Artículo completo
RESUMEN

La preocupación por la ruptura del huso microtubular y de los cromosomas, que conduce al desarrollo de anomalías genéticas, ha impedido la aprobación de este procedimiento en algunos países. Un informe que revisó la historia de la criopreservación de los oocitos humanos y que comunicó el aumento reciente de niños nacidos a partir de oocitos descongelados (Paynter SJ; Human Reproduction Update 6:449-456, 2000) fue el fundamento de la autorización, en enero de 2000, de la primera licencia que permitía el uso clínico de oocitos descongelados en el Reino Unido. Desde entonces se informaron más nacimientos con el empleo de oocitos humanos criopreservados, pero el éxito, en términos de nacimiento de niños vivos a partir de oocitos descongelados aún es bajo. Se requiere mayor investigación para el desarrollo de mejores técnicas tanto para la criopreservación de los oocitos maduros como para la maduración y criopreservación de los estadios inmaduros del oocito. ABSTRACT

Concerns that cryopreservation of human oocytes could lead to disruption of the microtubular spindle and chromosomes, thus leading to genetic abnormalities of the offspring produced, mean that this procedure is not permitted in some countries. A report which reviewed the history of human oocyte cryopreservation and which reported a recent spate of human live births from thawed oocytes (Paynter SJ; Human Reproduction Update 6:449-456, 2000) prompted the granting, in January 2000, of the first licence allowing the clinical use of thawed oocytes in the UK. Since then, more births from cryopreserved human oocytes have been reported but success in terms of live births from thawed oocytes remains low. Further research is required to refine current cryopreservation techniques for mature oocytes and to develop methods for the maturation and cryopreservation of immature stages of oocyte. INTRODUCCION

La criopreservación facilita el almacenamiento de oocitos por períodos prolongados en pacientes con riesgo de perder la función ovárica, en particular en las mujeres que recibirán tratamientos oncológicos que podrían reducir la fertilidad. Además, la técnica otorga mayor flexibilidad a los servicios de fertilización para otro tipo de pacientes. Al lograr la conservación antes de la fertilización de una proporción de oocitos recolectados después de la superovulación, se disipan muchas de las preocupaciones éticas asociadas con la preservación de embriones. CRIOPRESERVACION DE OOCITOS MADUROS

La recuperación de oocitos almacenados a muy bajas temperaturas ha resultado una técnica mucho más difícil que la preservación similar de espermatozoides y embriones. Para ser fertilizado y desarrollarse, el oocito debe conservar la integridad de varias características estructurales únicas, muchas de las cuales son afectadas por las bajas temperaturas. Entre ellas se incluyen la zona pelúcida, los gránulos corticales, el huso microtubular y los cromosomas condensados. El oocito maduro es también una de las células de mamífero de mayor tamaño (aproximadamente 130 µm de diámetro). Debido a esto tiene, además, una baja relación entre superficie y volumen, así como también escasa permeabilidad al agua y a los crioprotectores,^1,2 factores que no favorecen la criopreservación. Historia
A pesar de los problemas asociados con esta técnica, los oocitos de diversas especies han sido criopreservados con éxito, informándose nacimientos vivos de ratones, conejos, vacas, seres humanos y, recientemente, caballos. El primer informe del nacimiento de un niño vivo a partir de oocitos criopreservados fue publicado en 1986.³ El método consistió en la exposición de los oocitos a 1.5 mol/l de dimetilsulfóxido (el crioprotector) durante 15 minutos en hielo y enfriamiento lento a -36 °C, seguido de inmersión y almacenamiento en nitrógeno líquido. El descongelamiento fue rápido y el crioprotector se diluyó agregando solución fisiológica con buffer fosfato. En este notable estudio, 38 de 50 oocitos sobrevivieron al congelamiento y descongelamiento. Al menos 75% de ellos fueron fertilizados después de la exposición a los espermatozoides y 60% se dividieron hasta la fase de seis-ocho células. Dos de las siete pacientes a quienes fueron transferidos los embriones quedaron embarazadas, culminando con un parto gemelar3 y uno único.⁴ Se realizaron diversos estudios utilizando técnicas similares^5,6 o de enfriamiento lento en presencia de propano-1,2-diol y sacarosa;^7,8 enfriamiento rápido en presencia de concentraciones más elevadas de dimetilsulfóxido más sacarosa,^7,9 enfriamiento rápido en presencia de una mezcla de crioprotectores^10,11 y enfriamiento lento en presencia del crioprotector glicerol.