Artículo completo
<sup>RESUMO

Este estudo investiga aspectos clínicos, laboratoriais, terapêuticos e evolutivos da leishmaniose tegumentar em Belo Horizonte, Sudeste brasileiro; incluindo 358 pacientes com leishmaniose cutânea (LC) e 25 com leishmaniose mucosa (LM). Os pacientes com LM apresentaram maior tempo de doença (X2= 41.15; p < 0.01) e maior freqüência de doenças simultâneas (OR = 3.11; IC 95% 1.2-11.2). As sensibilidades da reação intradérmica, da imunofluorescência indireta e da pesquisa direta do parasito foram de 78.4%, 79.3% e 69.,3%, respectivamente. A reatividade cruzada de soros de LTA com o antígeno bruto de Trypanosoma cruzi foi maior (12-46%) que com o antígeno recombinante rTc24 (6.7%). A caracterização molecular permitiu identificar-se 52 amostras do subgênero Viannia e quatro do subgênero Leishmania, sugerindo que a L.(V.) braziliensis é a principal espécie desta casuística. O tratamento com antimonial foi 100% eficaz, com 59% de efeitos colaterais. A recidiva após tratamento ocorreu em 10.1% de 318 pacientes seguidos por até dois anos após tratamento. A maioria das recidivas (31/32) ocorreu em pacientes com LC tratados com 15 mg/SbV/dia. Na investigação de critérios de cura, a reação intradérmica negativa foi o único fator associado a um risco três vezes maior de recidiva. Um aumento da dose ou do tempo de tratamento pode melhorar o prognóstico nestes casos. Palavras-chave: leishmaniose tegumentar, clínica, caracterização molecular, antimonial, critérios de cura.ABSTRACT

This study investigates clinical, laboratorial, therapeutic and prognostic aspects of American Cutaneous Leishmaniasis in Belo Horizonte, Southeast Brazil in 358 patients with Cutaneous leishmaniasis (CL) and 25 with mucocutaneous leishmaniasis (MCL). Compared to CL patients, the MCL patients reported longer duration of disease and higher frequency of other diseases. The sensitivity of skin test, indirect immunofluorescence reactions and direct detection of parasites was 78.4%, 79.3% and 68.3%, respectively. The cross-reactivity of leishmaniasis sera was greater with Trypanosoma cruzi crude antigen (12-46%) than with a recombinant antigen (rTc24-6.7%). Molecular characterization of 56 samples identified 52 parasites as belonging to the subgenus Viannia and 4 to the subgenus Leishmania; suggesting that L. (V.) braziliensis is the most prevalent species in this area. The treatment with antimoniate presented 100% efficacy, but 59% patients has side-effects. During two years of follow-up, there were 32/318 relapses after successful treatment. Most relapses (31/32) were of CL patients treated with 15 mg/SbV/day. The negative response to skin test was the only factor associated with a significant threefold increased risk of relapse. Higher dose or longer duration of treatment might improve the prognosis in these patients.Key-words: cutaneous leishmaniasis, clinical and laboratory aspects, molecular characterization, antimonial treatment, criteria of cure.INTRODUÇÃO

O presente trabalho contém informações complementares e atualiza o artigo originalmente publicado na Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical 34(1):5-12, 2001, intitulado «A leishmaniose tegumentar na região metropolitana de Belo Horizonte: aspectos clínicos, laboratoriais, terapêuticos e evolutivos (1989-95)». A leishmaniose tegumentar americana (LTA) foi uma parasitose de grande impacto médico e social no Brasil, nas primeiras décadas do século XX, quando a abertura de estradas e de áreas de colonização agrícola colocava os trabalhadores expostos à infecção em ambientes naturais até então inalterados. Na década de 40, afirmou-se que a progressão da derrubada de matas e a diminuição das possibilidades de criação de insetos transmissores, aliada à imunidade adquirida quando da infecção, resultariam no diminuição ou mesmo desaparecimento da moléstia.1 Entretanto, o que se observa é o recrudescimento da LTA, que passa a ter características de transmissão domiciliar e periurbana, atingindo principalmente populações de baixa renda. Em um inquérito realizado em área periurbana da Região Metropolitana de Belo Horizonte (RMBH), a LTA foi observada em adultos e crianças de ambos os gêneros, sugerindo transmissão peridomiciliar. Foram detectados flebotomíneos (Lutzomyia whitmani, Lu. intermedia e Lu. migonei) em áreas de mata e no peri/intradomicílio.2 Conhecer a população afetada pela LTA em Minas Gerais (MG), e principalmente na RMBH, é de fundamental importância para o estabelecimento de medidas eficazes de controle da doença.Diferenças na morbidade, resposta ao tratamento e prognóstico, determinadas em parte pela espécie de Leishmania, evidenciam a importância da caracterização do parasito prevalente em determinada região. A eletroforese de isoenzimas foi o método utilizado para a caracterização dos parasitos em áreas endêmicas de MG. Até o momento, a infecção por Leishmania (Viannia) braziliensis só foi confirmada em dez casos humanos e em seis roedores.3-5 A baixa sensibilidade do isolamento em cultura6 e a necessidade de grande quantidade de parasitos limita a utilização de isoenzimas. Neste trabalho, utilizamos a amplificação do DNA pela reação em cadeia da polimerase (PCR) e a posterior hibridização dos produtos de PCR com sondas moleculares.7 As altas sensibilidade e especificidade da PCR8 permitiram detectar e caracterizar o subgênero de Leishmania diretamente de tecidos e lesões cutâneas.O diagnóstico sorológico da LTA é feito geralmente através da reação de imunofluorescência indireta (RIFI). Entretanto, já foram descritas reações sorológicas cruzadas com antígenos de outros parasitos, principalmente o Trypanosoma cruzi.9 Neste trabalho, foi estudado um antígeno recombinante de T. cruzi com baixa reatividade cruzada com L. (L.) amazonensis10 para a diferenciação sorológica entre as duas infecções, ambas prevalentes em Minas Gerais.O tratamento da LTA apresenta duas limitações: a toxicidade das drogas disponíveis e a ausência de um critério de cura objetivo. Os antimoniais pentavalentes, apesar de sabidamente tóxicos, são as drogas de primeira linha no tratamento há mais de 40 anos. O controle de cura clínico é insatisfatório, pois são documentadas recidivas das lesões cutâneas e/ou mucosas mesmo após tratamento e cicatrização completa. O critério de cura parasitológico é pouco eficaz, dada a baixa sensibilidade da pesquisa do parasito mesmo antes do tratamento.11 Estudos brasileiros12,13 de evolução da LTA têm sido realizados através da análise retrospectiva de registros médicos, o que limita a análise dos resultados obtidos. O presente estudo é o primeiro do tipo prospectivo concorrente desenhado para investigar o papel dos fatores epidemiológicos, clínicos e laboratoriais como preditores da ocorrência de recidiva após tratamento.MATERIAL E MÉTODOS

