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RESUMEN

Desde hace poco, la citometría de flujo de partícula en orina (CFU) está disponible como método alternativo en el uroanálisis. Con una muestra de sólo 800 microlitros es posible realizar un análisis completo. El instrumento se caracteriza por sensibilidad y linealidad elevadas. La CFU es más precisa que la microscopia del sedimento. La correlación con la cámara de recuento es excelente. El mejor desempeño analítico es la principal ventaja de esta técnica. La pronta disponibilidad de los datos es otra ventaja del procedimiento. Desde el punto de vista económico, la introducción de la CFU reduce los costos de trabajo. El empleo de sistemas expertos para la interpretación de la información permite la obtención de resultados óptimos. La calidad analítica superior de la CFU debe, sin embargo, estar acompañada por la mayor atención del cuidado preanalítico. La mayor contribución al error total se produce durante la fase preanalítica. La combinación de la información diagnóstica de la CFU con la provista por las tiras de pruebas urinarias y la medidición de proteínas urinarias específicas le proveerán al clínico información adicional. ABSTRACT

Recently, urine particle flow cytometry (UFC) has become available as an alternative method in urinalysis. A complete analysis can be carried out with only 800 microliter of sample. The instrument is characterized by a high sensitivity and linearity. UFC is more precise than sediment microscopy. Correlation with counting chamber analysis is excellent. The better analytical performance is the major advantage of the technique. Fast availability of the data is another advantage of the technique. From an economical point of view, introduction of UFC reduces labour costs. Optimal results are obtained when expert systems are used for interpreting the data. The superior analytical quality of UFC should however be accompanied by a growing attention for the pre-analytical care. The largest contribution to the total error undoubtedly occurs during the pre-analytical phase. Combining the diagnostic information of UFC with the information provided by urinary test strips and the dosage of specific urinary proteins will provide the clinician with extra information. INTRODUCCION

El examen de la orina permanece como una de las pruebas realizadas con mayor frecuencia en el laboratorio clínico. Por más de un siglo, el análisis convencional de la orina se consideró como el patrón de referencia. Sin embargo, la evaluación crítica del análisis del sedimento reveló cierta cantidad de defectos significativos, particularmente en relación a la centrifugación, la transferencia de error del tubo de centrifugación al miscroscopio y la cantidad relativamente elevada de errores de recuento debido a la cantidad relativamente baja de elementos contados. Recientemente, la citometría de flujo de partículas en orina (CFU) está disponible como un método alternativo en el uroanálisis. El presente artículo revisa el desempeño analítico de la CFU y la utilidad de esta nueva técnica analítica en el laboratorio clínico de rutina. DESCRIPCION

La citometría de flujo urinaria puede identificar glóbulos rojos (GR), glóbulos blancos (GB), células epiteliales escamosas, células redondas pequeñas (esta categoría incluye células tubulares renales y células epiteliales transicionales), cilindros hialinos, cilindros patológicos (inclusionales), bacterias, células tipo levadura, espermatozoides y cristales. La naturaleza exacta de los cristales urinarios no puede ser tipificada por el instrumento. Partículas no identificadas (tricomonas), son denominadas «otras células». Los resultados se presentan como gráficos de «nubes de puntos» e histogramas con informe de valores numéricos (como partículas por microlitro). Adicionalmente, el sistema provee un señalizador para la distribución del tamaño de los GR. El análisis completo puede efectuarse con sólo 800 microlitros de muestra. La muestra es diluida por el instrumento. El estabilizador de dilución estabiliza la presión osmótica de la orina dentro de un rango definido que permite la medición de la impedancia. La muestra de orina es calentada a 37 °C para disolver los uratos amorfos, y, luego de su tinción con carbocianina y fenantridina, ingresa a la celda de flujo. La carbocianina tiñe la membrana celular y la fenantridina tiñe los ácidos nucleicos. Las partículas son hidrodinámicamente enfocadas; un láser de argón (longitud de onda 488 nm) es dirigido hacia éstas con emisión de señales de dispersión frontal (forward scatter) y de fluorescencia específica de partículas. En base a las características físicas de la dispersión frontal, amplitud de pulso de la dispersión frontal, fluorescencia, amplitud de pulso de la fluorescencia e impedancia, las partículas urinarias son clasificadas. La conductividad es medida simultáneamente como indicador del estado de hidratación del paciente. La conductividad puede ayudar en la interpretación, especialmente cuando el resultado revela hallazgos en el límite de la normalidad o levemente al margen del rango de referencia. El instrumento UF-100 (Sysmex) puede manejar 100 muestras de orina por hora. Viene calibrado de fábrica pero esto es verificado en la instalación mediante procedimientos de recuento total de GR y GB utilizando partículas de látex provistas por fabricante. DESEMPEÑO TECNICO

El instrumento se caracteriza por su alta sensibilidad: el límite inferior para la detección de GR fue 2.3x10⁶/l, para GB 3.2x10⁶/l, para células epiteliales 0.3x10⁶/l. La linealidad se estableció hasta 4.5x10⁹ GB/l, 3.5x10¹⁰ GR/l y 2.5x10¹¹ para partículas totales por litro. La precisión en el mismo día y entre días para los varios recuentos de partículas mostró que la CFU es constante y significativamente menos imprecisa que la microscopia del sedimento. El sobrante de muestra es insignificante debido a los pasos de enjuague realizados automáticamente. La correlación con el análisis de la cámara de recuento de la orina es excelente. La adición de agentes preservantes como formaldehído y ácido bórico no interfiere con el funcionaiento del instrumento. LOCALIZACIÓN DE LOS LUGARES DE HEMATURIA