¹² Los resultados fueron malos y sólo se informó un nacimiento⁵ en estos estudios.Durante estos años, estudios en modelos humanos y animales revelaron que la exposición a bajas temperaturas o a las sustancias químicas utilizadas durante el congelamiento podría destruir elementos del citoesqueleto,^13-19 con riesgo de causar pérdida o reordenamiento de los cromosomas. La criopreservación también causaría cambios en la zona pelúcida que rodea a los oocitos.^20-25 El endurecimiento de esta estructura bloquea la fertilización. Con el desarrollo de la técnica de inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI), este problema en particular puede ser solucionado fácilmente. Exito reciente
Después del uso generalizado de una técnica para la criopreservacón de embriones humanos se utilizó un método similar para la preservación de oocitos. Los estudios iniciales demostraron índices razonables de supervivencia (64%)¹⁸ y cariotipos normales, aunque en un número muy escaso de embriones.²⁶ En 1997 se presentó el primer informe del nacimiento de un niño vivo después del uso combinado de técnicas de criopreservación de oocitos e ICSI.²⁷ El protocolo de congelación utilizado fue uno de congelamiento lento y descongelamiento rápido en presencia de propano-1,2-diol y sacarosa. Con esta técnica o con otras ligeramente modificadas se informaron más de 20 nacimientos.^28,29 El estudio más extenso publicado hasta la fecha incluyó 1 769 oocitos, de los cuales 1 502 fueron descongelados.³⁰ Cincuenta por ciento de ellos sobrevivieron y 58% de éstos fueron fertilizados. En el 91% se produjo la división. Dieciséis embarazos culminaron con 11 nacimientos (siete únicos y dos pares de gemelares). Las modificaciones aplicadas al método de criopreservación se centraron en la adición de un crioprotector antes del congelamiento. El aumento de la temperatura de 20 a 37 °C, con reducción simultánea del tiempo de exposición al crioprotector, permitió el nacimiento de niños vivos.³¹ También resultó beneficiosa la optimización del tiempo de exposición al crioprotector a temperatura ambiente, permitiendo el ingreso a la célula de una cantidad suficiente y reduciendo la duración de la exposición a temperaturas subóptimas.³² Tal vez uno de los hechos más significativos fue que la duplicación de la concentración de sacarosa a 0.2 mol/l produjo una supervivencia de 60%, mientras que la triplicación se acompañó de un aumento de 80%.³³ La sacarosa facilitaría la deshidratación de los oocitos antes del congelamiento, disminuyendo así el riesgo de daño por la formación intracelular de hielo, lo que explicaría el aumento de la supervivencia.Recientemente se aplicó con éxito a la preservación de oocitos humanos una técnica que intenta evitar por completo la formación de hielo mediante el empleo de rápidas velocidades de enfriamiento junto con elevadas concentraciones de crioprotector (aproximadamente 6 mol/l). Se publicaron dos informes de nacimientos de niños vivos después de la vitrificación de oocitos humanos maduros en presencia del crioprotector etilenglicol.^34,35CRIOPRESERVACION DE OOCITOS INMADUROS

Todo el trabajo mencionado hasta aquí se refería a la criopreservación de oocitos maduros. En el estado inmaduro, el oocito carece del huso microtubular y los cromosomas se encuentran en un estado fluido, por lo que estas células serían candidatas ideales para la preservación a bajas temperatura. Los oocitos inmaduros completamente desarrollados pueden ser obtenidos en forma similar a la utilizada para los oocitos maduros, con la ventaja de requerir menos estimulación hormonal. Los oocitos inmaduros también pueden ser obtenidos de un corte de tejido ovárico. En el último caso, la mejor opción sería almacenar piezas de tejido que contuvieran numerosos oocitos en estadios iniciales. Cuanto menor sea la célula mayores serán sus posibilidades de supervivencia después del congelamiento. La principal desventaja de almacenar oocitos inmaduros es que deben ser madurados antes de ser expuestos a la fertilización. La maduración in vitro de oocitos humanos completamente desarrollados es una técnica que aún se está investigando, aunque se informaron nacimientos de niños vivos a partir de oocitos frescos³⁶ y congelados.