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RESUMEN

Los neutrófilos de pacientes con shock séptico presentan reducción de la quimiotaxis, de la función fagocítica y de la producción de radicales de oxígeno (intracelular y extracelular). Asimismo, tienen menor actividad bactericida en múltiples ensayos. Los resultados del análisis de sangre entera por citometría de flujo (FACS) se correlacionan con los obtenidos por métodos que requieren aislamiento de neutrófilos (microscopia y estudios espectrofotométricos). En cambio, no hay correlación entre las pruebas en enfermos con situaciones subyacentes semejantes, pero sin shock séptico.ABSTRACT

Patients with septic shock neutrophils have decreased chemokinesis, chemotaxis, phagocytic function, decreased reactive oxygen intermediate production (both, intra- and extracellular) and reduced bactericidal function by multiple assays and their assessment by whole blood assays (FACS analysis) correlates with assays requiring isolated neutrophils (microscopic and spectrophotometric assays). For patients with similar underlying conditions without septic shock this does not occur.INTRODUCCION

Durante la sepsis se han descripto diversas alteraciones en las funciones de los neutrófilos, como deficiencia en la adherencia [21], quimiotaxis [2], menor degranulación [20] y menor fagocitosis [17] así como también disminución en la producción de radicales libres de oxígeno [19,24,25]. Sin embargo, otros grupos encontraron aumento de la quimiotaxis y del estallido respiratorio, en particular en sujetos sin patologías subyacentes [8,10,12]. Los neutrófilos son células frágiles, fácilmente dañadas durante la manipulación inadecuada. Algunas pruebas para valorar la función de los neutrófilos requieren procedimientos de aislamiento para individualizar su acción de las de otras células circulantes. Sin embargo, los procedimientos de separación pueden ser potencialmente dañinos o pueden inducir un estado de preactivación celular. En el estudio comparamos la fagocitosis de neutrófilos y la producción de metabolitos intermedios de oxígeno (ROI) mediante el análisis de sangre entera por citometría de flujo [22] con microscopia de fluorescencia [13] y prueba de reducción de la citocromo C [14,5], utilizando neutrófilos separados en gradiente de Ficoll-Paque [11] en pacientes con shock séptico y controles. A su vez, se valoró la actividad bactericida, el nivel intracelular de calcio y la quimiotaxis. PACIENTES Y METODOS

Se incluyeron 13 enfermos con shock séptico (5, puntaje de 25 a 34 en la escala APACHE II) y 13 controles de 26 a 84 años (promedio 55 ± 18 años) con las mismas patologías subyacentes: enfermedad coronaria, n =1; carcinoma de vejiga, n = 1; diabetes, n = 1; abuso de drogas intravenosas, n = 2; insuficiencia renal crónica, n = 1; pancreatitis, n = 1; síndrome antifosfolípido, n = 1; cirrosis hepática, n = 2; litiasis renal, n = 1 y trauma abdominal, n = 1. No se incluyó ningún enfermo infectado por el virus de la inmunodeficiencia humana. Las muestras de sangre se tomaron antes del tratamiento antibiótico, adrenérgico o con esteroides.En el recuento diferencial, los neutrófilos de todos los pacientes con shock séptico tuvieron granulaciones tóxicas.Todas las pruebas se realizaron a ciegas y fueron interpretadas por S. Patruta y K. Stich. La concordancia de las lecturas fue superior al 90%. Los neutrófilos se separaron de sangre venosa según el procedimiento de Nauseef y colaboradores [15] y Metcalf y colaboradores [13]. La fagocitosis y la muerte intracelular de E. coli opsonizada se analizó según la técnica descripta por Moiola [14] con la utilización de la cepa ATCC 25922. Los datos se expresaron como el porcentaje de bacterias fagocitadas y muertas por los neutrófilos. La producción de ROI se determinó con la reducción de la citocromo C inhibible por superóxido dismutasa según el procedimiento descripto por Nauseef y colaboradores [15]. Los datos se expresan en nmol de O² producido por 2 x 10⁵ células. El cálculo se efectuó usando el coeficiente de extinción molar de 29.9 x 10³ mol/l. Los niveles de calcio intracelular se midieron con Fura-2 AM, utilizando un fluorómetro Perkin-Elmer, modelo LS 5B (Perkin-Elmer, Norwalk, CT), según el método de Alexiewicz y colaboradores [1]. Los resultados se expresan en nmol/l. La quimiotaxis y quimioquinesis se valoró con el método de la agarosa [6]. La fagocitosis y la producción de ROI se determinaron por citometría de flujo, acorde con la técnica de Wenisch y colaboradores [22]. Todas las pruebas se realizaron por duplicado. Las diferencias entre los grupos se calcularon con la t de Student y se utilizó la correlación Pearson. Las diferencias se consideraron significativas con p inferior a 0.01. RESULTADOS

