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RESUMEN

La detección de anticuerpos contra el receptor de tirotrofina (AcRT) en pacientes con enfermedad de Graves (EG) se realiza de rutina con el ensayo de radiorreceptor (ERR) con antígeno porcino. El ensayo de segunda generación que emplea receptor de TSH humano recombinante es un ERR en un tubo recubierto y debería tener mayor sensibilidad para la detección de la EG. Se midieron AcRT en 60 pacientes con EG, 109 pacientes con autonomía diseminada, 38 enfermos con tiroiditis de Hashimoto y 205 voluntarios sanos utilizando el nuevo ERR en tubo recubierto (ERR-TR, fabricado por B.R.A.H.M.S. Diagnostica GmbH, Hennigsdorf, Alemania) y con un ERR ya establecido (Medipan Diagnostica GmbH, Selchow, Alemania). Se realizó un análisis ROC para hallar el nivel óptimo de umbral de decisión para la positividad de AcRT. De los 60 pacientes con EG, 42 fueron positivos con el ERR convencional y 52 lo fueron con el nuevo ERR-TR (sensibilidades del 70% y el 86.7%, respectivamente). Se produjeron 2 falsos positivos (1 Hashimoto y 1 voluntario sano) con el ERR-TR y 5 falsos positivos (3 Hashimoto y 2 voluntarios sanos) con el ERR porcino. El nuevo ERR-TR no sólo exhibe una mayor sensibilidad sin pérdida de especificidad para la detección de la EG sino que también tiene sensibilidad analítica funcional y variación interensayo mucho mejores. Sobre la base del análisis ROC, recomendamos un valor de corte de 1.0 UI/l para definir la positividad de AcRT. ABSTRACT

The detection of Thyrotropin-Receptor Antibodies (TRAb) in patients (pts) with Graves‘ Disease (GD) with porcine radioreceptorassays (RRA) is routinely used. The second generation assay using the human, recombinant TSH-Receptor is composed as a coated tube RRA (CT RRA) and should have a higher sensitivity for GD. We measured TRAb in 60 pts suffering from GD, 109 pts with disseminated autonomia (DA), 38 pts with Hashimoto‘s Thyroiditis and 205 healthy volunteers with the new CT RRA (Fa. B.R.A.H.M.S. Diagnostica GmbH, Hennigsdorf, Germany) as well as a established RRA (Fa. Medipan Diagnostica GmbH, Selchow, Germany). A ROC-analysis was performed to find the optimal decision threshold level for TRAb positivity.42/60 pts with GD were positive in the conventional RRA but 52/60 in the new CT RRA (sensitivity: 70 % vs. 86.7 %). 2 false positives (1 Hashimoto’s and 1 healthy volunteer) were found in the CT RRA vs. 5 (3 Hashimoto’s and 2 healthy volunteers) in the porcine RRA.The new CT RRA shows not only a better sensitivity without loss of specificity for GD but also a much better functional assaysensitivity (fas) and interassay variation. Based on the ROC-analysis‘ results, we recommend a cut-off for TRAb positivity of 1.0 IU/l. INTRODUCCIÓN

La medición de anticuerpos contra el receptor de tirotrofina (AcRT) en pacientes con enfermedad de Graves (EG) se utiliza habitualmente y está bien establecida [1-12]. Se dispone de varios equipos comerciales de ensayos de radiorreceptor (ERR) con antígeno porcino en los que se detectan AcRT por su capacidad de inhibir la unión de la TSH a su receptor [2,7,10,13]. Todavía no se dispone comercialmente de otros ensayos potencialmente más sensibles que diferencian entre los AcRT denominados bloqueantes y los estimulantes, y las técnicas empleadas (medición de AMP cíclico) limitan su uso en la práctica clínica de rutina [14-18]. Los ERR establecidos que siguen el principio de Shewring y Rees Smith detectan AcRT en el 70% al 90% de los pacientes con EG no tratada, pero algunos pacientes con esta enfermedad arrojan resultado negativo [4,1]. Costagliola, Morgenthaler y colaboradores describieron en 1999 un nuevo ensayo que utiliza receptor humano recombinante de TSH (expresado por la línea leucémica K562) y un anticuerpo monoclonal (BA8) altamente específico para el receptor nativo [19,20]. Estos autores demostraron que la sensibilidad de este ensayo en tubo recubierto (ERR-TR) es mayor en los pacientes con EG no tratada y hallaron el mismo resultado en un grupo de pacientes con EG tratada con drogas antitiroideas, pero no informaron los datos clínicos de los pacientes con recaídas o remisión [20]. Los objetivos de nuestro estudio fueron:

1. Definir el valor de corte para la positividad del nuevo ERR-TR, basado en el análisis ROC (características operativas del receptor)
2. Calcular la sensibilidad y especificidad del ensayo
3. Controlar los parámetros de calidad en comparación con el ERR convencional

MATERIAL Y METODOS

Pacientes
Se evaluaron 207 pacientes con distintas enfermedades tiroideas y 205 voluntarios sanos. Sesenta pacientes con EG (edad promedio 55 ± 14.7 años) y una recaída hipertiroidea luego del tratamiento con drogas antitiroideas por al menos 12 meses (máximo 20 meses) fueron evaluados directamente antes del tratamiento con iodo radiactivo (TIR). De éstos, 57 interrumpieron la terapia con drogas antitiroideas 3 semanas antes del TIR; esta medida fue imposible en 3 casos debido a consideraciones clínicas. El 53% de los pacientes (32 casos) tenía oftalmopatía endocrina y el 72% (43 casos) exhibía el típico patrón hipoecogénico en la ecografía. Más aún, 23 enfermos (38%) tenían anticuerpos antitiroglobulina, 42 (70%) eran positivos para anticuerpos contra peroxidasa tiroidea (TPO) y 18 de estos últimos eran positivos para ambos tipos de anticuerpos. Se incluyeron también 109 pacientes con autonomía diseminada (edad promedio 67 ± 9.6 años), los que también fueron evaluados directamente antes del TIR. Estos enfermos también habían interrumpido la terapia con drogas antitiroideas 3 semanas antes del TIR. Ninguno exhibía oftalmopatía endocrina o patrón hipoecogénico en la ecografía, pero 6 de ellos eran positivos para anticuerpos anti-TPO y uno para anticuerpos antitiroglobulina. En los 6 casos con anticuerpos anti-TPO no pudimos hallar ningún signo adicional para definir los casos como EG. El estudio incluyó también 38 pacientes con tiroiditis de Hashimoto (edad promedio 51 ± 12 años). La presencia de esta enfermedad fue definida sobre la base del seguimiento clínico de 3 a 5 años y por datos adicionales tales como la positividad para anticuerpos anti-TPO o antitiroglobulina o ambos, la imagen hipoecogénica típica y los resultados de la aspiración con aguja fina. Los 38 pacientes habían tomado levotiroxina a causa de su hipotiroidismo al momento de la medición de AcRT. Se obtuvieron también muestras de suero de 205 voluntarios sanos (edad promedio 40 ± 10.6 años) provenientes de una investigación endocrina, los que carecían de antecedentes de enfermedad tiroidea, presentaban volumen tiroideo normal (menos de 25 ml en los varones y de 18 ml en las mujeres), no exhibían nódulos tiroideos ni otros hallazgos patológicos, tenían un patrón normal en la ecografía, eran eutiroideos (valores normales de TSH, T3, T4, T3 libre y T4 libre) y no ingerían fármacos que pudieran influir sobre la función de la tiroides. No obstante, se hallaron anticuerpos antitiroglobulina en 9 de estos voluntarios (4.4%) y anticuerpos anti-TPO en 12 (5.8%). Medición de AcRT por el ERR porcino convencional
La medición de AcRT se realizó con el ERR comercial denominado TSH REZAK producido por Medipan Diagnostica GmbH (Selchow, Alemania). Los valores de referencia citados por el fabricante son: negativo =< 9 UI/l, zona gris = 9 a 14 UI/l, positivo => 14 UI/l. Medición de AcRT con el nuevo ERR-TR
Utilizamos el nuevo ERR-TR de segunda generación denominado DYNOtest TRAK producido por B.R.A.H.M.S. Diagnostica GmbH (Hennigsdorf, Alemania). El equipo está diseñado como un ensayo en tubos recubiertos con el receptor de TSH, el cual liga los AcRT de los sueros en estudio o los controles estándar. Luego se agrega TSH bovina marcada con ¹²⁵I, la que se une a los receptores que hayan quedado libres. De esta manera la señal es inversamente proporcional a la concentración de AcRT en la muestra. El fabricante señala como valores de referencia: negativo =< 1 UI/l, zona gris = 1 a 1.5 UI/l, positivo => 1.5 UI/l. Análisis estadístico y definición de los valores de corte
Para la definición de un umbral de decisión óptimo para la positividad de AcRT se llevó a cabo un análisis ROC (características operativas del receptor) y se comparó la sensibilidad de ambos ensayos en distintos puntos de igual especificidad (diferentes valores de concentración de AcRT) [21]. Medición de los parámetros de calidad
Se estimaron los siguientes parámetros establecidos de calidad para ambos ensayos: variación interensayo, sensibilidad funcional del ensayo (SFE) en 5 mezclas de sueros de pacientes con EG (concentración media de AcRT 0.5 a 7 UI/l, 10 corridas con distinta carga) definida como el 20% del coeficiente de variación interensayo (CV), la variación intraensayo, y la sensibilidad analítica del ensayo (SAE) como 15 veces la tasa de conteo cero-estándar (Xn + 2Sx) [22]. Calibración de ambos ensayos de AcRT
El fabricante del ERR-TR calibró el ensayo de acuerdo al estándar 90/672 de la OMS de 1995. En cambio, el ERR convencional fue calibrado según el estándar de 1996 del Medical Research Council (B65/122; LATS). Por ello, una unidad (U/l) del Medical Research Council (MRC) equivale a aproximadamente 1.5 unidades (UI/l) de la OMS, y una unidad de la OMS equivale a 4 unidades del MRC, respectivamente. Pero la comparación directa de estas unidades sólo es posible luego de la estandarización del ERR porcino según el nuevo estándar de la OMS. Para una mejor comprensión utilizamos UI/l para la nueva unidad de la OMS y U/l para la unidad del MRC. RESULTADOS