Entre 1989 e 1995, foram atendidos 383 pacientes com LTA no ambulatório de referência para leishmanioses do Centro de Pesquisas René Rachou - FIOCRUZ, em convênio com a Secretaria Municipal de Saúde de Belo Horizonte e a Fundação Nacional de Saúde (FNS).Este estudo possui dois componentes, uma série temporal de casos e um estudo prospectivo (Figura 1). (INSERTAR LA FIGURA 1)Figura 1. Esquema representativo do desenho de estudo dos 388 pacientes com LTA. IDRM, Intradermorreação de Montenegro; RIFI, reação de Imunofluorescência Indireta; IgG, imunoglobulina G.A série temporal de casos foi desenvolvida para descrever as características sócio-epidemiológicas, clínicas e laboratoriais da LTA. O estudo prospectivo foi desenvolvido para verificar as variáveis preditoras da recidiva da LTA após tratamento com antimonial pentavalente. Os pacientes foram submetidos a exames diagnósticos, controle clínico, tratamento e acompanhamento. Após consentimento informado por escrito, foram incluídos no estudo os pacientes que apresentaram, além da suspeita clínica, pelo menos um exame complementar positivo: reação intradérmica de Montenegro (IDRM), reação de imunofluorescência indireta (RIFI) ou pesquisa do parasito9. Os pacientes responderam a questionário pré-definido que considerava variáveis sócio-demográficas (idade, gênero, cor, naturalidade, procedência, escolaridade, renda , ocupação e local de moradia) e clínicas (modalidade, forma e duração da LTA; morfologia, estágio, número e localização das lesões, casos familiares de LTA, doenças pregressas, doenças simultâneas e tratamento inespecífico). As lesões cutâneas foram localizadas por segmento corpóreo e classificadas como tipos impetigóide, ulcerado (úlcera franca ou crostosa), nodular, vegetante e linfangítico.14 A pesquisa de lesões mucosas foi feita com espéculo nasal, depressor de língua e por laringoscopia indireta. Todos os pacientes com exame da região naso-orofaríngea alterado foram enviados a um otorrinolaringologista para confirmação diagnóstica, para avaliação de cura e quando da suspeita de recidiva das lesões mucosas. Só foram considerados os diagnósticos enviados em relatórios assinados pelo especialista.Diagnóstico laboratorial
Os pacientes foram submetidos à IDRM, injetando-se 0,1 ml de antígeno feito de promastigotas mortas de L. (L.) amazonensis e padronizado em 40 µgN/ml na face anterior do antebraço.15 Foi considerada reação positiva uma enduração cutânea local > 5 mm após 48 ou 72 h.16A RIFI para anticorpos IgG total anti-Leishmania foi feita com antígeno obtido de promastigotas de L.(L.) amazonensis (cepa MHOM/BR/60/BH6), apenas em pacientes que ingressaram no estudo a partir de 1990. Utilizou-se como controle negativo soros do pessoal do laboratório, sem história de lesão cutânea e com IDRM negativa. A reação foi considerada positiva quando os títulos eram >= 1:80.16O ensaio imunoenzimático (ELISA) anti-T.cruzi foi feito com um antígeno protéico recombinante de 24 K Da, o rTC24, conforme técnica já padronizada.17 Uma alíqüota de soro foi encaminhada ao Laboratório da Fundação Hemominas, onde foram feitas RIFI (antígeno da Biolab-MérieuxR), hemaglutinação indireta (HAI) e ELISA (AbbottR) todas com antígeno bruto de T. cruzi. Foram considerados positivos os títulos >= 1:20 para a RIFI e/ou >= 1:16 para a HAI e uma absorvância >= 0, 500 ao ELISA .A retirada de fragmentos cutâneos para exame direto e isolamento de parasitos em cultura foi feita na borda da lesão, em condições estéreis, com um «punch» de 4 mm de diâmetro. A visualização do parasito foi obtida através da impressão de fragmentos de tecido por aposição em lâmina de vidro e coloração pelo Giemsa. Após 24 h em solução salina com antibiótico, o fragmento cutâneo era colocado em meio de cultura NNN/LIT e mantido a 25 °C. Para utilização na PCR, 46 fragmentos foram mantidos a –20 °C.O DNA para a PCR foi extraído de parasitos de cultura e de fragmentos de biópsias. Foi feito um lisado celular, através da adição, a cada tecido, de 25 µl de TE e proteinase K a uma concentração final de 100 mg/ml. Esta solução foi incubada a 56 °C por 2h, a 37 °C por 12 h e fervida por 15 min. Após centrifugação a 5 000 g por 2 min, 20 µl do sobrenadante foram estocados a –20 °C, para serem utilizados como fonte de DNA na PCR.Um par de oligonucleotídeos iniciadores flanqueadores da região conservada do minicírculo do DNA cinetoplástico (kDNA) foi utilizado na PCR.18 Foi utilizada um mistura contendo 200 mM de cada dNTP, 200 ng de cada iniciador, 2,5 mM de MgCl2 e 2,5 U de Taq DNA polimerase. Para um volume final de 20 µl, eram acrescentados 2 µl de DNA. Cada conjunto de reação possuía três controles positivos [DNA de L. (V.) braziliensis, L. (L.) amazonensis e L. (L.) chagasi] e um controle negativo (sem DNA). As condições da reação incluíam a desnaturação a 94 °C por 4 min, seguida de 29 ciclos de 30 seg de desnaturação a 94 °C, anelamento a 50 °C e extensão a 72 °C. Ao término da amplificação, a solução era mantida a 72 °C por dez minutos, visando aprimorar a extensão. Após a amplificação, os produtos eram analisados através da eletroforese em gel de agarose a 2% corado por brometo de etídio, com visualização sob iluminação UV ou visualização direta em gel de poliacrilamida a 8% corado pelo nitrato de prata.Na hibridização, foram utilizados como sondas minicírculos clonados de L. (L.) donovani, L. (V.) panamensis e L. (L.) mexicana marcados com -32P-dATP. Os produtos amplificados foram desnaturados em NaOH 0,4 N e aplicados em tréplica em membrana de nylon em aparelho de «dot-blot». Os filtros foram hibridizados em BLOTTO a 60 °C, lavados 3 vezes em 0.5x SSC a 60 °C e expostos a filmes de RX, por 12 h, a uma temperatura de intensificação do sinal de –70 °C.Tratamento dos pacientes
Todos os pacientes foram tratados com antimoniato de meglumina (GlucantimeR), via intramuscular, na dose de 15 mg/Sb.5+/Kg/dia para LC e 20 mg/Sb.5+/Kg/dia para LM,19 por ciclos de dez dias, com intervalos de dez dias entre os ciclos, em no mínimo 20 dias para LC e 30 dias para LM. O paciente foi instruído a não usar bebidas alcóolicas e interromper o tratamento e procurar assistência médica em caso de taquicardia ou oligúria. O controle eletrocardiográfico foi feito nos pacientes com idade >= 40 anos. Foram coletadas informações sobre a dose, efeitos colaterais e motivo de abandono. A medicação era fornecida para dez dias e o paciente orientado a retornar após este período. A cura foi definida como cicatrização da lesão até dez dias após o último ciclo.Estudo prospectivo
