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RESUMEN

Las bacterias del género Azospirillum son conocidas como rizobacterias promotoras del crecimiento de las plantas, capaces de fijar el nitrógeno atmosférico. El interés agronómico por dicho género se basa en los beneficios potenciales que presentan algunas cepas para ser utilizadas como biofertilizante. En este estudio se analizan 100 aislamientos procedentes de 32 localidades cultivadas con caña de azúcar en Tucumán, Argentina. La caracterización se basó en técnicas microbiológicas clásicas y moleculares. Con el objeto de estudiar la relación entre los aislamientos y las características ambientales de la región cañera se realizaron perfiles plasmídicos, detección de fragmentos de los genes nifH y nirS, estudio de polimorfismos del ADN mediante RAPD y análisis con antibióticos. Así, se determinó la presencia de A. brasilense (90%) y A. amazonense (10%), distribuidos preferentemente en localidades con mayor precipitación pluvial promedio anual y endofíticamente en las raíces de caña de azúcar, observándose una marcada diversidad intraespecífica. Según este estudio, la precipitación pluvial es el factor ambiental más relevante que estaría influyendo en la distribución de Azospirillum en la región cañera de Tucumán, seleccionando genotipos particulares, de acuerdo con sus aptitudes fisiológicas para los factores abióticos locales. Palabras claves: Azospirillum, caña de azúcar, precipitación pluvial, RAPD, rizobacteria. ABSTRACT

Bacteria of the genus Azospirillum are known as plant-growth promoting rhizobacteria, with capacity of fixing atmospheric nitrogen. Some strains of this genus have agronomic interest because they can be used as biofertilizer. In this study, 100 isolates from 32 localities from the sugarcane cropping region of Tucumán, Argentina, were analyzed. The characterization was through classical and molecular microbiological techniques. In order to study the relation between the isolates and the environmental characteristic of the sugarcane region, plasmid profiles, detection of a fragment of the genes nifH and nirS, study of DNA polymorphisms by RAPD and antibiotic analysis were performed. It was determined the presence of A. brasilense (90%) and A. amazonense (10%). The distribution of the strains was predominant in localities with higher annual mean rainfall values and endophyticaly in the sugarcane roots; it was oberved also a marked intraespecific diversity. Accoding to this study, the rainfall is the most relevant environmental factor that would influence the distribution of Azospirillum throughout the sugarcane area of Tucumán. The latter demonstrated, hence, that local abiotic characteristics do contribute to the selection of particular phenotypes, adapted to specific environmental conditions according to their physiological capacities.INTRODUCCION

Las bacterias del género Azospirillum pertenecen a la subclase Alfa de las Protobacterias y son conocidas como rizobacterias promotoras del crecimiento de las plantas, capaces de fijar el nitrógeno atmosférico (Okon y Vanderleyden, 1997). Fueron aisladas de numerosas gramíneas y cereales en todo el mundo, tanto de climas templados como tropicales (Patriquin et al., 1983). El interés agronómico por dicho género se basa en los beneficios potenciales que presentan algunas cepas para ser utilizadas como biofertilizante. Las cepas nativas de Azospirillum están adaptadas a su ambiente local; sin embargo, los factores ecológicos que resultan en la promoción o inhibición de las poblaciones naturales no son suficientemente conocidos. OBJETIVO, MATERIAL Y METODOS

