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RESUMEN

La identificación de epitopes individuales y el mapeo de la estructura antigénica de la proteína E de algunos flavivirus ha sido realizada mediante el uso de anticuerpos monoclonales (AcM) en análisis competitivos, serológicos y de mutantes de escape (1). El mapeo de epitopes con análisis competitivo mediante ensayos inmunoenzimáticos de tipo ELISA utiliza generalmente dos AcM diferentes para determinar la capacidad de unión al mismo antígeno sin interferencia entre ambos (2), y el ELISA de aditividad permite determinar si los dos anticuerpos reconocen exactamente el mismo determinante antigénico, comparten estructuras sobrelapadas o si los determinantes antigénicos reconocidos son totalmente diferentes (3,4). El presente trabajo tiene como objetivo determinar si los AcM H3/6 y 4G3 generados contra la cepa prototipo Nueva Guinea C y A15, ambas del serotipo 2 del virus dengue, reconocen en la proteína E del virus epitopes diferentes, sobrelapados o iguales y si éstos pueden ser reconocidos a su vez por paratopes presentes en sueros de diferentes especies. Para cumplimentar estos objetivos se emplearon diferentes inmunoensayos de tipo ELISA. Se utilizó la técnica de tinción por la peroxidasa para la visualización de este reconocimiento cuando el virus fue multiplicado en diferentes sistemas celulares. Los resultados obtenidos contribuirán al mapeo epitópico de dicha proteína y al mejoramiento del diagnóstico de esta enfermedad. Palabras clave: anticuerpos monoclonales, dengue, mapeo de epitopes, inmunoensayo, ELISA. SUMMARY

Individual epitopes identification and epitope mapping of antigenic structure of E protein of some flavivirus has been realize using monoclonal antibodies (MAb) in competitive, serological and escape of mutant analyses (1). Epitope mapping using competitive analysis such as ELISA, generally employ 2 different MAbs to determine the join capacity of the antigen at the same time without interference between them (2); Also aditivity ELISA allow, to resolve if both MAb exactly recognize the same antigenic determinant, share overlap structure or if the antigenic determinants recognized are totally different (3,4). This work has as objective to know if the MAbs H3/6 y 4G3 generated against New Guinea C strain prototype and A15 Cuban strain dengue 2 virus (5, 6) recognize different, overlapped or equal epitopes on the E protein and if they can be recognized by other paratopes on different species sera. To fulfill these aims were employs different immunoassays as ELISAs. Peroxidase stain technique was used to visualize this recognition when the virus was multiplied in different cellular systems. Key words: monoclonal antibodies, dengue, epitope mapping , immunoassays, ELISA.MATERIALES Y METODOS

Medios y cultivos celulares empleados en los diferentes estudios
Células C6/36 HT (Aedes albopictus) descriptas por Zhu, 1987, y gentilmente donadas por el Dr. Javier Díaz (Laboratorio Departamental de Medellín, Colombia) fueron crecidas a 33 °C en medio esencial mínimo de Eagle (E-MEM) compuesto por 0.2 moles/l de aminoácidos no esenciales y antibióticos (100 U/ml de penicilina y 100 g/ml de estreptomicina), 1% de glutamina y 10% de suero fetal bovino inactivado (SFBI) a una razón de pase semanal de 1:10 y mantenidos en el Laboratorio de Cultivo de Células del Instituto de Medicina Tropical «Pedro Kouri» (IPK). El medio de mantenimiento de dichas células consistió en el medio de crecimiento pero con suplemento de SFBI al 2% (Gibco).Células BHK-21 clono 15 (baby hamster kidney) gentilmente donadas por el Prof. S.B. Halstead, de la Fundación Rockefeller, EE.UU., fueron mantenidas a 37 °C, en medio MEM, con aminoácidos no esenciales y 10% de SFBI a una razón de pase semanal de 1:8. El medio de mantenimiento consistió en medio de crecimiento, suplementado con SFBI al 2%.Células Vero (ATCC 1992) se crecieron a 37 °C en medio 199 (Gibco) suplementado con SBFI al 5% a una razón de pase semanal de 1:8 en medio de mantenimiento de igual composición al de crecimiento pero suplementado con SBFI al 2%.Anticuerpos monoclonales
Los AcM H3/6 y 4G3 obtenidos en el IPK (5, 6) fueron producidos in vivo en ratones BALB/c previamente irritados en el peritoneo con 0.5 mL de Pristane (Sigma, St Louis, MO). Purificación de los nticuerpos monoclonales
Los AcMs fueron purificados utilizando proteína A acoplada a Sepharose 4 Fast Flow (Pharmacia-17-0974-01). Los líquidos ascíticos conteniendo los AcMs fueron filtrados por 0.45 µm y diluidos vol/vol con el tampón de corrida (glicina 1.5 M / NaCl 3 M pH 8.9) para ser pasados por la columna de proteína A y los anticuerpos de interés fueron eluidos con tampón ácido cítrico 0.1 M pH 6.La concentración de los AcMs fue determinada utilizando el método del ácido bicínconínico (BCA, Pierce) utilizando una curva patrón de albúmina a una concentración de 7 µg/ml hasta 2 mg/ml.CARACTERIZACIÓN DEL VIRUS DENGUE MEDIANTE ACM