³⁷ En general, el desarrollo de embriones obtenidos de oocitos completamente desarrollados criopreservados está alterado, lo que podría indicar una falla para alcanzar la maduración citoplasmática completa. El acúmulo celular que rodea al oocito antes de la fertilización asegura su nutrición a través de las uniones de brecha o máculas comunicantes durante la fase de crecimiento y es probable que también sea necesario para las etapas finales de su maduración. Las células del acúmulo a menudo se pierden durante el congelamiento,^38,39 por lo que se requiere un protocolo de criopreservación que permita la supervivencia de estos dos tipos celulares diferentes y la preservación de las vías de comunicación entre ambos. La maduración in vitro de oocitos en estadios más tempranos, contenidos en los folículos primordiales, sólo fue lograda en ratones, con el nacimiento de un solo animal vivo.⁴⁰ El injerto de tejido ovárico congelado en ovejas culminó con el nacimiento de un cordero⁴¹ y técnicas similares aplicadas en seres humanos demostraron la capacidad del folículo para aumentar de tamaño después del injerto.⁴² El injerto de tejido congelado y posteriormente descongelado de pacientes con cáncer debe ser utilizado con precaución, debido a que células metastásicas presentes en el torrente sanguíneo pueden sobrevivir al proceso de congelamiento-descongelamiento y reimplantarse.⁴³ Por cierto, aún es necesario resolver diversos interrogantes, uno de los cuales es la optimización del procedimiento de congelación-descongelación, antes del uso clínico de esta técnica.⁴⁴CONCLUSIONES
Actualmente, la opción con más probabilidades de culminar en embarazo en pacientes adultas con cáncer y alteración de la fertilidad, imposibilitadas de preservar embriones, es el congelamiento de oocitos maduros. El nacimiento reciente de niños vivos a partir de oocitos congelados es muy alentador, pero los resultados aún son variables y la proporción de recién nacidos vivos a partir de oocitos descongelados varía entre el 1 y el 10%. Aunque los índices de fertilización, división e implantación se aproximan a los observados con oocitos frescos en algunos estudios, la supervivencia de estas células está alterada. Uno de los factores determinantes es la calidad del oocito antes del congelamiento. Los estudios con los mejores índices de supervivencia han sido aquellos en los que se congelaron los oocitos de mejor calidad. Indudablemente, los malos resultados de algunos se deben, al menos en parte, al empleo de oocitos de calidad subóptima, ya sea porque los mejores habían sido seleccionados para la transferencia de embriones en fresco o porque los oocitos habían sido cultivados antes del congelamiento.Un inconveniente importante del uso de oocitos criopreservados ha sido la aplicación simultánea de ICSI para lograr la fertilización. Una vez fertilizado, el embrión aún debe dividirse y conservar un complemento normal de cromosomas. A pesar de los informes de ruptura del huso después de la criopreservación o de la exposición a los crioprotectores y a las bajas temperaturas, la dispersión de los cromosomas es menos frecuente, permaneciendo anclados aun en ausencia del huso.⁴⁵ No obstante, pocos estudios investigaron las anomalías cromosómicas en los embriones. Un embarazo, resultante de espermatozoides testiculares criopreservados y un oocito congelado, culminó en aborto y un cariotipo XXY, probablemente como consecuencia de la fertilización de un huevo digínico, es decir, uno en el cual se retienen el segundo cuerpo polar, sus cromosomas o ambos.⁴⁶ Los oocitos habían sido cultivados durante 12 horas antes de la criopreservación, lo que podría haber contribuido a la anomalía. En otro estudio no se observaron anomalías de los cromosomas 13, 18, 21, X e Y entre los embriones obtenidos con oocitos frescos y criopreservados.⁴⁷ Resulta alentador no haber informado hasta la fecha anomalías en los niños nacidos a partir de oocitos criopreservados.El éxito, en términos de nacimiento de niños vivos a partir de oocitos congelados, por el momento ha sido alcanzado utilizando diversas técnicas de criopreservación. A pesar de los resultados promisiorios de los estudios de vitrificación y el atractivo evidente de estas técnicas por el tiempo que permitirían la conservación de estas células, su aplicación clínica debe ser cautelosa. Los protocolos incluyen tiempos de exposición muy breves a concentraciones extremadamente elevadas de crioprotectores; incluso un ligero desvío de la técnica podría tener consecuencias desastrosas.Cualquiera sea la técnica de criopreservación utilizada, los índices generales de éxito son bajos. Este hecho es importante, debido a que, aun con la estimulación hormonal, se obtienen relativamente pocos oocitos (por lo general menos de 20) y en las pacientes con cáncer esta cifra suele ser aún menor.