Para efeito da análise, a entrada do paciente neste estudo foi definida como a data do final do tratamento. Os pacientes incluídos foram avaliados clinicamente antes, durante e dez dias após o último ciclo de tratamento; e em retornos semestrais por dois anos. A RIFI foi realizada antes e dez dias após tratamento. A contagem de tempo ocorreu: a) ao fim de dois anos de seguimento, b) na data da recidiva, c) na data da última consulta, para os pacientes que não retornaram a todos os controles semestrais ou d) na data da última consulta antes do fim do estudo em 30/06/1996. Foi considerada como recidiva, após tratamento específico e cicatrização completa, a ocorrência de lesão cutânea em atividade no mesmo local da lesão cutânea anterior; a lesão mucosa nova em paciente com cicatriz de lesão cutânea anterior ou a lesão mucosa no mesmo local da lesão mucosa anterior. Ao final da participação do paciente no estudo, foi fornecido relatório com instruções de retorno se houvesse suspeita de recidiva.Análise estatística
As informações foram armazenadas em D-Base III e analisadas em EGRET.20 Utilizou-se distribuição de freqüência e testes não-paramétricos no estudo descritivo. As variáveis associadas às manifestações clínicas da LTA foram investigadas através de regressão logística múltipla, calculando-se a razão de chance (RC) e o intervalo de confiança a 95% (IC 95%). No estudo prospectivo, as variáveis associadas à recidiva foram examinadas utilizando-se as curvas de Kaplan-Meyer. O modelo de risco proporcional de Cox foi usado para determinar o efeito independente das variáveis na predição da recidiva.RESULTADOS

Participaram do estudo descritivo 250 (65.3%) homens e 133 (34.7%) mulheres, 216 (56.4%) não-brancos e 167 (43.6%) brancos, com idade entre 6 meses e 80 anos (mediana = 32 anos). Residiam em Belo Horizonte 110 (28.7%) pacientes, 151 (39.4%) em cidades da RMBH, 116 (30.3%) em outras cidades de MG e 4 em outros Estados. Quanto à escolaridade, 75 (19.6%) pacientes não foram à escola, 190 (49.6%) freqüentaram até 4 anos e 118 (30.8%) por mais de 4 anos. Cinqüenta e nove (15.4%) pacientes recebiam menos de um salário mínimo (SM), 191 (49.9%) de um a dois e 120 (31.3%) 3 ou mais SM. Treze (3.4%) pacientes estavam aposentados e 281 (73.4%): 59 (15.4%) pacientes eram menores, 39 (10.2%) donas de casa, 28 (7.3%) domésticas, 20 (5.2%) serventes de pedreiro, 16 (4.2%) comerciantes, 11 (2.9%) pedreiros e 108 (28.1%) tinham outras ocupações. Apenas 89 (23.2%) pacientes exerciam funções agrícolas:78 (20.4%) eram lavradores, sete (1.8%) vaqueiros e quatro (1.0%) lenhadores.Apresentação clínica
A LC ocorreu em 358 (93.5%) e a LM em 25 (6.5%) pacientes. Dois pacientes apresentaram perfuração do septo nasal e um perfuração do palato. O tempo de evolução da LC foi menor que 3 meses em 152 (42.5%) pacientes, de 3-6m em 139 (38.8%), de 6 m –12 m em 47 (13.1%) e maior que 12 m em apenas 20 (5.6%) pacientes. Para LM, 9 (36%) pacientes apresentaram menos de 12 meses e 16 (64%) mais de 12 m de evolução da LTA. Quando comparada aos casos de LC, os pacientes com LM apresentaram maior tempo de evolução da doença (X₁2 = 41.15; p = 0.01) e presença mais freqüente de doenças simultâneas (RC = 0.34; IC 95% 0.14 – 0.82) (Tabela 1). (INSERTAR LA TABELA 1)A lesão cutânea, com predomínio do tipo ulcerado, estava presente em 376 (98.2%) casos (Gráfico 1). Sete pacientes (1.8%) com a LM indeterminada não apresentavam lesão cutânea. As lesões cutâneas ocorreram em ordem decrescente em membros inferiores, superiores, cabeça, tronco, abdome e genitália (Tabela 2).(INSERTAR GRAFICO 1)Gráfico 1. Aspectos dermatológicos das lesões cutâneas.(INSERTAR TABELA 2)Diagnóstico laboratorial
A leitura da IDRM foi feita após 48 h em 329 (85.9%) e após 72 h em 36 (9.4%) casos. Dezoito (4.7%) pacientes não retornaram para a leitura. A reação foi positiva em 286/365 (78.4%) pacientes. Em 22 casos positivos, foi observada necrose no local de inoculação do antígeno. Esta reação foi mais freqüente nos pacientes com LM comparados aos pacientes com LC (X12 = 5.92; p = 0.001) (Tabela 3). (INSERTAR LA TABELA 3)A RIFI foi positiva em 265/334 (79.3%) pacientes: 245/313 (78.3%) reações positivas na LC e 20/21 (95.2%) pacientes na LM (Gráfico 2). (INSERTAR GRAFICO 2)Gráfico 2. Freqüência dos títulos à RIFI nos pacientes com LTA.Nos 335 pacientes que realizaram reações sorológicas com antígeno bruto de T. cruzi, 154 (46.0%) foram positivos à RIFI, 87 (26%) à HAI e 40 (11.9%) à ELISA. Vinte e três (7.0%) pacientes foram positivos à reação de ELISA com o rTc24 (Gráfico 3).(INSERTAR EL GRAFICO 3)Gráfico 3. Percentual de positividade dos pacientes com LTA à sorologia para doença de Chagas.A pesquisa do parasito foi realizada em 139 (36.3%) pacientes e positiva em 95/139 (68.3%) casos. O isolamento do parasito foi possível em 20/59 (35.6%) amostras. A amplificação do DNA por PCR e a posterior hibridização foi feita em 12 isolados de cultura e 46 biópsias. A PCR detectou uma banda específica de DNA (120 pb) em todas as amostras (100% de sensibilidade). Dos produtos amplificados, 54 (93%) hibridizaram com sonda de L. (V.) panamensis e quatro (7%) com a sonda de L. (L.) mexicana. A hibridização resultou na caracterização de 56 cepas humanas até o nível de subgênero, sendo que 53 pacientes com LC e três com LM. Dos 52 pacientes com cepas caracterizadas como pertencendo ao subgênero Viannia, L. (V.) sp, três infectaram-se provavelmente no Amazonas, 32 em cidades da RMBH e 17 em outros municípios de MG. Dos quatro casos com cepas identificadas como do subgênero Leishmania, L. (L) sp, três infectaram-se em municípios da RMBH e um na região leste do Estado de Minas Gerais (Figura 2). (INSERTAR LA FIGURA 2)Figura 2. Mapa representativo do estado de Minas Gerais, com a distribuição geográfica dos subgêneros de Leishmania caracterizados de 56 pacientes com leishmaniose tegumentar americana.A caracterização de L. (V.) sp ocorreu em fragmentos de três pacientes com LM. Em sete fragmentos obtidos de lesões recidivadas foi identificada L. (V) sp e em um L. (L.) sp. Em um paciente com LC, a L. (V.) sp. foi identificada tanto na lesão inicial como na recidiva. Tratamento dos pacientes
