴ Este fenómeno sugiere que otra subunidad, distinta a la gp91^phox de la NADP(H) estaría involucrada en las respuestas hipóxicas. En forma alternativa, el complejo de la oxidasa puede no estar activo; se sabe que la actividad aumenta con una variedad de agonistas vasoactivos.²⁵ Otras fuentes de ROS, como las mitocondrias, son responsables de los efectos registrados. Por lo tanto, la identidad del posible sensor de oxígeno sigue siendo controvertida. HIPOXIA Y LA CORRIENTE DE Ca²⁺ TIPO L

En primer lugar evalué el efecto no caracterizado aún de la hipoxia en la actividad basal de los canales de Ca²⁺ tipo L nativos, mediante la técnica del clampeo en parches de células enteras. Se burbujearon soluciones externas con nitrógeno al 100% hasta conseguir una PO₂ de 17 mm Hg, según un sensor de oxígeno. En forma coincidente con resultados de estudios con la subunidad ALFA_1c recombinante,^11-13 la hipoxia inhibió la corriente basal en un 22% (figura 1). INSERTAR LA FIGURA 1Figura 1. La hipoxia inhibe la corriente basal del canal de Ca²⁺ tipo L. A. Modificaciones en el tiempo de la corriente de membrana registradas durante una prueba de pulso de 75 mseg a 0 mV aplicado una vez cada 10 segundos. Inhibición de la corriente basal registrada durante la exposición a la solución hipóxica Tyrode que se revierte con el cambio a la solución Tyrode con oxígeno a tensión de medio ambiente. B. Media ± DE de las relaciones de voltaje y corriente (I-V) determinadas en 9 células durante el pasaje de voltajes de -60 mV a +80 mV. La I-V se registró en una solución de nisoldipina 2 µmol/l para indicar que las corrientes de calcio registradas fueron del tipo L. Con la finalidad de determinar si el efecto de la hipoxia era atribuible a la reducción de los grupos tiol del canal, las células se expusieron a hipoxia en presencia del agente oxidante específico de grupos tiol, 5,5'-ditio-bis(ácido 2-nitrobenzoico), DTNB. El DTNB atenuó el efecto de la hipoxia sobre la corriente basal. Asimismo, la exposición de los cardiomiocitos al compuesto reductor ditiotreitol (DTT) inhibió la corriente de Ca²⁺ tipo L en un 24%. Los hallazgos indican que la inhibición de la corriente basal durante la hipoxia involucra la reducción de grupos tiol en o cercanos al canal.El canal de Ca²⁺ tipo L es el principal determinante del nivel de calcio intracelular en los cardiomiocitos. El sistema nervioso autónomo interviene en forma esencial en la regulación de la función cardíaca y muchos de sus efectos están mediados por neurotransmisores simpáticos que regulan la actividad del canal iónico. Además, bajo ciertas condiciones fisiopatológicas, como hipoxia o isquemia, se produce un incremento en la conducción simpática. La estimulación de los receptores ß adrenérgicos aumenta la conductancia de numerosos canales iónicos.²⁶ En el caso del canal de Ca²⁺ tipo L, la unión de un agonista al receptor ß adrenérgico se acompaña de fosforilación del canal por una proteínquinasa A (PKA) dependiente de AMP cíclico, lo cual genera aumento en el pico de la corriente de entrada y un enlentecimiento en la inactivación de la corriente.²⁷ Se evaluó el efecto de la hipoxia sobre la sensibilidad del canal de Ca²⁺ tipo L al agonista ß adrenérgico, isoproterenol. Cuando las células fueron expuestas a hipoxia se registró un aumento significativo en la sensibilidad del canal de Ca²⁺ tipo L a la estimulación del receptor ß adrenérgico. La hipoxia disminuyó la K_0.5 para la activación del canal de 5.3 a 1.6 nmol/l (figura 2). INSERTAR LA FIGURA 2Figura 2. Activación de la corriente del canal de Ca²⁺ tipo L dependiente de la concentración de isoproterenol en ausencia (n = 5-11 en cada punto) y en presencia (n = 5-10 en cada punto) de hipoxia. La exposición a 10 µmol/l de isoproterenol representó una concentración estimulatoria supramáxima del agonista. La conductancia del Ca²⁺ (G_Ca) medida en cada concentración de isoproterenol se normalizó a G_Ca medida en presencia de 1 µmol/l de isoproterenol en la misma célula. Los datos se ajustaron a una ecuación logística utilizando un programa de ajuste por mínimos cuadrados no lineal (SigmaPlot, SPSS Inc.). Sería de esperar que el aumento en la sensibilidad del canal a un agonista del receptor ß adrenérgico, como adrenalina, aumente la conductancia de entrada de calcio durante el potencial de acción. El canal es el principal determinante de la fase en meseta del potencial de acción, coincidentemente con registros de una prolongación del potencial de acción en la isquemia del miocardio.