Sobre la base de los valores medidos de AcRT en los pacientes con EG y los voluntarios sanos, se llevó a cabo el análisis ROC. Los resultados y la comparación de sensibilidades asociadas a valores de especificidad del 97.5% y el 99.5% se muestran en las tablas 1a y 1b [21,23]. (INSERTAR LAS TABLAS 1A Y 1B)Comparamos la sensibilidad para una especificidad del 99.5% y obtuvimos un valor de corte de 1.0 UI/l para el nuevo ERR-TR y de 6 U/l para el ERR porcino. Realizamos un análisis de regresión con los valores de AcRT de los pacientes con EG dirigidos desde el ERR porcino al ERR-TR. La figura 1 muestra la buena correlación entre ambos ensayos (r = 0.87; p < 0.001) [23]. (INSERTAR LA FIGURA 1 Y A LA DERECHA, EL EPIGRAFE zophel_epi1.GIF) La sensibilidad para la EG en la población evaluada se incrementó del 70% con el ERR convencional al 86.7% con el ERR-TR de segunda generación. En las tablas 2a y 2b se sintetizan otros parámetros estadísticos [23]. Todos los sueros de pacientes con EG clasificados como positivos para AcRT por el ensayo convencional también fueron positivos con el nuevo ensayo. Todos los pacientes con autonomía diseminada arrojaron resultado negativo en el ensayo ERR-TR y sólo uno de ellos exhibió una concentración de más de 6 U/l en el ERR porcino (zona gris). Entre los pacientes con tiroiditis de Hashimoto, se obtuvo resultado positivo en 1 caso (2.1 UI/l) y 3 casos, respectivamente. Dentro del grupo de voluntarios sanos se registró un caso positivo con el ERR-TR (2.4 UI/l) y 2 positivos con el ERR convencional (tablas 2a y 2b). (INSERTAR LAS TABLAS 2A Y 2B)Parámetros de calidad
La variación intraensayo del ERR (20 veces) fue del 12.7% (concentración media de AcRT: 19.7 U/l) y la del nuevo ERR-TR fue del 7.7% (concentración media de AcRT: 5.1 UI/l). Los resultados de la estimación de la variación interensayo se resumen en las tablas 3a y 3b. La SFE obtenida se muestra en las figuras 2a y 2b: se obtuvo 1.0 UI/l para el ERR-TR y 8 U/l para el ERR convencional [18,23]. Se halló una SAE (15 veces) de 0.4 UI/l para el ensayo nuevo y de 7 UI/l para el ensayo porcino.(INSERTAR LAS TABLAS 3A Y 3B)(INSERTAR LAS FIGURAS 2A Y 2B, UNA AL COSTADO DE LA OTRA, SI ES POSIBLE)Figuras 2a/2b. Variación interensayo en relación con la concentración de una mezcla de sueros del ERR-TR (a) y del ERR porcino (b) para la estimación de la sensibilidad funcional del ensayo (medida en 10 corridas con distinta carga). DISCUSION

