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RESUMEN

Objetivos. Proponemos que, en la rata, la síntesis anaeróbica de ATP mediada por la creatina cinasa (CK) es sexualmente dimórfica durante la maduración y el envejecimiento del corazón. Antecedentes. En función de género, las diferencias morfológicas y funcionales durante el envejecimiento cardiovascular parecen explicar la mayor longevidad de las hembras de los mamíferos y de la mujer. Materiales y métodos. Se estudiaron ratas Wistar de ambos sexos, de peso corporal semejante de 200, 250 y 300 g. Resultados. Hubo diferencias en la actividad específica de la CK solamente a los 257 ± 6 g de peso corporal, debido a su decremento en el macho. La hembra mostró mayor número y variedad de isoenzimas de la CK citosólica en todos los pesos corporales estudiados. Contrariamente a la aceptada especificidad tisular de la CK cardíaca, en ambos sexos se encontraron isoformas catalíticas del tipo cerebral durante todo el estudio. Conclusiones. Se encontraron diferencias significativas de género en los patrones y en el número de isoformas catalíticas de la CK citosólica del corazón de rata. En relación con los mecanismos anaeróbicos de producción de ATP, estas diferencias podrían explicar, en parte, la susceptibilidad diferencial sexual al compromiso hemodinámico en favor de las hembras. Palabras clave: creatina cinasa, isoenzimas, corazón, dimorfismo sexual, fosfocreatina. Lista alfabética de las abreviaturas: AMP, adenosina 5´-monofosfato; BB-CK, CK tipo cerebral; Cr, creatina; CK, creatina cinasa; MB-CK, CK tipo cardíaco; MM-CK, CK tipo muscular; PCr fosfocreatina. ABSTRACT

Objectives. We hypothesized that the anaerobic ATP synthesis mediated by the creatine kinase (CK) is sexually dimorphic during maturation and aging of the rat heart. Background. Gender-related morphological and functional differences in cardiovascular aging seem to explain the greater longevity of mammalian females, including women. Material and methods. Male and female Wistar rats of similar body weight divided in groups of 200, 250 and 300 g were studied. Results. Differences of heart CK specific activity were found only at 257± 6 g of body weight due to a decrease of the male enzyme activity. Female showed more variants and number of cytosolic CK isoenzymes at any studied weight. Contrary to the accepted view of CK cardiac tissue specificity, catalytical brain type isoforms were found along the study. Conclusions. Significant gender differences were found in the patterns and number of cardiac catalytical cytosolic CK isoforms. Regarding the alternate anaerobic mechanism of ATP production, these differences may explain in part the sex differential susceptibility to hemodynamic compromise in response to cardiovascular stress, in favor of females. INTRODUCCION

Es bien sabido que los varones tienen mayor incidencia de mortalidad que las mujeres. La mayor parte del exceso de mortalidad masculina es la enfermedad cardiovscular (EVC o CVD). Aunque se ha propuesto una gran cantidad de hipótesis, las causas del exceso en ECV en los varones son aún inciertas.¹ Un factor importante que ha impedido puntualizar las causas de la disparidad es la falta de claridad acerca de si el exceso de mortalidad masculina por ECV ha existido siempre a través de la historia. Los autores citados1 se han abocado a investigar las diferencias en mortalidad entre los sexos, desde la época más temprana en que hubo datos asequibles hasta la actualidad, incluyendo el margen de grupos por edad desde los 15 hasta mayores de 85 años.Se usaron estadísticas de mortalidad por ECV en Inglaterra y Gales desde 1861 hasta 1992 y en los Estados Unidos desde 1900 hasta 1991.Se encontraron tres períodos en la relación de mortalidad por ECV entre los sexos: (1) uno temprano donde el cociente de mortalidad es igual para cada sexo; (2) un período de aparición de las diferencias sexuales en mortalidad y (3) un período con presencia consistente del exceso de mortalidad masculina.Se concluyó que el exceso de la mortalidad por ECV no siempre ha estado presente en los registros históricos (sólo hasta la década de 1920 en los países antes citados). Sin embargo, se requiere mayor investigación para dilucidar las causas de este exceso de mortalidad masculina (aunque este estudio parece apuntar hacia efectos epigenéticos, más que a una inherente predisposición orgánica masculina a los factores de riesgo, tales como el colesterol sérico, las presiones sistólicas y distólicas, la hipertrofia ventricular izquierda, la intolerancia a la glucosa y el tabaquismo). Ni las hipótesis unifactoriales ni las multivariadas parecen adecuadas para explicar el exceso de mortalidad por ECV en los varones.