En pacientes con septicemia, el porcentaje de bacterias fagocitadas, el número de E.coli por neutrófilo y el porcentaje de bacterias muertas estuvo alterado (tabla 1). En estos enfermos se observó una correlación significativa entre la fagocitosis medida por citometría de flujo y la visualización microscópica del porcentaje de bacterias fagocitadas (r = 0.784) y el número de E. coli por neutrófilo (r = 0.748). La muerte de bacterias fagocitadas se relacionó con la producción de ROI posestimulación según la reducción de la citocromo C (r = 0.735). No se comprobó correlación entre los resultados de la citometría de flujo y la evaluación microscópica en controles. En pacientes con septicemia, la producción basal de ROI estuvo aumentada pero la producción posestimulación y el porcentaje de aumento con la estimulación estuvieron alterados (tabla 1). En enfermos sépticos se constató correlación entre la producción basal de ROI según la reducción de la citocromo C y la citometría de flujo (r = 0.701). La producción basal de ROI estuvo relacionada con la quimiotaxis (r = 0.734). Nuevamente, en controles no hubo correlación entre los resultados de la citometría de flujo y la reducción de la citocromo C. (INSERTAR LA TABLA 1)El nivel basal de calcio intracelular no fue distinto entre pacientes con sepsis o sin ella (26 ± 6 y 30 ± 7 nmol/l, respectivamente). Además, el nivel de calcio intracelular después de la activación no difirió entre los grupos (331 ± 98 nmol en controles versus 279 ± 56 nmol/l en pacientes con septicemia). En controles se observó una relación negativa entre el nivel de calcio inicial y posestimulación y la cantidad de bacterias fagocitadas por neutrófilo (r = 0.701). En cambio, no hubo correlación entre los niveles de calcio intracelular y la fagocitosis en pacientes sépticos. La quimioquinesis de neutrófilos estuvo alterada en enfermos con septicemia (0.48 ± 0.1 en controles versus 0.38 ± 0.1 en sujetos con sepsis, p = 0.006). En forma similar, la quimiotaxis estuvo reducida (4.8 ± 0.7 en controles y 3.3 ± 1.1 en pacientes con sepsis, p < 0.001). No hubo relación entre la quimiotaxis y la quimioquinesis y otros índices de funcionalidad. CONCLUSIONES

Los hallazgos confirman la reducción de la quimiotaxis [2], fagocitosis [20], producción de ROI [19,22,24,25] y muerte [16,17] en neutrófilos de pacientes con sepsis. En ellos, los estudios de fagocitosis y de producción de ROI en polimorfonucleares de sangre entera y neutrófilos aislados, dieron los mismos resultados. Sin embargo, en controles no hubo correlación entre dichos ensayos. Esto es particularmente interesante ya que los procedimientos de separación celular se asocian con aumento en la expresión de receptores de membrana, como CD18/CD11b, CD32 y CD16 [9,7]. Durante la septicemia es probable que este aumento de la expresión ocurra in vivo. Se ha visto que tanto la separación de neutrófilos como la temperatura son factores que influyen en la expresión de receptores C3 [3]. Durante la centrifugación y resuspensión y en presencia de temperaturas elevadas ocurre un incremento espontáneo. En forma global, los ensayos que emplean neutrófilos purificados pueden alterarse por múltiples factores -procedimiento de aislamiento, contaminación con eritrocitos, temperatura, anticoagulantes, tiempo que transcurre desde la extracción de sangre y el ensayo y recuento de polimorfonucleares [4,18,23]. Estos factores podrían ser explicaciones adicionales para la falta de correlación entre la citometría de flujo y la reducción de la citocromo C por microscopia, en controles. El aumento brusco del calcio intracelular en neutrófilos activados se correlaciona con la fagocitosis. En pacientes con sepsis grave no se observó esta relación, lo cual podría atribuirse a factores extrínsecos (electrólitos, citoquinas) o intrínsecos (autooxidación, etc) sobre los neutrófilos [22]. En forma conjunta, los resultados sugieren la aplicabilidad de ambos métodos (neutrófilos aislados y de sangre entera) para interpretar con precisión la funcionalidad celular, especialmente en sujetos con disminución menos marcada de la función de los neutrófilos.RECONOCIMIENTOS

Agradecemos a Karen Stich por la asistencia en laboratorio y al Profesor Wolfgang Graninger por la revisión crítica del trabajo. BIBLIOGRAFÍA

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