Reconocimiento de epitopes
Ensayo de aditividad. Se realizaron inmunoensayos de aditividad de anticuerpos para determinar si los AcMs reconocían, un mismo epitope, epitopes sobrelapados o epitopes diferentes (4). Se estudió previamente, en un ELISA tipo “sandwich”, la concentración saturante del AcM para 1g/mL de virus dengue purificado. El índice de aditividad (IA) fue calculado según la fórmula (IA=100 ([2A1+2)/(A1+A2)]-1), donde A1, A2 y A1+2 fueron los valores de absorbancia alcanzados con el primer anticuerpo solo, el segundo anticuerpo solo y los dos anticuerpos unidos, respectivamente. Los pares de AcM con índices mayor que 50%, 25-50%, o inferiores a 25% definieron, o bien el mismo epitope, epitopes parcialmente sobrelapados o epitopes discretos, respectivamente.Con el objetivo de determinar si los AcM en estudio reconocían epitopes que a su vez podían ser reconocidos por anticuerpos presentes en sueros de distintas especies. Se realizaron ensayos inmunoenzimáticos de competencia utilizando los AcM provenientes cada uno de las FD-2 A15 y NG-C, purificados y conjugados con la enzima peroxidasaConjugación con peroxidasa
Los AcM fueron conjugados con la enzima peroxidasa proveniente de rábano picante (tipo VI, Sigma) según el método del peryodato (7). Previamente los AcM fueron purificados (6).Los AcM a una concentración de 10 mg/ml y dializados en CB fueron conjugados con 8 mg de peroxidasa activada con peryodato de sodio 0.01 M dializada durante 18 h en tampón acetato de sodio pH 4.4 a 4 °C. Una vez conjugados los AcM, fue detenida la conjugación por adición de borohidruro durante 2h a 4 °C y dializados contra PBS a 4 °C toda la noche. El conjugado fue liberado de la peroxidasa no conjugada por precipitación en sulfato de amonio y diálisis en PBS. El título se determinó mediante un da-ELISA. Seguidamente fue distribuido en alícuotas y almacenado a –20 °C hasta su uso. ELISA competitivo (c-ELISA)
Se establecieron condiciones de competencia entre el AcM no conjugado fijado al soporte sólido y el AcM conjugado. Para ello fueron recubiertas placas (Costar, USA) de 96 pozos con el AcM FD-2 NG-C y A15 purificados a concentraciones de 5,10 y 20 µg/ml en CB a 100 µL por pocillos. Como antígeno se emplearon suspensiones de CRL de los cuatro serotipos del virus dengue, descripto previamente. Los conjugados AcM FD-2, NG-C peroxidasa (AcM-NG-C-Px) y AcM FD-2 A15 peroxidasa (AcM-A15-Px) se utilizaron a una dilución 1:200 y 1:100 respectivamente en PBS-T y suero de carnero al 5%. La reacción fue revelada con OPD más peróxido de hidrógeno como sustrato, y la lectura se realizó en un Multiskan Titertek a 492 nm. Se consideraron positivas aquellas muestras cuyas densidades ópticas (DO) fueron >= 2DO del C(-).ELISA de inhibición (i-ELISA)
Para definir si este epitope viral podía ser reconocido por paratopes presentes en sueros de diferentes especies se realizó un ensayo ELISA de inhibición. Se recubrieron placas de 96 pozos (Costar) con 10 µg/mL de IgG humana antidengue en TR y se incubó toda la noche. El bloqueo se realizó con AB 1% 1h 37 °C, posteriormente fue añadido como antígeno CRL inoculado con el virus D-2 A 15 en una dilución 1:20. Se usó un panel de sueros humanos de pacientes seropositivos a dengue previamente evaluados por un ELISA de captura de IgM (8) para la determinación de la positividad y por un ELISA de inhibición para determinar anticuerpos totales y clasificarlos como casos de infección primaria o secundaria (9). Como controles se utilizaron sueros humanos negativos. Estos sueros fueron añadidos en diluciones seriadas desde 1:20 hasta 1:320. El conjugado AcM-NG-C-Px 1:2000 se empleó como conjugado. La reacción fue desarrollada a través de la acción de la OPD y el peróxido de hidrógeno como sustrato. Los lavados y períodos de incubación se realizaron como es característico en estos ensayos. La lectura fue realizada en un Multiskan Titertek a 490 nm. Los resultados fueron analizados según los porcentajes (%) de inhibición obtenidos. Se consideró una inhibición positiva cuando existía una disminución de la DO de la muestra en un 50% o más con relación al control negativo. El mismo protocolo fue utilizado para el estudio de un panel de sueros murinos hiperinmunes al virus dengue-2 A15.RESULTADOS Y DISCUSION

ELISA competitivo