¹Por otra parte, se han venido acumulando evidencias orgánicas, tanto anatómicas como fisiológicas y bioquímicas, relacionadas con la diferenciación sexual neural,² así como la muscular esquelética y la cardíaca,³ a lo largo de la filogenia, que apoyan sólidamente la posición que favorece al dimorfismo sexual en las especies. En lo que se refiere a estudios comparados realizados en otras especies de mamíferos, en la rata se han encontrado evidencias de dimorfismo sexual relativas a la estructura y a la función cardiovascular.^4-8 En lo que respecta al ser humano, se han encontrado diferencias sexuales en la adaptación del corazón a la hipertensión sistólica aislada;⁹ en las adaptaciones cardiovasculares al entrenamiento durante el ejercicio prolongado entre hombres y mujeres senectos;¹⁰ a la respuesta cardíaca normal ante el ejercicio en posición vertical,¹¹ y en cuanto a la evaluación y el desenlace de la angina inestable.¹²Anteriormente se han estudiado las diferencias en el desempeño cardiovascular en relación con la edad,^3,6,13-16 pero se han investigado sólo parcialmente los cambios cardiovasculares en relación con el género. En otros estudios se han investigado las diferencias sexuales en la morfología^9,17 y en la función^5-7,10,11 cardiovascular en adultos jóvenes. Las diferencias relacionadas con el género durante el envejecimiento cardiovascular pueden ayudar a explicar parcialmente la mayor longevidad de las mujeres y de las hembras de la mayoría de las especies de mamíferos,⁸ lo que parece ser importante.El ATP es la molécula energética universal de intercambio para los procesos metabólicos que requieren energía. Las células y los tejidos excitables como las células neurales y los electrocitos, así como los músculos cardíaco y esquelético, dependen de la disponibilidad inmediata de vastas cantidades de energía que pueden ser usadas de manera fluctuante o en forma de pulso. En el corazón, este proceso empieza desde el primer latido cardíaco embrionario y termina en el final de la vida. El incrementar simplemente la concentración intracelular de ATP como almacén energético podría representar una mala elección para cubrir los requerimientos energéticos de los diferentes tipos de células y tejidos antes mencionados, ya que las concentraciones locales de ATP, ADP y AMP, tanto como el cociente ATP/ADP, son reguladores clave que influyen en procesos metabólicos fundamentales.¹⁸ Sin embargo, las células excitables contienen sólo concentraciones de 2 a 5 mM de ATP, que serían suficientes para una contracción muscular de solamente unos pocos segundos. En cambio, grandes cantidades de fosfágenos son acumulados en estas células y tejidos.¹⁹ La fosfocreatina (PCr) es el único fosfágeno en vertebrados y en algunas especies de invertebrados. En el músculo esquelético las concentraciones de PCr alcanzan 30 mM o más,²⁰ mientras que en el cerebro o en el órgano eléctrico y en el músculo liso, la PCr se encuentra en concentraciones de 5 a 10 mM. Aunque las pozas celulares de ATP son pequeñas, no se detectan cambios significativos en los niveles totales de ATP durante la activación de las células excitables, porque el ATP es reabastecido eficientemente a partir de las grandes pozas de PCr,²¹ por medio de la creatina cinasa (CK), abundante solamente en tejidos neuromusculares.²²En la mayoría de los músculos, la capacidad regenerativa de ATP por la CK es muy alta y excede considerablemente tanto a su utilización como a su reabastecimiento por la glicólisis y por la fosforilación oxidativa.²³ Por ejemplo, la velocidad máxima de síntesis de ATP por la reacción(INSERTAR ECUACION.GIF)catalizada por la CK en el músculo cardíaco de rata (30 mol/s/g), es mucho mayor que la velocidad máxima de síntesis de ATP por medio de la fosforilación oxidativa (2.5 mol/s/g).^24,25 Además de la regeneración del ATP hidrolizado, el sistema CK/PCr, con CK como un sensor de bajo umbral de ADP (la Km de la CK de músculo esquelético para ADP es de 10^-5 M),²⁶ juega un papel crítico para prevenir una elevación de la concentración de ADP durante períodos de transición en los cuales la utilización excede a la producción de energía. Al mantener alto el cociente ATP/ADP en la vecindad de una ATPasa, la CK incrementa la eficiencia termodinámica de la hidrólisis de ATP.²⁷Las isoenzimas diméricas de la CK citosólica son supuestamente específicas de tejido: MM-CK para músculo esquelético, MB-CK para células miocárdicas y BB-CK para tejido nervioso.²⁸ Las isoenzimas de la CK están concentradas parcialmente y localizadas específicamente en sitios de consumo y producción de energía. En células cardíacas dependientes del metabolismo oxidativo, si la fosforilación oxidativa es inhibida, la energía derivada de la glicólisis puede contribuir discretamente al mantenimiento de niveles de fosfato de alta energía y contractilidad. Sin embargo, el flujo glicolítico y el acoplamiento funcional de la CK observados a bajos cocientes de PCr/Cr se suprimen cuando la respiración es normal y entonces se eleva este cociente. La CK en el corazón, como un sensor de bajo umbral de ADP, también ejerce control sobre el flujo glicolítico.