⁵ Con la finalidad de evaluar si la hipoxia puede actuar a nivel del receptor ß adrenérgico se analizó el efecto de la hipoxia sobre la corriente activada por histamina. Además de la unión a los receptores histaminérgicos H₂, la histamina activa el canal a través de la misma vía dependiente del AMP cíclico que utilizan los agonistas del receptor ß adrenérgico. La hipoxia también originó un incremento en la sensibilidad del canal a la activación por histamina. Se observaron los mismos resultados cuando el canal se expuso a forskolina (que activa directamente a la adenilatociclasa) en presencia de hipoxia. Los resultados sugieren que la hipoxia actúa vía abajo del receptor ß adrenérgico.Con el propósito de determinar si el efecto de la hipoxia sobre la sensibilidad del canal al isoproterenol es consecuencia de modificaciones en los grupos tiol, se estudió la respuesta del canal al isoproterenol en presencia de DTT. La exposición de los cardiomiocitos al DTT simuló el efecto de la hipoxia sobre la actividad basal del canal y el impacto de la hipoxia sobre la sensibilidad del canal al isoproterenol. Se registraron efectos similares cuando las células fueron expuestas a DTT e histamina. Asimismo, el DTNB no alteró el efecto de la hipoxia sobre la sensibilidad del canal al isoproterenol (figura 3).INSERTAR LA FIGURA 3Figura 3. El compuesto oxidante específico de grupos tiol, DTNB, revierte el efecto de la hipoxia sobre la corriente basal de Ca²⁺ sin alterar la mayor sensibilidad del canal de Ca²⁺ tipo L al isoproterenol. A. Modificaciones temporales de la corriente de membrana de una célula expuesta a hipoxia, 200 µmol/l de DTNB y concentraciones crecientes de isoproterenol. B. el DTT simula el efecto de la hipoxia sobre la corriente basal de Ca²⁺ tipo L y el incremento en la sensibilidad del canal al isoproterenol. Experimento representativo de una célula expuesta a 1 mmol/l de DTT y concentraciones crecientes de isoproterenol. En relación con el impacto del DTNB, es importante señalar que el compuesto no es membrana permeable. Debido a que el DTNB atenuó el efecto de la hipoxia sobre la corriente basal pero no modificó el impacto de la hipoxia sobre la sensibilidad del canal al isoproterenol, los resultados sugieren que los sitios en los cuales la hipoxia modifica los grupos tiol son distintos.El canal cardíaco de Ca2+ tipo L está integrado primariamente por una subunidad transmembrana ALFA1c con cuatro dominios de estructura similar, cada uno con 6 hélices ALFA transmembrana y un rulo de poro entre los dominios 5 y 6 donde ocurre la conducción de iones.²⁸ Se sabe que el rulo citoplasmático tiene residuos de cisteína incluyendo un segmento de 39 aminoácidos supuestamente necesario para la captación del nivel de oxígeno.¹³ La subunidad auxiliar ß se localiza enteramente en el citoplasma. La mayor parte de la subunidad auxiliar ALFA₂DELTA es extracelular y se fija a la porción de membrana por un puente disulfuro.²⁸ Por ende, el canal contiene varios sitios intracelulares y extracelulares posibles de modificación redox. Se realizaron varios estudios para determinar el papel del óxido nítrico en el efecto de la hipoxia sobre la sensibilidad del canal a la estimulación del receptor ß adrenérgico. A pesar de que hay evidencia considerable que involucra al óxido nítrico en las respuestas cardíacas y vasculares, como en la regulación de la función del canal iónico, no encontramos evidencia de participación del óxido nítrico, GMP cíclico o proteinquinasa G en las reacciones a la hipoxia. Asimismo, se evaluó el papel de la proteinquinasa C (PKC) mediante inhibidores farmacológicos y péptidos inhibitorios de isoformas de PKC. También se analizó el papel de la isoforma PKCß, ya que estudios anteriores sugirieron que dicha isoforma se activa durante la hipoxia.