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RESUMEN

Los astrovirus se identifican con frecuencia creciente como causa de gastroenteritis en seres humanos. La microscopia electrónica (ME) se considera el método de elección para el diagnóstico, pero esta tecnología está limitada a unos pocos laboratorios. Evaluamos un enzimoinmunoensayo comercial (EIA) (IDEIA^TM Astrovirus, DAFO, Diagonstika, Hamburgo, Alemania) para la detección directa del antígeno en muestras fecales. En comparación con la ME, el ensayo exhibió un 100% de sensibilidad y especificidad (n = 213; 26 muestras positivas) y reaccionó con cepas representativas de todos los serotipos conocidos. Durante un lapso de 11 meses examinamos 4 211 muestras de materia fecal de pacientes alemanes no seleccionados que padecían gastroenteritis aguda. Se hallaron microorganismos etiológicamente responsables en 9.3% de los casos; Astrovirus fue el tercer patógeno más frecuente (1.2%) después de Salmonella spp. (2.9%) y Rotavirus (2.5%), representando el 13.5% de todas las muestras postivas. No se estudiaron virus similares al Norwalk (NLV), hongos ni protozoarios. En niños menores de 2 años (n = 458), la incidencia de infección por Astrovirus fue significativamente más elevada (2.8%) en comparación con los de 2 a 7 años (n = 578; 1.7%) y los mayores de esa edad (n = 3 175; 0.9%). La frecuencia reveló un pico en invierno (media de noviembre a febrero, 2.0% en comparación con otros meses, 0.8%). Palabras clave: Astrovirus, gastroenteritis aguda, diagnóstico de laboratorio, enzimoinmunoensayo antigénico, incidencia en Alemania. INTRODUCCION

Los astrovirus, pertenecientes a la familia Astroviridae,¹ fueron descriptos por primera vez en 1975 y recibieron su nombre por su aspecto estrellado en el examen con microscopio electrónico.² Son pequeños virus (28 nm de diámetro), redondeados, con cadena de ARN, bien caracterizados genéticamente.^3-5 Se dividen en al menos siete serotipos.^6-8 Actualmente se los considera una causa importante de gastroenteritis en adultos y niños^9-11 y las infecciones en lactantes pueden ser tan severas como las causadas por rotavirus, obligando incluso a la internación.^12,13 Se informaron índices de prevalencia de gastroenteritis en lactantes de 2 a 9% y, en algunos casos, los astrovirus fueron la segunda causa más común después de los rotavirus, en ocasiones más frecuente que los patógenos bacterianos.¹⁴ No obstante, los índices de prevalencia informados a menudo derivan de investigaciones de brotes epidémicos o de estudios de poblaciones no europeas, en donde las condiciones sanitarias y el agua potable podrían intervenir en la propagación de la infección.¹⁵ En Alemania, son escasos los datos sobre la incidencia de gastroenteritis por Astrovirus en la comunidad.^12-18 La información acerca de la prevalencia y epidemiología de Astrovirus en todo el mundo ha sido limitada por la ausencia de pruebas diagnósticas de rutina disponibles. Tradicionalmente se utilizó el estudio por microscopia electrónica, pero depende de la preservación morfológica de la muestra y de la habilidad del operador;^19,20 por lo tanto, se limita a unos pocos centros importantes. La sensibilidad del cultivo por Astrovirus utilizando diferentes líneas celulares es insuficiente para el uso de rutina^21-23 y los métodos moleculares recientemente desarrollados, incluyendo la hibridación dot-blot y la reacción en cadena de polimerasa (PCR), no son aplicables ni útiles para este fin.^24,25 La disponibilidad de antisuero específico contra epitopes del grupo, género o tipo permitió desarrollar inmunoensayos para la detección directa del antígeno. Se demostró que estas pruebas tienen mayor sensibilidad y resultan métodos de pesquisa económicos, confiables y rápidos.^26,27 MATERIALES Y METODOS