²⁹En este trabajo hipotetizamos que los mecanismos de transfosforilación mediados por el sistema CK/PCr son sexualmente dimórficos durante la maduración fisiológica y el envejecimiento del corazón de la rata. Se esperaba encontrar patrones de transición diferenciales de las isoformas citosólicas catalíticamente activas de la CK, dependientes de peso y de sexo durante el período estudiado, en contra de la idea aceptada acerca de la especificidad tisular de la CK citosólica «madura». Previamente, pero no en función del sexo³⁰ y recientemente en función de sexo, se ha demostrado la completa transición isoenzimática fisiológica cerebral de la CK en la rata Wistar, también en contra de la comúnmente aceptada especificidad tisular de la CK cerebral.³¹ MATERIALES Y METODOS

Los cambios en la concentración sérica de las hormonas tiroideas (T₄, T₃ y T₃ reversa) y en los niveles de hemoglobina y de hematocrito no se relacionan con la edad cronológica, sino que son interpretados más adecuadamente en función de la altura, el peso y la superficie corporal en adolescentes humanos de ambos sexos. Dichos cambios pueden representar cambios adaptativos encaminados hacia la producción y la conservación de energía.^32,33 El sistema CK/PCr está directamente involucrado en ambos procesos. Con base en la mencionada premisa, para comparar parámetros ponderales y bioquímicos por medio de los análisis de la actividad específica de la CK del corazón y de sus isoenzimas citosólicas, se estudiaron 46 ratas Wistar de ambos sexos con pesos semejantes entre 200 y 300 g. Para prevenir problemas de ritmo circadiano, los animales fueron decapitados sistemáticamente entre las 8:30 y las 9:00 a.m. El corazón fue homogeneizado en presencia de KCl 0.1 M a 4 C y por centrifugación diferencial se obtuvo una fracción sobrenadante libre de mitocondrias pesadas y ligeras (SN₁). De este sobrenadante se utilizaron partes alícuotas para el ensayo espectrofotométrico de la CK mediante 3 reacciones enzimáticas acopladas y para la determinación de proteínas, por un método convencional.³⁰ El SN₁ fue ultracentrifugado por 60 min a 125 000 X g y del sobrenadante de alta velocidad (SN₂), se tomaron inmediatamente34 Después de la electroforesis, la presencia de las bandas separadas fue revelada por medio de tinción catalítica para la CK, utilizando geles de reacción que contienen hexocinasa y glucosa-6-fosfato deshidrogenasa como enzimas acoplantes en la reacción de producción de ATP de la CK, a pH 7.2.³⁰ RESULTADOS

No se observaron diferencias sexuales en cuanto al peso del corazón y a su contenido de proteínas del sobrenadante post 27 000 X g (SN₁), en ninguno de los pesos corporales estudiados. Los cocientes peso cardíaco/peso corporal no mostraron diferencias significativas de género durante todo el estudio. Se encontraron diferencias en la actividad específica de la CK cardíaca solamente a los 257 ± 6 g de peso corporal, debido al decremento de tal actividad en el macho. A lo largo del estudio aparecieron todas las variedades neuromusculares de la CK citosólica, en ambos sexos. Sin embargo, el corazón de la hembra mostró una mayor variedad de isoenzimas típicas y atípicas de la CK, en todos los pesos corporales estudiados. En los corazones de rata de ambos sexos se encontraron consistentemente isoenzimas del tipo cerebral BB-CK intensamente teñidas catalíticamente a lo largo del estudio. Este hallazgo no está de acuerdo con la aceptada especificidad tisular de la CK cardíaca. CONCLUSIONES

• En relación con la actividad específica de la CK, es de notarse que a los 257 g de peso corporal se encontró en el corazón de la rata hembra una actividad específica de más del doble de la encontrada en el corazón del macho. Se considera que esto podría deberse a una sobrecarga cardíaca, ya que se ha observado concomitancia en el aumento de la masa ventricular y de la actividad de la CK en ratas con hipertensión espontánea y con hipertensión inducida artificialmente por la constricción de la aorta. En este trabajo, sin embargo, la masa cardíaca de las hembras de 257 g de peso permaneció dentro de sus valores normales. Por el contrario, en el macho del mismo peso e igual contenido de proteínas del SN₁, hubo un decremento del 43% de la actividad específica de la CK, en comparación con el valor mostrado a los 200 g de peso. Por lo tanto, debe enfatizarse que un incremento en la actividad específica de la CK cardíaca no necesariamente implica una hipertrofia ventricular patológica concomitante.³⁵ La consideración opuesta también es válida. Una disminución en la actividad específica de la CK en el corazón de rata no está siempre relacionada directamente con insuficiencia cardíaca, a pesar de la hipótesis de que la disminución en la velocidad de síntesis de ATP, mediada por el sistema CK/PCr, es un mecanismo importante en el que se basa la insuficienda cardíaca.²⁵.