En este estudio se plantea que las condiciones hidrológicas del área cañera de Tucumán influyen en la distribución de genotipos de Azospirillum y en la asociación planta-bacteria. Para ello, se tomaron muestras compuestas de suelo rizosférico y raíces de caña de azúcar de diferentes localidades de las tres zonas en que se dividió la región cañera estudiada, en función de sus principales características ambientales (tabla 1). Las muestras se procesaron según Döbereiner et al. (1995) a fin de aislar y caracterizar las bacterias. De 38 localidades analizadas, se detectó Azospirillum en 32. De los 100 aislamientos realizados el 60% proviene de la zona Oeste (con mayor precipitación pluvial), 21% de la zona Central y 19% de la zona Este (con menor precipitación) (tabla 1). (INSERTAR TABLA 1)El 64% de los aislamientos corresponde a bacterias que se localizan endofíticamente en las raíces de caña de azúcar, 23% a las que se encuentran en la superficie radicular y 13% en suelo rizosférico. El 90% de los aislamientos corresponde a A. brasilense y 10% a A. amazonense, según la caracterización microbiológica clásica y el análisis molecular de un fragmento del gen 16SrADN con posterior restricción enzimática, según Grifoni et al. (1995). La capacidad potencial de fijar nitrógeno en las cepas locales fue determinada mediante la amplificación por PCR (reacción en cadena de la polimerasa) de un fragmento de 390 pb del gen nifH, según Ueda et al. (1995). El ADN extracromosómico se detectó siguiendo el protocolo de Eckhardt (1978), modificado por Hynes y McGregor (1990). Se observó en la mayoría de los casos plásmidos crípticos, que varían en número y tamaño según la cepa. Estas características plasmídicas no están asociadas con un genotipo o especie particular de Azospirillum, ni a una distribución característica de cepas dentro del área cañera; solo reflejaron una gran diversidad genética extracromosómica. RESULTADOS

Se determinó que la actividad nitrito reductasa es predominante en los aislamientos de la zona Oeste y escasa en los de la zona Este del área cañera. Corresponden a A. brasilense y al tipo nirS de la enzima nitrito reductasa, observándose variabilidad intragénica en el fragmento de 890 pb de dicho gen, amplificado por PCR según Braker et al. (1998) y digerido enzimáticamente. El análisis por RAPD (polimorfismos de ADN amplificados al azar) (Williams et al., 1990) de los aislamientos de las tres zonas estudiadas (Oeste, Central y Este) reveló que existe una amplia diversidad genética intraespecífica, de acuerdo a los polimorfismos de ADN observados (figura 1). A pesar de ello, fue posible agrupar las cepas endofíticas locales de A. brasilense de acuerdo a las zonas estudiadas. Su diversidad también se observó en la resistencia a tres antibióticos (cloranfenicol, estreptomicina, ampicilina), y no se detectó relación entre el fenotipo sensible o resistente con las zonas de procedencia de las cepas.(INSERTAR LA FIGURA 1)Figura 1. Perfiles de ADN genómico generados por el método RAPD con 18 cepas endofíticas de A. brasilense aisladas de raíces de caña de azúcar en la provincia de Tucumán, Argentina. Las imágenes corresponden a las amplificaciones realizadas con los cebadores A-06 y A-08 (Biodynamics). A, marcador de peso molecular Ladder 100 pb (Promega); B, marcador de peso molecular Lambda EcoRI-HindIII (Promega)El estudio de la presencia del gen nirS de la enzima nitrito reductasa permitió determinar que en la diversidad genética detectada por RAPD en cepas locales de A. brasilense hay una subpoblación en la que el gen nirS no se encuentra representado en las distintas regiones del área cañera, por lo que contribuye a la diversidad metabólica en la región considerada en este trabajo. CONCLUSION

Según lo analizado en este estudio, la precipitación pluvial es el factor ambiental más relevante que estaría influyendo en la distribución de Azospirillum en la región cañera de Tucumán, seleccionando genotipos particulares, de acuerdo con sus aptitudes fisiológicas para los factores abióticos locales. La gran diversidad encontrada en los aislamientos locales de Azospirillum plantea el interrogante de si todos los genotipos derivan de un ancestro común o de varios, y en este caso, cuán rápido evolucionan de manera que pudieren ser seleccionados de acuerdo a la presión selectiva impuesta por los factores bióticos y abióticos dominantes establecidos en una región ecológica en particular. BIBLIOGRAFIA

1. Braker G, Fesefeldt A, and Witzel KP, (1998): Development of PCR primer systems for amplification of nitrite reductases genes (nirK and nirS) to detect denitrifying bacteria in environmental samples, Applied and Environmental Microbiology 64:3769-3775
2. Döbereiner J, Baldani VLD, and Baldani JI (1995b): Como isolar e identificar bacterias diazotróficas de plantas não-leguminosas, Brasilia-DF: EMBRAPA-SPI
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