²⁹ Un péptido inhibidor de una isoforma de PKC bloquea la actividad al evitar la traslocación y unión de la isoforma al receptor para quinasa C activada (RACK).³⁰ Los péptidos inhibitorios son herramientas útiles para identificar la función de una isoforma específica en las respuestas fisiológicas. El péptido PKCß atenuó el incremento en la sensibilidad del canal al isoproterenol durante la hipoxia mientras que el péptido PKCEPSILON no tuvo este efecto. Aunque la hipoxia sobre la isoforma PKCß puede involucrar la modificación de cisteínas en la propia proteína, no se puede excluir la posibilidad de que la hipoxia modifique grupos tiol en más de una localización de la proteína del canal sensibles a la PKC.Las ROS se generan como productos intermedios en el metabolismo celular. Desde hace tiempo se las consideran productos tóxicos del ambiente aeróbico, pero la evidencia reciente apunta también a la participación de las ROS como transductores de membrana en las células de mamíferos y se las ha involucrado en procesos fisiológicos y patológicos. Se considera que la mitocondria es un potencial sensor de oxígeno debido, en parte, a que contribuye con el nivel celular de ROS.^16,31-33 Aunque aún se discute el sitio de producción de ROS en la mitocondria, bajo esta hipótesis el oxígeno o las ROS pueden directamente interactuar con proteínas efectoras o activar una vía de transducción de señales.³¹En caso de que las ROS actúen como intermediarias en las respuestas a la hipoxia podrían ser buenos candidatos para alterar la funcionalidad del canal. Las ROS podrían modificar la reacción del canal a la activación por la PKA y PKC a través de la modificación de residuos de cisteína en la proteína del canal, tal como lo avalan observaciones de estudios con los canales epiteliales y cardíacos de cloro, CFTR.^34-37 La fosforilación por la PKC parece ser un prerrequisito en la activación aguda de los canales de cloro epiteliales por la PKA.³⁵ En el caso de los canales cardíacos de cloro, la exposición de las células a los ésteres de forbol desencadena poca o ninguna respuesta. Sin embargo, la activación de la PKA en presencia de un agonista de PKC potencia la respuesta.^34,37 La actividad basal de PKC parece regular la subsiguiente activación de los canales cardíacos de cloro, CFTR, por la PKA. Tanto los canales de cloro, CFTR, como los canales de Ca²⁺ tipo L tienen dos sitios de fosforilación por PKA, cada uno de ellos asociado con distintas modificaciones en el comportamiento del canal.³⁸ Por ejemplo, la fosforilación del canal por la PKC puede suprimir la fosforilación por PKA de sitios inhibitorios del canal. Así, las ROS podrían, en teoría, intervenir en una respuesta alterada del canal a la PKA y PKC que involucra una modificación de las cisteínas en los sitios de fosforilación del canal. CONCLUSIONES

Los hallazgos contribuyen a la identificación de algunos de los mecanismos por los cuales los cardiomiocitos captan las modificaciones en el nivel de oxígeno sin excluir otros posibles elementos de detección. La fisiopatología subyacente en la isquemia e infarto de miocardio durante los episodios de hipoxia es compleja. Sin embargo, las observaciones brindan cierta luz en relación con el papel de los canales de Ca²⁺ tipo L en la respuesta a la hipoxia y representan un paso más en la comprensión de cómo la hipoxia desencadena arritmia en el miocardio isquémico. AGRADECIMIENTOS

El estudio fue apoyado por el National Health and Medical Research Council de Australia. La doctora desea agradecer al Dr. Peter Arthur por el aporte de estudios relacionados con el papel de las mitocondrias. BIBLIOGRAFIA

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