⁴⁸ El problema se complica aún más porque, en un conjunto de oocitos, probablemente exista variabilidad en la permeabilidad de la membrana de las células individuales⁴⁹ y en su sensibilidad a la formación de hielo. Los problemas asociados con esto último han sido solucionados, al menos en parte, con el aumento de la temperatura en la cual se induce la formación de hielo extracelular.⁵⁰ A pesar de estos problemas, la criopreservación de oocitos maduros actualmente es la mejor opción para preservar la fertilidad en mujeres en quienes no es posible preservar embriones. Antes de iniciar un programa con estas características se deberá informar a las pacientes acerca de los riesgos propios de la criopreservación de oocitos y los bajos índices de éxito obtenidos por el momento. Sin duda, se requieren más investigaciones para mejorar los índices de supervivencia. BIBLIOGRAFIA

1. Paynter, S.J., Cooper, A., Gregory, L., Fuller B.J. and Shaw, R.W. (1999) Permeability characteristics of human oocytes in the presence of the cryoprotectant dimethylsulphoxide. Hum. Reprod., 14, 2338-2342
2. Paynter, S.J., O’Neil, L., Fuller, B.J. and Shaw, R.W. (2001) Membrane permeability of human oocytes in the presence of the cryoprotectant propane-1,2-diol. Fertil. Steril., 75, 532-538
3. Chen, C. (1986) Pregnancy after human oocyte cryopreservation. Lancet I, 884-886Chen, C. (1988) Pregnancies after human oocyte cryopreservation. Ann. N.Y. Acad. Sci., 541, 541-549
4. Van Uem, J.F.HM., Siebzehnrubl, E.R., Schuh, B., Koch, R., Trotnow, S. and Lang, N. (1987) Birth after cryopreservation of unfertilized oocytes, Lancet II, 752-753
5. Diedrich, K., Al Hasani, S., van der Ven, H. and Krebs, D. (1987) Successful in vitro fertilization of frozen-thawed rabbit and human oocytes. Abstracts 5th World Congress on IVF and ET, 562-570
6. Al Hasani, S., Diedrich, K., Van der Ven, H., Reinecke, A., Hartje, M. and Krebs, D. (1987) Cryopreservation of human oocytes. Hum. Reprod., 2, 695-700
7. Todorow, S., Seibzehnrubl, E., Koch, R., Wildt, L., and Lang, N. (1989) Comparative results on survival of human and animal eggs using different cryoprotectants and freeze-thawing regimens II Human. Hum. Reprod., 4, 812-816
8. Pensis, M., Loumaye, E. and Psalti, I. (1989) Screening of conditions for rapid freezing of human oocytes: preliminary study toward their cryopreservation. Fertil. Steril., 52, 787-794
9. Feichtinger, W., Benko, I. and Kemeter, P. (1988) Freezing human oocytes using rapid techniques. Ann. N. Y. Acad. Sci., 101-110
10. Hunter, J.E., Fuller, B.J., Bernard, A., Jackson, A. and Shaw, R.W. (1995) Vitrification of human oocytes following minimal exposure to cryoprotectants; initial studies on fertilization and embryonic development. Hum. Reprod., 10, 1184-1188
11. Hunter, J.E., Bernard, A.G., Fuller B.J., Amso. N. and Shaw, R.W. (1991) Fertilization and development of the human oocyte following exposure to cryoprotectants, low temperatures and cryopreservation: A comparison of two techniques. Hum. Reprod., 6, 1460-1465
12. Pickering, S.J. and Johnson, M.H. (1987) The influence of cooling on the organization of the meiotic spindle of the mouse oocyte. Hum. Reprod., 2, 207-216
13. Sathananthan, A.H., Henry, A., Trounson, A., Freeman, L. and Brady, T. (1988) The effects of cooling human oocytes. Hum. Reprod., 3, 968-977
14. Pickering, S.J., Braude, P.R., Johnson, M.H., Cant, A. and Currie, J. (1990) Transient cooling to room temperature can cause irreversible disruption of the meiotic spindle of the human oocyte. Fertil. Steril., 54, 102-108
15. Pickering, S.J., Braude, P.R. and Johnson, M.H. (1991) Cryoprotection of human oocytes: inappropriate exposure to DMSO reduces fertilization rates. Hum. Reprod., 6, 142-143
16. Sathananthan, A.H., Kirby, C., Trounson, A., Philipatos, D. and Shaw, J. (1992) The effects of cooling mouse oocytes. J. Assist. Reprod. Genet., 9, 139-148
17. Gook, D.A., Osborn, S.M. and Johnston, W.I.H. (1993) Cryopreservation of mouse and human oocytes using 1,2-propanediol and the configuration of the meiotic spindle. Hum. Reprod., 8, 1101-1109
18. Almeida, P.A. and Bolton, V.N. (1995) The effect of temperature fluctuations on the cytoskeletal organisation and chromosomal constitution of the human oocyte. Zygote, 3, 357-365
19. Sathananthan, A.H., Trounson, A. and Freeman, L. (1987) Morphology and fertilizability of frozen human oocytes. Gamete Research, 16, 343-354.