Los AcMs H3/6 y 4G3 conjugados con peroxidasa (H3/6-Px y 4G3-Px) y evaluados por ELISA presentaron como dilución óptima de trabajo 1:2000 y 1:1000 respectivamente. La competencia entre estos AcM como recubrimiento y conjugados con la enzima, al ser enfrentados a los 4 serotipos del virus dengue, mostraron que eran capaces de reconocer estos antígenos tanto cuando los AcM estaban fijados en el soporte sólido como en suspensión conjugados con la enzima. Sin embargo, el 4G3-Px fue poco reactivo en general, reconoció los 4 serotipos del virus capturados por el propio AcM purificado, con una baja señal, la que fue mayor en el caso del D2 sobre todo cuando el virus fue multiplicado en cerebro de ratón lactante como se observa en la figura 1.INSERTAR LA FIGURA 1IEL AcM 4G3 reconoció a los 4 serotipos del virus dengue pero su reactividad fue mayor frente al serotipo 2. Este AcM fue enfrentado a dos tipos de antígenos (virus multiplicado en cerebro de ratón lactante, CRL y en células infectadas) ya que su selección primaria se realizó a partir de un ELISA celular. Paradójicamente, la mayor reactividad se obtuvo cuando el virus se encontraba en CRL. Si tomamos en consideración que su reconocimiento al virus se determinó sobre células intactas y que éste ha presentado baja reactividad en ELISAs en los cuales la preparación antigénica se ha obtenido a partir de suspensiones celulares infectadas, consideramos lógicos estos resultados. El virus multiplicado en CRL es capaz de presentar la proteína E en una conformación mucho más natural que cuando el virus ha sido replicado en cultivos celulares y éstos han sufrido de alguna forma alteraciones, ya sean mecánicas, por desprendimiento, o químicas, para su preparación. El AcM 4G3 ni adherido a la fase sólida, ni en suspensión, ni conjugado con peroxidasa, es capaz de reconocer completamente al antígeno; esto indica, primeramente, que el paratope es distorsionado en la adsorción al soporte sólido y por otra parte sólo reconoce al antígeno en su forma nativa, o sea cuando el virus ha sido multiplicado en cultivos celulares, sugiriendo la naturaleza conformacional de este epitope.Por su parte el H3/6-Px reconoció los virus del complejo dengue (figura 2) de forma evidente y muy similar al policlonal humano conjugado con peroxidasa.INSERTALA FIGURA 2 ELISA de inhibición
En la determinación del sitio de reconocimiento al virus D-2 por el AcM H3/6 y los anticuerpos policlonales humanos mediante el i-ELISA, se estudiaron un total de seis sueros humanos con diferentes características como se muestra en la tabla 1.INSERTA LA TABLA 1Según la figura 3, el 100% de los sueros, excepto el control negativo (suero 1) presentaron un valor >= al 50% de inhibición, por lo que fueron considerados positivos. Como era de esperar, los mayores valores de inhibición se obtuvieron en los sueros donde existía una mayor cantidad de anticuerpos (infección secundaria) y en ambos casos (infección primaria y secundaria) el conjugado H3/6-Px fue capaz de reconocer el antígeno viral cuando había poca o ninguna presencia de anticuerpos en el suero humano (figura 3).INSERTAR LA FIGURA 3 Este conjugado tuvo un comportamiento similar cuando fueron probados sueros inmunes murinos en el ensayo. Sin embargo cuando fue utilizado el conjugado 4G3-Px tuvo un comportamiento diferente, el reconocimiento fue determinado con una baja señal de DO tanto para los sueros humanos como murinos. Como fue presentado, los conjugados H3/6-Px y 4G3-Px fueron capaces de reconocer el antígeno viral en ausencia de anticuerpos en el suero humano resultando el H3/6-Px el de mayor reactividad.El hecho que el H3/6-Px reconoció a los 4 serotipos del virus dengue cuando estaba absorbido directamente a la fase sólida indica que la inmovilización de este no distorsiona la conformación estructural del paratope en su reconocimiento al antígeno. Ello sugiere que la región de reconocimiento no se encuentra comprometida con las interacciones no covalente que unen a las Igs a los soportes sólidos.Investigaciones previas han demostrado que en los ensayos inmunoenzimáticos sobre fase sólida las proteínas pueden sufrir alguna desnaturalización o distorsión conformacional al ser adsorbidas al plástico (10), al igual que ocurre en la partículas virales intactas que pueden sufrir cambios antigénicos al adsorberse a la fase sólida y exponer epitopes que son inaccesibles al anticuerpo cuando la proteína está en solución (11).Uno de los métodos de diagnóstico para el virus dengue, y muy utilizado en estudios epidemiológicos, es el ELISA de inhibición (9,12). La sustitución en este ensayo de una mezcla de inmunoglobulinas humanas anti-dengue conjugadas con peroxidasa, por el AcM H3/6-Px propicia la utilización de una fuente propia inagotable, específica y barata para su realización. BIBLIOGRAFIA

1. Roehrig J. En: The Togaviridae and Flaviviridae. Schlesinger S Schlesinger MJ, eds. N. York: Plenum Press, 1986:251-278.