A cicatrização completa das lesões ocorreu em 377/383 (98.4%) pacientes. Seis (1.6%) pacientes não retornaram para o controle. O tempo de tratamento variou de 20 a 90 dias, com mediana de 20 dias. Doze (3.0%) pacientes fizeram tratamento por menos de 20 dias, devido à melhora clínica e recusa em continuar a medicação. Quinze (60.0%) pacientes com LM foram tratados por 30 dias, cinco (20.0%) por 40 dias, três (12.0%) por 50 dias e um (4.0%) por setenta dias. Vinte e sete (7.0%) pacientes não obedeceram à prescrição e tiveram intervalo maior que dez dias entre os ciclos. Duzentos e vinte e cinco pacientes (58.7%) queixaram algum efeito colateral durante o tratamento. Os adultos (>=18 anos) apresentaram maior freqüência de queixas (RC = 3.55; IC 95% 2,06 - 6,15). As queixas mais freqüentes foram: artralgia (10.2%), hiporexia e náuseas (9.2%), artralgia e mialgia (5.5%), dor no local da injeção (3.9%), mialgia (2.9%), exantema máculo-papular extenso (3.4%) e outras (cefaléia, tonteira e herpes zoster). As queixas foram tratadas sintomaticamente e não implicaram em interrupção do antimonial. Não foi observada arritmia que levasse à interrupção do tratamento ou caso de morte súbita.Estudo prospectivo - Preditores de recidivas após tratamento da LTA
Participaram do estudo prospectivo 318 pacientes; 65/383 (16.9%) pacientes atendidos não retornaram para o seguimento. Não ocorreram diferenças significativas nas características estudadas entre os pacientes que permaneceram no estudo e as perdas para o seguimento.A recidiva ocorreu em 31/300 (10.3%) casos de LC e 1/18 (5.5%) caso de LM. Estes pacientes eram 24 homens e oito mulheres com idade entre um e 64 anos (média = 32,54, DP = 17,29), 21 não-brancos e 11 brancos. Quatro pacientes tinham renda < 1SM, 16 de 1-2 SM e oito tinham renda >= 3 SM. Os casos de LC tiveram recidiva no mesmo local da lesão anterior, sendo que dois pacientes apresentaram também lesão mucosa nova. O paciente com LM apresentou lesão no mesmo local da lesão mucosa anteriorO tempo de tratamento dos pacientes com recidiva variou de 10 a 40 dias (mediana = 20 dias). Dois pacientes abandonaram o tratamento após 10 e 12 dias de medicação, devido à melhora clínica. Outro paciente foi tratado por 20 dias, mas com intervalo de 19 dias entre os dois ciclos. Todos os pacientes receberam um novo tratamento com antimonial, na mesma dose preconizada para o primeiro tratamento, com cicatrização completa das lesões. Seis pacientes apresentaram um segundo episódio de recidiva. Por dificuldade de internação e utilização de outras drogas (anfotericina B e pentamidina), estes pacientes receberam novo tratamento com antimonial, por 30 dias seguidos, com cicatrização das lesões. Nenhum destes pacientes apresentou nova recidiva em 12 meses de seguimento. O risco acumulado em dois anos para a ocorrência de recidiva foi igual a 10.5%. Ocorreram 19 recidivas em até três meses, 26 até 6 m e 30 até 12 m após tratamento (Tabela 4). (INSERTAR LA TABELA 4)A curva de probabilidade foi proporcional no tempo e permitiu a análise com risco proporcional de Cox. Não houve associação significativa entre a recidiva da LTA e gênero, idade, aspectos epidemiológicos ou clínicos da LTA (Tabelas 5 e 6). (INSERTAR LAS TABELAS 5 Y 6)A única associação evidenciada foi entre a resposta à IDRM e a recidiva (Gráfico 4). (INSERTAR EL GRAFICO 4)Gráfico 4. Probabilidade de não apresentar recidiva após tratamento, de acordo com a resposta à reação intradérmica de Montenegro (IDRM).A resposta negativa à IDRM aumentou em mais de três vezes o risco de recidiva (RR = 3.44; IC 95% 1.7 – 7.0). A resposta à RIFI, tanto antes como após o tratamento, não foi associada ao risco de recidiva (Tabela 6).DISCUSSÃO

A distribuição por gênero e idade sugere a coexistência de dois modelos de transmissão da LTA. O maior atendimento de homens e de adultos sugere transmissão extradomiciliar em população economicamente ativa,21 enquanto o atendimento de mulheres, crianças e pessoas com ocupações não ligadas a áreas silvestres sugere a transmissão intra e/ou peridomiciliar.2,22 A RMBH foi o local provável de infecção mais relatado, refletindo uma nova situação epidemiológica, com a expansão da LTA a regiões até então indenes.2 A baixa escolaridade e renda e o predomínio de ocupações pouco qualificadas reforçam o que a LTA, assim como a maioria das doenças infecto-parasitárias, é uma infecção que atinge principalmente as populações mais carentes.23,24 O pequeno percentual de ocupações agrícolas reflete o atendimento em área urbana com casos autóctones.25A apresentação clínica
O predomínio em áreas expostas do corpo e do aspecto ulcerado correspondem à descrição mais freqüente das lesões cutâneas por LTA.14,26 A ocorrência de lesões múltiplas em um terço dos pacientes: pode ser devida a várias picadas do vetor infectado, que explicam bem os casos de lesões mais distantes entre si ou à disseminação linfática/hematogênica em trajeto linear no mesmo segmento corpóreo, com lesões com aspecto «espotricóide» ou «linfangítico». A cicatrização da lesão sem tratamento pode ser fator de risco para a ocorrência de LM devido à persistência do parasitismo.16 Somente após terapia específica foi observada a cicatrização completa dos 20 casos de cicatrização parcial, ou o fim do eritema da borda das lesões nos dois casos de lesões já cicatrizadas, sugerindo persistência do parasito nestas lesões.Apesar de menos freqüente, a LM é geralmente mais grave e pode deixar seqüelas graves. Observamos 25 casos de LM virgens de tratamento, em ambos os gêneros e todas as faixas etárias, como já anteriormente descrito.27 O atendimento ambulatorial tende a selecionar casos mais brandos de LM, uma vez que casos mais graves são encaminhados para hospitais.28 A LM está principalmente associada à infecção por L. (V.) braziliensis29 e sua prevalência em áreas endêmicas depende da virulência do parasito, da imunocompetência do hospedeiro e da assistência médica prestada.30 Sua freqüência vem diminuindo nas áreas endêmicas antigas, não excedendo a 3%, provavelmente devido ao diagnóstico e tratamento precoces.31 Os 6.5% de casos de LM neste estudo podem ser devido à instalação mais recente da LTA na região. O maior tempo de evolução e a maior freqüência de doenças simultâneas na LM sugerem que a debilitação pela idade e doenças simultâneas podem contribuir para a ativação e/ou disseminação mucosa de Leishmania. Não há como definir se estes fatores foram causa ou conseqüência da LM.Diagnóstico laboratorial