20. Schalkoff, M.E., Oskowitz, S.P. and Powers, R.D. (1989) Ultrastructural observations of human and mouse oocytes treated with cryopreservatives. Biol. Reprod., 40, 379-393
21. Vincent, C., Pickering, S.J., and Johnson, M.H. (1990) The hardening effect of DMSO on the mouse zona pellucida requires the presence of an oocyte and is associated with a reduction in the number of cortical granules present. J. Reprod. Fertil., 87, 253-259
22. Carroll, J., Depypere H., and Matthews, C.D. (1990) Freeze-thaw induced changes of the zona pellucida explains decreased rates of fertilization in frozen-thawed mouse oocytes. J. Reprod. Fertil., 90, 547-553
23. Wood, M.J., Whittingham, D.G. and Sang-Ho, L. (1992) Fertilization failure of frozen mouse oocytes is not due to premature cortical granule release. Biol. Reprod., 46, 1187-1195
24. Carroll, J., Wood, M.J. and Whittingham, D.G. (1993) Normal fertilization and development of frozen-thawed mouse oocytes: Protective action of certain macromolecules. Biol. Reprod., 48, 606-612
25. Gook, D.A., Osborn, S.M., Bourne, H. and Johnston, W.I.H. (1994) Fertilisation of human oocytes following cryopreservation: normal karyotypes and absence of stray chromosomes. Hum. Reprod., 9, 684-691
26. Porcu, E., Fabbri, R., Seracchioli, R., Ciotti, P.M., Magrini, O, and Flamigni, C. (1997) Birth of a healthy female after intracytoplasmic sperm injection of cryopreserved human oocytes. Fertil. Steril., 68, 724-726
27. Polak de Fried, E., Notrica, J., Rubinstein, M., Marazzi, A. and Gomez Gonzalez, M. (1998) Pregnancy after human donor oocyte cryopreservation and thawing in association with intracytoplasmic sperm injection in a patient with ovarian failure. Fertil. Steril. 69, 555-557
28. Tucker, M.J., Morton, P.C., Wright, G., Sweitzer, C.L. and Massey, J.B. (1998) Clinical application of human egg cryopreservation. Hum. Reprod. 13, 3156-3159
29. Porcu, E., Fabbri, R., Damiano, G., Giunchi, S., Fratto, R., Ciotti, P.M., Venturoli, S. and Flamigni, C. (2000) Clinical experience and applications of oocyte cryopreservation. Mol. Cell Endocrinol., 169, 33-37
30. Yang, D.S., Blohm, P.L., Cramer, L., Nguyen, K., Zhao, Y.L. and Winslow, K.L. (1999) A successful human oocyte cryopreservation regime: survival, implantation and pregnancy rates are comparable to that of cryopreserved embryos generated from sibling oocytes. Fertil. Steril., 72, Suppl 1, S86
31. Fabbri, R., Porcu, E., Marsella, T., Primavera, M.R., Rochetta, G., Ciotti, P.M., Magrini, O., Seracchioli, R., Venturoli, S. and Flamigni, C. (2000) Technical aspects of oocyte cryopreservation. Mol. Cell Endocrinol., 169, 39-42
32. Fabbri, R., Porcu, E., Marsella, T., Rochetta, G., Venturoli S., and Flamigni, C. (2001) Human oocyte cryopreservation: new perspectives regarding oocyte survival. Hum. Reprod., 15, 411-416
33. Kuleshova, L., Gianoarioli, L., Magli, C., Ferraretti, A. and Rounson, A. (1999) Birth following vitrification of a small number of human oocytes. Hum. Reprod., 14, 3077-3079
34. Yoon, T.K., Chung, H.M., Lim, J.M., Han, S.Y., Ko, J.J. and Cha, K.Y. (2000) Pregnancy and delivery of healthy infants developed from vitrified oocytes in a stimulated in vitro fertilization-embryo transfer program. Fertil. Steril., 74, 180-181