Este estudio confirma que el ensayo de segunda generación basado en receptor humano recombinante de TSH con un formato de tubo recubierto permite una sensibilidad significativamente mayor sin pérdida de especificidad en la medición de AcRT para el diagnóstico de EG. La investigación demuestra también resultados concordantes y buena correlación entre el nuevo ERR-TR y el ERR porcino convencional en los pacientes con EG. Cuando se fijó la especificidad en el 99.5%, el 86.7% de los pacientes con recaídas de hipertiroidismo por EG luego del tratamiento con drogas antitiroideas durante 12 a 20 meses examinados antes del TIR arrojaron resultado positivo para AcRT en el ERR-TR, mientras que el 70% fue positivo en el ERR convencional. Las posibles razones para la ventaja del nuevo ensayo podrían ser el receptor recombinante de TSH y la técnica de fase sólida, lo cual permitiría una reducción del ligamiento no específico [20]. Nuestros resultados del análisis ROC variando el valor de corte para la positividad de AcRT también indican una ventaja técnica debida al formato de tubo recubierto en el ERR-TR (tablas 1a y 1b). Esto parece obedecer a la mejor relación señal/ruido [20]. El menor valor de corte incrementa la sensibilidad, como lo demuestra el análisis ROC. Las áreas bajo la curva constituyeron la confirmación matemática de este hecho; el área bajo la curva fue del 96.4% para el ERR-TR y del 92.7% para el ERR porcino. En cambio, Kakinuma y col. no hallaron ventajas significativas de sensibilidad y especificidad entre el receptor humano y el receptor porcino de TSH para el diagnóstico de EG con un ensayo de inhibición del ligamiento de tirotrofina. Pero estos autores utilizaron un sistema propio diferente del fabricado por B.R.A.H.M.S. [24], lo cual sustenta la hipótesis de que es la técnica de tubo recubierto y no el receptor humano recombinante de TSH lo que explica gran parte de la superioridad del nuevo ensayo [25]. Ninguno de los pacientes con autonomía diseminada arrojó resultado positivo en los 2 ensayos utilizados. Sólo las muestras de un paciente con tiroiditis de Hashimoto y un voluntario sano produjeron resultado positivo para AcRT con el ERR-TR. Desde el punto de vista clínico, sin embargo, esto no constituyó un problema serio porque ambos pacientes eran claramente eutiroideos (el paciente con tiroiditis tomaba levotiroxina) y el TIR no se consideraba una opción terapéutica. La positividad de AcRT en el caso de la tiroiditis de Hashimoto probablemente se deba a anticuerpos bloqueantes que se unen al receptor de TSH y, aunque son detectables, llevan a un hipotiroidismo [20]. El ensayo actual para AcRT no permite distinguir entre anticuerpos anti-receptor de TSH bloqueantes y estimulantes. Resulta notable que el valor de corte para la positividad de AcRT en el ERR convencional calculado por el análisis ROC haya sido de 6 U/l. Este valor se ubica claramente por debajo de la SAE (7 U/l) y de la SFE (8 U/l), por lo que la interpretación de los valores de AcRT entre 6 y 8 U/l requiere atención. En nuestro análisis ROC, el valor de corte de 15 U/l recomendado por el fabricante se relaciona con una especificidad del 100% (tabla 1b). Esto confirma la elevada especificidad de la medición de AcRT con el ERR convencional, pero la sensibilidad en ese punto es muy pobre (56.7%). Por lo tanto, debe concluirse que el principal problema del ensayo porcino es su baja precisión en el rango de 6 a 15 U/l (figura 2a y 2b). En el rango importante para la decisión clínica, entre 1 y 2 UI/l, el nuevo ERR-TR parece aventajar al ERR porcino. La SFE fue establecida en 1 UI/l (figura 2b). Aunque un voluntario sano arrojó resultado positivo para AcRT, ningún otro se ubicó en la zona gris entre 1 y 1.5 UI/l sino que todos quedaron por debajo de 1 UI/l, lo cual no respalda el rango de referencia recomendado por el fabricante. De acuerdo con los resultados de SFE y del análisis ROC, nosotros consideramos como positivos todos los valores de AcRT mayores a 1 UI/l. Según nuestros datos, no se justifica la zona gris recomendada. Cuando se trataba de un caso clínicamente típico de hipertiroidismo, un valor de AcRT superior a 1 UI/l sustentó en todos los casos el diagnóstico de EG [23]. La nueva Unidad Internacional de AcRT dependiente de la estandarización también requirió nuestra atención. Los datos presentados demuestran los obstáculos de la conversión de la bien conocida U/l a la UI/l (tablas 3a y 3b). A diferencia de lo hallado por otros grupos, nosotros concluimos que sólo luego de la calibración del ERR convencional con el nuevo estándar 90/672 de la OMS es posible una conversión directa de U/l en UI/l [25]. En el rango bajo, pero importante, de 0.5 y 4 UI/l este factor de conversión se ubica claramente por debajo de 4. Sólo por encima de 4 UI/l la relación entre ambos métodos se aproxima a 4 a 1 (fig. 1, tablas 3a y 3b).BIBLIOGRAFIA

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