A sensibilidade da IDRM para LC (78%) e para LM (88%) verificada neste estudo foi menor que a relatada na padronização da reação (96%) quando se considera como reação positiva a presença de vesícula ou área de enduração perceptível ao tato.15 No nosso estudo, só foram consideradas positivas as endurações com diâmetro > 5 mm, o que pode ter contribuído para a menor sensibilidade. Em um estudo com o mesmo antígeno e critério de positividade do nosso estudo, a sensibilidade da IDRM foi igual a 83.6%.32 As diferenças na sensibilidade podem refletir variações nas condições do laboratório e dos serviços de saúde. A maior freqüência de necrose no local de inoculação do antígeno nos pacientes com LM, já observada por outros autores,29,33 pode se dever a uma resposta imune celular exacerbada pela maior duração da doença e a estimulação prolongada de linfócitos, na ausência de uma modulação eficiente.34A comparação da sensibilidade da RIFI com os resultados obtidos em outras áreas endêmicas foi semelhante à da literatura, apesar dos diferentes antígenos (L.(V.) braziliensis,35 L. (L.) amazonensis33 ou L.(L.) major-like36) utilizados nas reações.A presença de reação cruzada na sorologia para T. cruzi e LTA já é conhecida.16 O grande percentual de reações cruzadas ao utilizar-se a sorologia convencional para doença de Chagas em pacientes pode ser em parte devido ao menor ponto de corte utilizado para triagem em bancos de sangue, onde se requer máxima sensibilidade, mesmo em detrimento da especificidade.27 A freqüência de reações positivas ao rTc24 é compatível com a prevalência de 2-4.5% de doença de Chagas relatada em doadores de sangue.38 Apesar da alta especificidade do rTc24, resultados falso-positivos não podem ser excluídos, já que é improvável que cinco pacientes que nasceram e residem na RMBH sejam chagásicos. Entretanto, a infecção concomitante por T. cruzi e L. (V.) braziliensis já foi descrita39 e pode explicar as reações positivas ao rTc24. O uso de um antígeno específico para T. cruzi é fundamental para o diagnóstico sorológico da DC em áreas endêmicas para LTA ou LV. Podemos afirmar que o rTC24 é um antígeno com menor reatividade com soros de LTA que as reações sorológicas convencionais. Sua real especificidade só poderá ser aferida através de exames específicos (hemocultura ou hibridização com sondas moleculares).40O alto percentual de sensibilidade (100%) da PCR, também relatada em estudo com os mesmos iniciadores,18 reforça a importância desta técnica para o diagnóstico parasitológico rápido e sensível em amostras clínicas, sem necessidade de isolamento do parasito. Já que a LTA aflige principalmente a população de baixa renda de países em desenvolvimento, deve-se visar a diminuição do seu preço.7Um dos nossos objetivos foi a caracterização da espécie de Leishmania prevalente na região estudada. A eletroforese de isoenzimas foi o primeiro método de caracterização utilizado, mas a baixa sensibilidade do isolamento de parasitos em cultura41 limitou sua utilização. Optou-se então pela PCR e a hibridização com sondas, que só permitem a caracterização de Leishmania até subgênero.41 Mesmo assim, oito (72.7%) amostras foram caracterizadas como L. (V.) braziliensis e três (27.3%) como L. (L.) amazonensis42 com o emprego de 13 enzimas. Houve uma correlação completa para L. (V.) sp e L. (V.) braziliensis e para L. (L.) sp e L. (L. ) amazonensis, caracterizadas por PCR/ hibridização e a eletroforese de isoenzimas, respectivamente. O maior percentual de amostras caracterizadas por isoenzimas como L. (L.) amazonensis provavelmente reflete a maior facilidade de isolamento e crescimento em cultura de L. (L.) amazonensis do que L. (V.) braziliensis, levando à sua maior representação no estudo por isoenzimas.43Houve o predomínio de infecções por L. (V.) sp., identificado na LC, na LM e em recidivas. A disseminação metastática com lesão mucosa e a cronicidade são considerados mais freqüentes na infecção por L. (V.) braziliensis.44,45 Nossos resultados sugerem que a L. (V.) braziliensis é a principal espécie em Minas Gerais, como já descrito nos Estados de São Paulo,46 Rio de Janeiro,12 Espírito Santo47 e Bahia.27 A L. (V.) sp já foi identificada em animais domésticos (dois cães e uma gata) da RMBH.48 Apesar do amplo espectro de manifestações clínicas já descritas de infecções por L. (L.) amazonensis,49 nossa pequena amostra (n = 4) dificulta uma análise crítica. Tratamento dos pacientes
A boa eficácia terapêutica observada já foi relatada com as doses utilizadas neste estudo50 ou com a dose de 5 mg Sb5+/Kg/dia.13 Esta eficácia pode estar relacionada à características do parasito13 e/ou ao pouco tempo de evolução (< 6 m) das lesões na maioria (75%) dos pacientes. Evidências de disseminação linfática dos parasitos antes do aparecimento da lesão primária51 reforçam a necessidade do tratamento precoce. Apesar da baixa escolaridade e renda da população atendida, o pequeno percentual de abandono de tratamento (3%) observado neste estudo, quando comparados aos 20-45% já relatados,28,50 pode ser devido aos esclarecimentos prestados e/ou à concessão da droga e seringas suficientes para 10 dias.O tratamento antimonial por 20 dias seguidos tem sido recomendado por ser mais eficaz e poder contribuir para a diminuição das recidivas.52 Quando comparado ao tratamento em ciclos de dez dias, revelou diferenças significativas com relação à freqüência de abandono (18.6% x 3.0%), à necessidade de tratamento adicional (21.0% x 9.0%) e à incidência de efeitos colaterais (21.0% x 15.2%) respectivamente.53 Os efeitos colaterais observados neste estudo coincidem com os já descritos.32 Sua menor incidência em crianças reflete provavelmente uma relação dose-efeito.54 Embora antimoniais em doses elevadas possam levar a arritmias e à morte súbita,55 o antimonial, nas doses utilizadas, foi seguro.56A recidiva da LTA após tratamento