Evaluación de la prueba
El enzimoinmunoensayo cualitativo IDEIA^TM Astrovirus (DAKO Diagnostika GmbH, Hamburgo, Alemania), desarrrollado recientemente para detectar antígeno de Astrovirus en materia fecal humana, fue evaluado en una muestra de población, analizándose 213 muestras obtenidas de pacientes atendidos por gastroenteritis aguda en cuatro centros de salud del Reino Unido. La fase sólida del ensayo utiliza una combinación de anticuerpos monoclonales y policlonales específicos del género dirigidos contra un epitope de la cápside presente en todos los serotipos conocidos de astrovirus humanos. Los criterios de desempeño, incluyendo sensibilidad, especificidad y correlación con el método de referencia fueron determinados en comparación con el procedimiento de elección (la microscopia electrónica) y se suplementaron con microscopia inmunoelectrónica (MIE), como se describió anteriormente,^21,22 para resolver los resultados discrepantes. Además, aislamientos derivados de cultivos de siete cepas de serotipos diferentes fueron estudiados en una dilución 1:10 en una solución amortiguadora de muestra. Estos cultivos fueron suministrados gentilmente por T. Lee, de Oxford PHL, Inglaterra. Objetivo del estudio en la comunidad
El objetivo de nuestro estudio fue determinar la incidencia de infección por Astrovirus como causa de diarrea en la población general, comparándola con la de otros agentes infecciosos comunes y decidir si la pesquisa de rutina de muestras de materia fecal utilizando este EIA para el antígeno de Astrovirus mejoraría el diagnóstico de laboratorio. Diseño
La investigación se desarrolló durante un lapso de 11 meses (julio 1997 a mayo 1998) en un laboratorio de microbiología estándar. Nuestro Instituto atiende a médicos generales y departamentos de pacientes ambulatorios de varios hospitales cercanos en North-Rhine-Westphalia, Alemania. Se incluyeron en el estudio todas las muestras de materia fecal enviadas por los médicos generales solicitando la identificación de patógenos. Las muestras fueron obtenidas de pacientes que referían náuseas, vómitos, diarrea y dolor abdominal, con fiebre o sin ella. Se examinaron en total muestras fecales correspondientes a 4 211 pacientes, con una mediana de edad de 39 años (rango, <1 a 89 años). No diferenciamos entre varones y mujeres porque no se esperaba hallar predominio de ningún sexo. Los patógenos bacterianos se aislaron con los métodos de cultivo de rutina, utilizando los siguientes medios: Leifson, caldo selenita y XLD, CIN y Campy CVA. Para la detección de los patógenos virales utilizamos enzimoinmunoensayos cualitativos disponibles comercialmente (IDEIA^TM Astrovirus, IDEIA^TM Adenovirus e IDEIA^TM Rotavirus (Dako Diagnostika GMbH, Hamburgo, Alemania), siguiendo el procedimiento de prueba y la interpretación de los resultados de acuerdo a las recomendaciones del fabricante. No se examinaron virus similares al Norwalk ni protozoarios. RESULTADOS

Evaluación de la prueba
Los resultados iniciales con microscopia electrónica de las 213 muestras utilizadas para la validación de la prueba fueron los siguientes: 24 positivas para Astrovirus (figura 1) (tipo 2, n = 11; tipo 1, n = 6; no tipificables, n = 7) y 187 negativas para este agente, pero 3 contenían adenovirus, 4 rotavirus, 21 SRSV y 4, otros patógenos entéricos (tabla 1). (INSERTAR putzker_fig1.GIF Y, A LA DERECHA, putzker_epi1.GIF) (INSERTAR LA TABLA 1)La sensibilidad y la especificidad fueron calculadas inicialmente en 100% y 98.9%, respectivamente, con 99.1% resultados idénticos en comparación con el método de referencia. Los resultados discrepantes (n = 2) fueron resueltos mediante MIE, aumentando el número de resultados positivos a 26. Posteriormente, los tres parámetros de desemepeño alcanzaron el 100%. La prueba IDEIA^TM Astrovirus reaccionó con los cultivos de los siete serotipos de referencia (tabla 2). (INSERTAR LA TABLA 2)Estudio de incidencia