35. Cha, K.Y., Choi., D.H., Koo, J.J., Han, S.Y., Ko, J.J. and Yoon, T.K. (1991) Pregnancy after in vitro fertilization of human follicular oocytes collected from nonstimulated cycles, their culture in vitro and their transfer in a donor oocyte program. Fertil. Steril., 55, 109-113
36. Tucker, M.J., Wright, G., Morton, P.C. and Massey, J.B. (1998) Birth after cryopreservation of immature oocytes with subsequent in vitro maturation. Fertil. Steril., 70, 578-579
37. Cooper, A., Paynter, S.J., Fuller, B.J. and Shaw, R.W. (1998) Differential effects of cryopreservation on nuclear or cytoplasmic maturation in vitro in immature mouse oocytes from stimulated ovaries. Hum. Reprod., 13, 971-978
38. Goud, A., Goud, P., Qian, C., Van der Elst, J., Van Maele, G. and Dhont, M. (2000) Cryopreservation of human germinal vesicle stage and in vitro matured MII oocytes: influence of cryopreservation media on the survival, fertilization, and early cleavage divisions. Fertil. Steril., 74, 487-494
39. Eppig, J.J. and O’Brien, M.J. (1996) Development in vitro of mouse oocytes from primordial follicles. Biol. Reprod., 54, 197-207
40. Gosden, R.G., Baird, D.T., Wade, J.C. and Webb, R. (1994) Restoration of fertility to oophorectomized sheep by ovarian autografts stored at -196°C. Hum. Reprod., 9, 597-603
41. Oktay, K., Karlikaya, G., Gosden R., and Schwarz, R. (1999) Ovarian function after autologous transplantation of frozen-banked human ovarian tissue. Fertil. Steril., 72, Suppl 1, S21
42. Shaw, J.M., Bowles, J., Koopman, P., Wood, E.C. and Trounson, A.O. (1996) Fresh and cryopreserved ovarian tissue samples from donors with lymphoma transmit the cancer to graft recipients. Hum. Reprod., 11, 1668-1673
43. Kim, S.S., Battaglia, D.E. and Soules, M.R. (2001) The future of human ovarian cryopreservation and transplantation: fertility and beyond. Fertil. Steril., 75, 10349-1056
44. Zenzes, M.T., Bielecki, R., Casper, R.F. and Leibo, S.P. (2001) Effects of chilling to 0ºC on the morphology of meiotic spindles in human metaphase II oocytes. Fertil. Steril., 75, 769-777
45. Chia, C.M., Chan, W.B. Quah, E. and Cheng, L.C. (2000) Triploid pregnancy after ICSI of frozen testicular spermatozoa into cryopreserved human oocytes. Hum. Reprod., 15, 1962-1964
46. Cobo, A., Rubio, C., Gerli, S., Ruiz, A., Pellicer, A., and Remohi, J. (2001) Use of fluorescence in situ hybridization to assess the chromosomal status of embryos obtained from cryopreserved oocytes. Fertil. Steril., 75, 354-360
47. Posada, M.N., Kolp, L. and Garcia, J.E. (2001) Fertility options for female cancer patients: facts and fiction. Fertil. Steril., 75, 647-653
48. Hunter, J.E., Bernard, A., Fuller, B.J., McGrath, J.J. and Shaw, R.W. (1992) Measurements of the membrane permeability (Lp) and its temperature dependence (activation energy) in human fresh and failed-to-fertilize oocytes and mouse oocyte. Cryobiology 29, 240-249
49. Trad, F.S., Toner, M. and Biggers, J.D. (1999) Effects of cryoprotectants and ice-seeding temperature on intracellular freezing and survival of human oocytes. Hum. Reprod. 14, 1569-1577