O estudo prospectivo, apesar das dificuldades encontradas para sua realização, é o desenho mais adequado para conhecer a história natural das doenças e dos fatores de risco a ela correlacionados. Neste estudo, foram necessários o atendimento de mais de 2 000 pacientes com outras afecções e vários anos de acompanhamento para que um número razoável de casos e eventos ( LM e recidiva) ocorresse. O percentual da ocorrência de recidivas (10.5%) foi semelhante ao encontrado em outra área de LTA por L. (V.) braziliensis.57 A ocorrência de mais de 90% das recidivas em até um ano reforça a recomendação de controle clínico da LTA por pelo menos um ano após tratamento.11,58A recidiva da LTA pode ser devida a uma infecção persistente ou à reinfecção.59 Só foi considerada como recidiva a lesão que ocorresse na cicatriz da lesão anterior ou então primariamente na mucosa, o que reforça a hipótese de reativação de infecção nos nossos casos. A reativação da infecção implica na falha do tratamento ou então, na hipótese de que, pelo menos na leishmaniose por L. (V.) braziliensis, a cura clínica é alcançada sem a eliminação total dos parasitos.60 O número de pacientes com tratamento com dose ou tempo insuficiente foi pequeno (3% - 12/383) e não esteve relacionado às recidivas. Entretanto, o esquema de tratamento utilizado, com ciclos de dez dias intercalados por 10 dias sem medicação pode ter contribuído para a ocorrência de recidiva. O tratamento contínuo dos pacientes já foi recomendado.52O risco de recidiva para os casos de LC e LM estudados foi igual. Dado o maior tempo de doença e à disseminação do parasita na LM, seria esperado um maior percentual de recidiva nestes casos. A maior dose de antimonial e o maior tempo de tratamento dos pacientes com LM devem ter influenciado a menor ocorrência de recidivas. Nossos resultados reforçam a recomendação da OMS para utilização da dose de 20 mg Sb5+/Kg/dia para todos os casos de LC causados por L. (V.) braziliensis.11 Nenhum aspecto clínico ou epidemiológico esteve associado à ocorrência de recidivas. A presença de anticorpos anti-Leishmania após tratamento poderia significar persistência do parasitismo e ser fator preditivo para a recidiva da LTA.29,61 O relato da diminuição dos títulos da RIFI durante e após tratamento sugeria a utilização da reação como controle de cura.35,36 Neste estudo, a resposta de anticorpos medida pela RIFI não esteve associada ao risco de recidiva. A diminuição significativa dos títulos da RIFI após tratamento é provavelmente devida à menor estimulação antigênica parasitária. Porém, nem a sorologia qualitativa nem a quantitativa estiveram associadas à incidência da recidiva após tratamento, concordando com a hipótese que a resposta humoral tenha pouca ou nenhuma participação na proteção do hospedeiro.34A IDRM negativa foi o único fator que se mostrou prognóstico para a incidência de recidivas até dois anos após o tratamento.62 A resposta imune celular é importante para a recuperação do paciente e para a resistência à re-infecção em todas as formas de leishmanioses. A IDRM, teste de hipersensibilidade cutânea tardia que foi a primeira forma de avaliação da imunidade na LTA ,se correlaciona com a proteção e é útil na avaliação prognóstica.34 Os pacientes com LC difusa apresentam IDRM geralmente negativa, sendo que esta se torna positiva apenas nos raros períodos de melhora da doença.34 Nossos dados indicam que também nas modalidades cutânea e mucosa da LTA, a positividade do teste cutâneo, aferida quando do diagnóstico, indica proteção do indivíduo, que apresenta menor incidência de recidiva das lesões. Os pacientes com diagnóstico confirmado de LTA e teste cutâneo negativo devem ser informados do maior risco de recidiva das lesões e acompanhados com maior cuidado por pelo menos um ano após tratamento.CONCLUSÃO

Os aspectos clínicos e laboratoriais dos pacientes com LTA atendidos na RMBH são muito semelhantes aos já descritos em outras áreas endêmicas. A RMBH era considerada indene para LTA há apenas 10 anos e dificuldades para o diagnóstico da LM podem estar relacionadas ao maior tempo de duração da LM que a LC e à sua maior prevalência quando comparada à prevalências detectadas em áreas endêmicas mais antigas. Seria importante incrementar os treinamentos de profissionais de saúde da RMBH iniciados durante a condução desta pesquisa, visando aumentar a detecção precoce dos casos. Foi observada boa sensibilidade dos métodos indiretos (IDRM e RIFI) de diagnóstico da LTA. A execução mais simples destes exames facilitaria ações de descentralização do diagnóstico, que poderiam refletir em menor tempo de doença e menor incidência de complicações. A pesquisa direta do parasito, apesar de ser o exame parasitológico comprobatório, foi menos sensível e é de realização mais difícil nas áreas de transmissão. Os resultados promissores da utilização da reação de ELISA com um antígeno recombinante específico para T.cruzi em soros de pacientes com LTA podem contribuir para a diferenciação sorológica destas duas tripanosomíases.Este estudo também acrescentou novas perspectivas para a compreensão da LTA na nossa região. Ao aliarmos duas técnicas de caracterização de Leishmania, observamos que a L. (V.) braziliensis foi a principal espécie detectada na população estudada e é provavelmente a principal espécie relacionada à infecção humana no estado de Minas Gerais.O tratamento com antimonial apresentou alta eficácia primária, desde que implementado até a cicatrização completa da lesão e não limitado ao período máximo de 20 dias para LC e 30 dias para LM. A recidiva após tratamento da LTA ocorreu principalmente nos casos de LC, sugerindo que o tratamento dos mesmos com dose de antimônio igual à preconizada para a LM poderia diminuir o risco de recidiva. O controle após tratamento por pelo menos um ano é fundamental para a detecção das recidivas da LTA, já que 90% dos casos ocorreram neste período.Este é o primeiro estudo prospectivo desenhado para investigar fatores preditores para a ocorrência de recidivas após tratamento. Nenhum aspecto clínico nem a resposta de anticorpos à RIFI realizada antes e após o tratamento foi prognóstico para a ocorrência de recidiva após tratamento. A utilização da IDRM como ferramenta de controle de cura após tratamento pode ter grande importância em termos de saúde pública, já que esta reação é simples, barata e já utilizada de rotina no diagnóstico da LTA. Seria fundamental que pesquisas futuras investigassem esta associação em outras áreas endêmicas e que também testassem a necessidade da introdução de modificações no tratamento e acompanhamento dos pacientes com IDRM negativa. RECONHECIMENTOAgradecemos ao Dr. Aluízio Prata, editor da Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, por ceder gentilmente os direitos para tornar possível esta republicação.BIBLIOGRAFIA</sup>

1. PESSOA, S.B. & BARRETO, M.P. Epidemiologia. In: PESSOA, S.B. & BARRETO, M.P, Leishmaniose Tegumentar Americana. s.ed., , 1948a, cap.11, p.361-419.