Se identificó un patógeno microbiano en 391 de 4 211 muestras (9.3%) (tabla 3). El rango de microorganismos detectados incluyó Salmonella spp., Rotavirus, Astrovirus, Campylobacter spp., Adenovirus, Clostridium difficile, Escherichia coli enteropatógena (EPEC) y Yersinia enterocolitica. Cuatro patógenos representaron alrededor de 80% de las muestras positivas, siendo el astrovirus en tercero en frecuencia. La distribución de muestras positivas para astrovirus a lo largo del tiempo se presenta en la tabla 4: se observó un pico durante el invierno, con una incidencia media de 2.0% entre noviembre y febrero significativamente más elevada que la observada en los otros meses (0.8%) o en el promedio de todo el período de investigación (1.2%). En la tabla 5 se observa la distribución de edades de los pacientes con muestras positivas. Los sujetos fueron divididos en los siguientes tres subgrupos: menores de 2 años, de 2 a 7 años y mayores de 7 años, observándose una disminución significativa de la incidencia en ese orden. (INSERTAR LAS TABLAS 3, 4 y 5)DISCUSION

Las investigaciones a gran escala sobre la prevalencia de infecciones por Astrovirus en gastroenteritis agudas adquiridas en la comunidad han sido limitadas por la escasa disponibilidad de estudios diagnósticos de rutina apropiados. La prueba IDEIA^TM Astrovirus es un nuevo enzimoinmunoensayo comercial que puede ser aplicado fácilmente a exámenes de gran volumen. Los valores de absorbancia del enzimoinmunoensayo dependieron de las concentraciones relativas de Astrovirus tipos 1 y 2 (tabla 2), pero estos aislamientos habían sido sometidos a múltiples ciclos de congelación y descongelación que podrían haber disminuido la capacidad de fijación antigénica.Mediante el empleo de esta prueba, pudimos presentar datos sobre la incidencia de infección por Astrovirus como agente etiológico de diarrea en una gran población de pacientes en Alemania. Después de Salmonella spp. y rotavirus, los astrovirus fueron el patógeno asociado con mayor frecuencia con gastroenteritis aguda en la población general, con una incidencia global de 1.2%. Se observó un aumento de los casos durante los meses de invierno. La incidencia fue significativamente más elevada en menores de 2 años, pero también se produjeron infecciones en los adultos. Nuestros resultados coinciden con los datos informados por otros investigadores en todo el mundo con respecto a la distribución del patógeno, su correlación con la edad²⁸ y la naturaleza estacional de la enfermedad.²⁹ en comparación con otras investigaciones, hallamos una menor incidencia de Astrovirus (así como también de rotavirus) en niños pequeños,^30,31 lo que podría atribuirse al tipo de pacientes y a la muestra de población incluida en este examen. La mayoría de los estudios publicados se refieren a brotes epidémicos o a pacientes seleccionados con gastroenteritis virales típicas.^32,33 En un consultorio comunitario, el médico primario suele atender a un paciente con un conjunto de manifestaciones gastroentéricas de causa desconocida y los exámenes coprológicos se realizan, precisamente, para descartar una enfermedad infecciosa, aumentando la proporción de muestras negativas. Para evaluar la importancia de los astrovirus como causa de gastroenteritis agudas en estas condiciones, la incidencia debe ser comparada con la de otros patógenos frecuentes. En una investigación más extensa deberán considerarse también otros agentes etiológicos, como virus similares al Norwalk, protozoarios y hongos.Opinamos que los resultados obtenidos permiten extraer las siguientes conclusiones:

1. La prueba IDEIA^TM Astrovirus (elaborada por DAKO Diagnostika) demostró excelente sensibilidad y especificidad y sería adecuada para el diagnóstico de rutina de infecciones por Astrovirus
2. La epidemiología de esta infección en Alemania no difiere de la observada en otras partes del mundo, así como tampoco la incidencia, el grupo de edad más afectado y la distribución estacional
3. Si se tienen en cuenta las limitaciones de este estudio acerca de la no identificación de virus similares al Norwalk, los astrovirus representaron el 13.5% de todas las muestras de heces positivas y fueron la tercera causa más común de diarrea
4. La inclusión de la pesquisa de Astrovirus en el diagnóstico de rutina de la gastroenteritis aguda mejora sensiblemente el índice de detección de microorganismos, en especial en niños pequeños.