2. Dekker EL, Porta C, Van Regenmortel MHVLimitations of differents ELISA procedures for localizing epitopes in viral coat protein subunits. Archives Virology 1989;105:269-286.
3. Simantini E, Banerjee K. Epitope mapping of dengue 1 virus E glycoprotein using monoclonal antibodies 1995; 140:1257-1273.
4. Lundkvist A,. Hemorrhagic fever with renal syndrome. Characterization of etiologic agents and antibody responses. PhD Thesis. Department of Virology, National Bacteriological Laboratory ,National Defense Researche Establishment, Stockholm, Sweden. 1993;26.
5. .Hermida C, Pupo M, Guzmán MG, González M, Marcet R. Empleo de un monoclonal anticomplejo dengue en la purificación viral. Rev Cub Med Trop 1992;44(3):171-176.
6. Pupo M, Rodriguez H, Vazquez S, Vilaseca JC, Alvarez M et al Monoclonal antibodies raised to the dengue-2 virus (Cuban: A15 strain) which recognize viral structural proteins. Hybridoma 1997:16(4):347-353
7. Nakane PK, Kawaoi A. Peroxidase-labeled antibody a new method of conjugation. The Jornal of Histochemestry and Cytochemestry.1974;22(12)1084-1091.
8. Vázquez S, Saénz E, Huelva G, González A, Kourí G, Guzmán MG. Detección de IgM contra el virus dengue en sangre entera absorbida en papel de filtro. Pan Am Jour Pub Health 1998:3(3):174-178
9. Vazquez S and Fernandez R. Utilización de un método de inhibición de ELISA en el diagnóstico serológico del dengue. Reporte Preliminar. Rev Cub Med Trop. 1989;41:18-26
10. Al Moudallal Z, Briand JP, Van Regenmortel MHV. Monoclonal antibodies as probes of the antigenic structure of tobacco mosaic virus. EMBO J 1982;1:1005-1010.
11. Van Regenmortel MHV. The structural of viral epitopes En: . Regenmortel MHV Neurath AR, eds. Immunochemestry of viruses, II . The basis of serodiagnosis and vaccines. : Amsterdam, N. York, Oxford. Elsevier Science Publishers, 1990:1-17.
12. Fernández R y Vazquez S. Serological diagnosis of dengue by an ELISA inhibition method (EIM). Mem Inst Oswaldo Cruz, Río de Janeiro 1990;85:347-351
13. Pontes RJ and Neto AR. Dengue em localidade urbana da regiao sudete de Brasil: aspectos epidemiológicos. Rev Saúde Pública 1994;28(3):217-227.
14. Després P, Frenkiel MP, Deubel V. Differences between cell membrane fusion activities of two dengue type isolates reflect modifications of viral structure. Virology 1993;196:209-219.
15. Guzmán MG, Deubel V, Pelegrino JL, Rosario D, Marrero M, Sariol C, Kpurí G. Partial nucleotide and aminoacid sequences of the envelope/non-structural protein-1 gene junction of four dengue 2 virus strains isolated during 1991 Cuban epidemic. Am J Trop Med Hyg. 1995;52:241-246.
16. Ricco-Hesse R. Harrison L, Salas D, Tovar D, Nisalak A, Ramos C et al. Origins of dengue type 2 viruses associated with increased pathogenecity in the Americas. 1997;230:244-251.
17. Camacho DE, Guzamán MG. Morier L, Álvarez M, Rodriguez R, Comach G. Estudio de algunas propiedades biológicas de 3 cepas de dengue 2 con diferencias en sus secuencias nucleotídicas. Rev Cub Med Trop 1999;51(3)177-181.
18. Lee E, Weir RE and Dalgarno L. Changes in the dengue virus major protein on passaging and their localization on three dimensional structure of the protein. Virology 1997;232:281-290.
19. Chen Y, Maguire T, Marks RM. Demonstration of binding of dengue virus envelope protein to target cells. J Virol 1996;70(12):8765-8772.