2. PASSOS, V.M.A. et al. Epidemiological aects of American Cutaneous Leishmaniasis in a periurban area of the Metropolitan Region of Belo Horizonte, Minas Gerais, Brazil. Mem. Inst. Oswaldo Cruz, 88: 103-110, 1993.
3. HERMETO, M.V. et al. Outbreak of cutaneous leishmaniasis in the Rio Doce Valley, Minas Gerais, Brazil. Mem. Inst. Oswaldo Cruz, 89 (4): 519-521, 1994.
4. MAGALHÃES-ROCHA, N.M. et al. Isoenzymatic characterization of Leishmania isolated from human hosts in the Rio Doce Valley-MG. Mem. Inst. Oswaldo Cruz, 82(supl.): 96, 1987.
5. MAGALHÃES-ROCHA, N.M. et al Isoenzymatic characterization of Leishmania isolated from six rodents captured in the Rio Doce Valley, Minas Gerais. Mem. Inst. Oswaldo Cruz , 82(supl.): 96, 1987.
6. WEIGLE, K.A. et al. Diagnosis of cutaneous and mucocutaneous leishmaniasis in Colombia; a comparison of seven methods. Am. J. Trop. Med. Hyg., 36: 489-496, 1987.
7. DEGRAVE, W. et al. Use of molecular probes and PCR for detection and typing of Leishmania- a mini-review. Mem. Inst. Oswaldo Cruz , 89 (3): 463-469, 1994.
8. ARNHEIM, N., ERLICH, H. Polymerase chain reaction strategy. Annual Review of Biochemistry, 61:131-156, 1992
9. FURTADO, T.A. Critérios para o diagnóstico da leishmaniose tegumentar americana. Anais Brasileiros de Dermatologia, 55(2): 81-86, 1980.
10. MALDONADO, R.A. et al. Homologues of the 24-Kda flagellar Ca(2+)-binding protein gene of Trypanosoma cruzi are present in other members of the Trypanosomatidae family. Exp. Parasitol., 86(3): .200-205, 1997.
11. WORLD HEALTH ORGANIZATION. Expert Committee on the Control of the Leishmaniases. Genebra:WHO, 1990 (Relatório Técnico da OMS, Série 793)
12. OLIVEIRA, M.R.F. et al. Estudo evolutivo da leishmaniose mucosa (7 a 17anos) causada por Leishmania (Viannia) braziliensis em Três Braços, Bahia. Rev. Soc. Bras. Med. Trop., 28(4): 325-332, 1995.
13. OLIVEIRA-NETO, M.P. et al. High and low doses of antimony in American Cutaneous Leishmaniasis. A five-year follow-up study of 15 patients. Mem. Inst. Oswaldo Cruz ,91: 207-209, 1996.
14. FURTADO, T.A. Leishmaniose Tegumentar Americana. In: MACHADO-PINTO, J. Doenças infecciosas com manifestações dermatológicas. Editora Médica e Científica Ltda, , p.319-328, 1994.
15. MELO, M.N. et al. Padronização do antígeno de Montenegro. Rev. Inst. de Med. Trop. São Paulo, 6 (4): 171-76, 1977.
16. MARZOCHI, M.C.A. et al. Reação de imunofluorescência indireta e intradermoreação para leishmaniose tegumentar americana em moradores na área de Jacarepaguá (). Estudo comparativo dos resultados obtidos em 1974 e 1978. Rev. Inst. Med. Trop. São Paulo , 22: 149-155, 1980.
17. KRAUTZ, G.M. et al. Use of a 24-kilodalton Trypanosoma cruzi recombinant protein to monitor cure of human Chagas' disease. J. Clin. Microbiol., 33 (8): 2086-2090, 1995.
18. GONTIJO, B. A reação em cadeia da polimerase (PCR) no diagnóstico da leishmaniose tegumentar americana. Faculdade de Medicina, Universidade Federal de Minas Gerais, 1997. 91 p. (Tese de doutourado).
19. BRASIL, MINISTÉRIO DA SAÚDE (MS), FNS, CENEPI & COORDENAÇÃO NACIONAL DE DERMATOLOGIA SANITÁRIA. Guia de controle da Leishmaniose Tegumentar Americana, Brasília, 1994.
20. STATISTICS AND EPIDEMIOLOGY RESEARCH TO EGRET: upgrade document: changes from previous versions, US, 1990.
21. FORATTINI, O.P. et al. Leishmaniose tegumentar no território do Amapá, Brasil. Rev. Inst. Med. Trop. São Paulo, 1(1): 11-17, 1959.
22. OLIVEIRA-NETO, M.P. et al. An outbreak of american cutaneous leishmaniasis (Leishmania braziliensis braziliensis) in an periurban area of city, Brazil: clinical and epidemiological studies. Mem. Inst. Oswaldo Cruz, 83(4) 427-435, out/dez 1988.
23. MARZOCHI, M.C.A., MARZOCHI, K.B.F. Tegumentary and Visceral Leishmaniasis in Brazil- emerging Anthropozoonosis and possibilities for their control. Cad. Saúde Púb., 10 (supl.2): 359-375, 1994.
24. SABROZA, P. O domicílio como fator de risco na leishmaniose tegumentar americana Estudo epidemiológico e m Jacarepaquá, município do . EN, Fundação Oswaldo Cruz, 1981, 186 p. (dissertação de mestrado)
25. PASSOS, V.M.A., FALCÃO, A.L., KATZ, N. Urban American Cutaneous Leishmaniasis in the Metropolitan Region of Belo Horizonte, Minas Gerais State, Brazil. Mem. Inst. Oswaldo Cruz ,85: 243-244, 1990.
26. MAGALHÃES, A.V. et al. Histopatologia da leishmaniose tegumentar por Leishmania braziliensis braziliensis. Padrões histológicos e estudo evolutivo das lesões. Rev. Inst. Med. Trop. São Paulo, 28 (4) :.253-262, 1986.
27. MARSDEN PD. Mucosal leishmaniasis due to Leishmania (Viannia) braziliensis in Três Braços, Bahia-Brazil. Rev. Soc. Bras. Med. Trop., 27 (2): 93-101, 1994.
28. LUCCIOLA, G.V., PASSOS, V.M.A., PATRUS, O.A. Mudança no padrão epidemiológico da leishmaniose tegumentar americana. Anais Brasileiros de Dermatologia, 71(2): :99-105, 1996.
29. SARAVIA, N.G. et al. The relationship of Leishmania braziliensis subespecies and immune response to disease expression in New World Leishmaniasis. The J. Infect. Dis., 159 (4): 725-735, 1989.
30. BARRAL-NETO, M., BADARÓ, R., BARRAL, A., CARVALHO, E.M. Imunologia da leishmaniose tegumentar. Rev. Soc. Bras. Med. Trop., 19 (3): 173-191, 1986.
31. OLIVEIRA-NETO, M.P. et al.. A low dose antimony treatment in 159 patients with American Cutaneous Leishmaniasis: extensive follow-up studies (up to 10 years). Am. J. Trop. Med. Hyg., 57(6): 651-655, 1997.