• Como hipótesis de trabajo, se esperaba encontrar patrones diferenciales de transición de las isoformas citosólicas de la CK, catalíticamente activas, dependientes de peso y de sexo durante el período estudiado, contrariamente a la idea de la «especificidad tisular» de la CK citosólica. En este trabajo comprobamos que fue correcta la hipótesis, ya que se encontraron diferencias significativas de género, principalmente en cuanto a los patrones y al número de isoformas catalíticas de la CK citosólica del corazón, que siempre fue mayor en el caso de las hembras a lo largo del estudio. En relación con los mecanismos anaeróbicos alternos para la producción de ATP, estas diferencias podrían explicar en parte, la susceptibilidad diferencial sexual al compromiso hemodinámico en respuesta al estrés cardiovascular, en favor de las hembras. Las diversas isoenzimas neuromusculares de la CK encontradas en el corazón, pueden sintetizar ATP más o menos activamente, dependiendo de sus respectivas Km_s para PC y ADP y las hembras tuvieron mayor diversidad isoenzimática de la CK citosólica a lo largo del estudio.
• Para comparar isoformas proteínicas de animales jóvenes, adultos y senectos con un grado razonable de confianza, fue necesario revisar la literatura en relación con la detección inmunológica de isoenzimas en animales viejos, en contraste con los procedimientos catalíticos. Se ha postulado que la frecuencia de errores en la síntesis de proteínas se incrementa al envejecer, al grado que las moléculas proteicas resultan menos activas, o aún, inactivas. Esto ha sido confirmado específicamente con la aldolasa, una de las enzimas glicolíticas. Aunque la cantidad total de aldolasa detectada inmunológicamene permaneció sin cambio en los músculos de animales senectos, la aldolasa aislada sólo tuvo un tercio de la actividad catalítica de la aldolasa aislada de animales jóvenes.³⁶.Otras dos enzimas glicolíticas, la gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa y la piruvato cinasa, también han presentado isoformas catalíticamente inactivas durante el envejecimiento.^37,38 En el caso de la CK específicamente, ha sido demostrado que grandes cantidades de isoformas cerebrales detectadas antigénicamente son catalíticamente inactivas. Estas pueden separarse de las especies catalíticas de la CK por medio de cromatografía en DEAE-celulosa.³⁹ Los datos de las isoenzimas citosólicas de la CK del corazón de rata del presente trabajo representan isoformas catalíticamente activas que pueden participar fisiológicamente en el sistema CK/PCr a lo largo del estudio. Las afinidades diferenciales para ADP y PCr de MM-,MB- BB-CK han sido bien documentadas como se demuestra con sus respectivas constantes de Michaelis. El ATP es producido más activamente por la isoenzima del tipo cerebral BB-CK, en contraste con los tipos cardíaco y muscular.40 Las afinidades por los substratos pueden cambiar en las isoenzimas atípicas de la CK, afectando así la velocidad de formación de ATP y de creatina. La presencia simultánea de más de una isoforma catalíticamente activa de la CK en el corazón de rata de ambos sexos, a lo largo del estudio, podría estar asociada con una particular demanda energética local, no cubierta del todo por la glicólisis anaeróbica, ni por la fosforilación oxidativa mitocondrial.
• En el ser humano, un estudio reciente sobre diferencias sexuales en evaluación y desenlace de angina cardíaca inestable mostró que, después de un ajuste de muchas variables, el sexo masculino estuvo asociado con una tendencia hacia un incremento en el riesgo de muerte, ligado de manera significativa a un mayor riesgo de padecimientos cardíacos.⁴¹ También existen evidencias recientes, válidas para los varones, acerca del significado de los niveles basales de colesterol total, sobre el pronóstico de mortalidad a largo plazo en la enfermedad cardíaca coronaria estable.⁴²