En algunos casos, la localización de la hematuria puede ser sugerida por el tamaño y forma de los eritrocitos. Sin embargo, relativamente pocos estudios clínicos validaron el empleo de la CFU para la diferenciación entre eritrocitos eumórficos y dismórficos. ESTRATEGIAS DE APLICACION

En la actualidad existen varias estrategias para el examen de orina. La CFU es apropiada para la pesquisa primaria. Los procedimientos de CFU producen recuentos más precisos y exactos que la química de reflectancia utilizada en la lectura de tiras reactivas atomatizada. Todavía existe la necesidad de revisión microscópica en una discreta minoría de casos. En numerosos laboratorios de microbiología, la CFU se implementó como primer estudio de exploración para el diagnóstico y monitoreo de las infecciones del aparato urinario. Este enfoque provee información al clínico rápidamente y reduce de manera notable la cantidad de cultivos de orina a realizarse en el laboratorio. OTRAS APLICACIONES CLINICAS DE LA TECNICA

Siguiente al uso en orina, los citómetros de flujo urinarios también pueden utilizarse con éxito para el análisis del líquido de la diálisis peritoneal en pacientes sometidos a diálisis peritoneal ambulatoria continua (detección de peritonitis). Incluso pueden efectuarse análisis del líquido cefalorraquídeo con el mismo equipamiento.² UTILIDAD CLINICA DE LA CFU

El mejor desempeño analítico es la principal ventaja de la técnica. Al no requerir centrifugación durante el análisis, menos material celular es destruido durante la manipulación de la muestra que produce en consecuencia un recuento más exacto de los elementos frágiles (cilindros). Las tricomonas no son reconocidas por el instrumento, sin embargo indicadores de infecciones por tricomonas para otros campos generalmente captan la atención del operador. Aunque el instrumento no es capaz de definir la naturaleza exacta de los cristales urinarios, la utilidad clínica de la diferenciación de cristales en el sedimento urinario es generalmente discreta. El menor volumen de muestra requerido constituye una ventaja importante en pediatría, donde la obtención del volumen requerido para la microscopia estandarizada (10 ml) no siempre es posible. La disponibilidad rápida de la información es otra ventaja de la técnica. La experiencia en la interpretación del gráfico de «nubes de puntos» es útil en la reducción de errores. La introducción económica de la CFU reduce los costos de trabajo en los laboratorios medianos y grandes. SISTEMAS EXPERTOS

Los sistemas expertos se desarrollaron para el control de los resultados del uroanálisis. Las reglas del sistema experto verifican sistemáticamente la información del instrumento y comparan los resultados de la CFU con los de las tiras reactivas urinarias (recuento GR con concentración de hemoglobina, recuento de GB con leucocitoesterasa). La ventaja principal de la aplicación de sistemas expertos radica en la reducción notable de la tasa de error y el mantenimiento de la tasa de revisión al mínimo. Los sistemas expertos también son capaces de detectar muestras de escasa calidad preanalítica (mediante el análisis de la razón GB:bacterias). A pesar de la existencia de estos sistemas expertos, la microscopia visual todavía será necesaria en una discreta cantidad de casos. Estos incluyen la diferenciación de cilindros, células epiteliales del túbulo renal, GR dismórficos, ciertos microorganismos (hongos, tricomonas y otros parásitos). También la presencia de cristales patológicos raros (cisteína, tirosina) en el sedimento todavía requiere de la microscopia visual. En el futuro cercano, la disponibilidad comercial de lectores de tiras reactivas que también proveen lecturas de reflectancia permitirán mayor perfeccionamiento del proceso de revisión del sistema experto. IMPACTO EN EL MOVIMIENTO DE TRABAJO

Varios estudios confirmaron reducciones importantes en la necesidad de microscopia comparado con el movimiento de trabajo previo. La tasa de microscopia desciende al 15%-50% de la tasa previa a la introducción de la CFU. FUTUROS DESARROLLOS EN EL UROANALISIS

La CFU está probando que es una tecnología interesante e informativa que produjo una revolución en el análisis de las partículas urinarias. La precisión analítica de la CFU es superior a la de los métodos visuales debido al proceso totalmente automatizado y por ende estandarizado. La calidad analítica superior de la CFU debe sin embargo estar acompañada por mayor atención en el cuidado preanalítico de la muestra de orina. La mayor contribución al error total indudablemente se produce durante la fase preanalítica. La combinación de la información diagnóstica de la CFU con la provista por las tiras reactivas urinarias y la determinación de proteínas urinarias específicas (como microalbúmina, alfa-1 microglobulina, alfa-2 microglobulina) le proveerán al clínico información adicional. Nuevos estudios clínicos futuros serán necesarios para explorar las posibilidades de la CFU para el diagnóstico de enfermedades nefrológicas y urológicas. BIBLIOGRAFIA

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2. Van Acker J, Delanghe J, Langlois M, Taes Y, De Buyzere M, Verstraete A: Automated flow cytometric analysis of cerebrospinal fluid, Clin Chem 2001; 47:556-560