32. WANKE, C.F.N. et al. Leishmaniose tegumentar: estudo retrospectivo de 65 casos. Anais Brasileiros de Dermatologia, 66(2): 49-54, 1991.
33. CUBA-CUBA, C. et al. Human mucocutaneous leishmaniasis in Três Braços, Bahia-Brazil. An area of Leishmania braziliensis barziliensis transmission. I. Laboratory diagnosis. Rev. Soc. Bras. Med. Trop, 7(4): 161-167, 1984.
34. BARRAL, A. Imuno-regulação na leishmaniose tegumentar. Rev. Soc. Bras. Med. Trop., 27 (supl.4): 346-348, 1994.
35. CHIARI, C.A., MAYRINK, W., MAGALHÃES, P.A. Reação de imunofluorescência indireta no controle do tratamento da leishmaniose tegumentar americana. Rev. Inst. Med. Trop. São Paulo, 15: 298-303, 1973.
36. MENDONÇA, S.C.F. et al. Indirect immunofluorescence test in new world leishmaniasis: serological and clinical relationship. Mem. Inst. Oswaldo Cruz, 83 (3): 347-55, 1988.
37. LUQUETTI, A.Q. Use of Trypanosoma cruzi defined proteins for diagnosis- multicentre trial, serological and technical aspects. Mem. Inst. Oswaldo Cruz , 85 (4):.497-505, 1990.
38. GONTIJO E.D. et al. Infecção por Trypanosoma cruzi em doadores de sangue. Rev. Soc. Bras. Med. Trop., 27 (supl2.): p.119-120, 1994
39. CHIARAMONTE, M.G. et al. Trypanosoma cruzi and Leishmania p. human mixed infection. Am. J. Trop. Med. Hyg., 54 (3): 271-273, 1996.
40. PASSOS VMA et al. Differential Serodiagnosis of Human Infections Caused by Trypanosoma cruzi and Leishmania spp. Using ELISA with a Recombinant Antigen (rTc24). Mem. Inst. Oswaldo Cruz 92 (6):791-793, dec. 1997.
41. RODRIGUEZ, N. et al. Diagnosis of Cutaneous Leishmaniasis and species Discrimination of Parasites by PCR and Hybridization. J. Clin. Microbiol., v.32, n. 9, p. 2246-2252, 1994.
42. GONTIJO, C.M.F. et al. Isoenzime characterization of Leishmania isolates from Minas Gerais State, Brazil. Mem. Inst. Oswaldo Cruz , 90(suppl.): 143, 1995. (Resumo).
43. PASSOS, V.M.A. et al. Leishmania (Viannia) braziliensis is the predominant species infecting patients with American Cutaneous leishmaniasis in the State of Minas Gerais, Southeast Brazil. Acta Trop. 72: 251-8, 1999.
44. SANTRICH, C. et al. Mucosal disease caused by Leishmania braziliensis guyanensis. Am. J. Trop. Med. Hyg.,42 (1):.51-55, 1990.
45. SARAVIA, N.G. et al.. Mucocutaneous leishmaniasis in Colombia: Leishmania braziliensis subecies diversity. Am. J. Trop. Med. Hyg., 34(4): 714-720, 1985.
46. TOLEZANO, J.E. Ecoepidemiological aspects of ACL in the State of São Paulo, Brazil. Mem. Inst. Oswaldo Cruz, 89 (3): 427-434, 1994.
47. BARROS, G.C. et al. Foco de Leishmaniose Tegumentar Americana nos municípios de Viana e Cariacica, estado do Espírito Santo, Brasil. Rev. Saúde Pública, , 19: 146-53, 1985.
48. PASSOS, V.M.A. et al. Natural infection of a domestic cat (Felis domesticus) with Leishmania (Viannia) in the Metropolitan Region of Belo Horizonte, State of Minas Gerais, Brazil. Mem. Inst. Oswaldo Cruz, 91(1): 19-20, 1996.
49. BARRAL, A. et al.. Leishmaniasis in Bahia, Brazil: evidence that Leishmania amazonensis produces a wide espectrum of clinical disease. Am. J. Trop. Med. Hyg., 44:.536-546, 1991.
50. LLANOS-CUENTAS, E.A. et al. Human mucocutaneous leishmaniasis in Três Braços, Bahia-Brazil. An area of Leishmania braziliensis braziliensis transmission. II. Cutaneous Disease. Presentation and evolution. Rev. Soc. Bras. Med. Trop, 17:169-177, 1984.
51. BARRAL, A. et al. Lymphadenopathy as the first sign of human cutaneous infection by Leishmania braziliensis. Am. J. Trop. Med. Hyg., 53 (3): 256-259, 1995b.
52. MARSDEN, P.D. Novos conceitos sobre os antimoniais pentavalentes no tratamento da leishmaniose. Rev. Soc. Bras. Med. Trop., 16: 172-174, 1983.
53. AZEREDO-COUTINHO, R.B., MENDONÇA, S.C.F. Comparative study of two antimonial therapy schedules for treating cutaneous leishmaniasis. Mem. Inst. Oswaldo Cruz 92(supl.I):223, 1997 (Resumo).
54. BERHE, N. ALI, A., HAILU, A., YENENEH, H. Relapse in Ethiopian visceral leishmaniasis (VL) patients after therapy with pentavalent antimonials: a ten year observation. Acta Tropica, 57:.83-90, 1994.
55. SAMPAIO, R.N.R. et al. Leishmaniose tegumentar americana-casuística do hospital escola da UnB. Anais Brasileiros de Dermatologia, 55(2): 69-76, 1980.
56. RIBEIRO, A L.P. et al. Electrocardiographic changes during low-dose, short-term therapy of cutaneous leishmaniasis with the pentavalent antimonial meglumine. Braz. J. Med. Biol. Res., 32;297-301, 1999.
57. NETTO, E.M. et al. Long-term follow-up of patients with Leishmania (Viannia) braziliensis infection and treated with Glucantime®. Trans. Royal Soc. Trop. Med. Hyg., 84: 367-370, 1990.
58. MAYRINK, W. et al. Epidemiology of dermal leishmaniasis in Rio Doce Valley, State of Minas Gerais, Brazil. Ann. Trop. Med. Parasitol., 73(2): 123-37, 1979.
59. SARAVIA et al. Recurrent lesions in human Leishmania braziliensis infection- reactivation or reinfection The Lancet, 336: 398-402, 1990.
60. GUEVARA, P. et al. Leishmania braziliensis in blood 30 years after cure. The Lancet, 341: 1341, 1993.
61. WYLER D.J. Immunology of Leishmaniasis. In: Modern parasite biology: cellular, immunological and molecular aspects, W.H. Freeman and Company, 1990, p.200-221.
62. PASSOS VMA et al. American Cutaneous Leishmaniasis: use of a skin test as a pedictor of relapse after tretament. Bull WHO, 2000,78(8):968-974.