Abstract
In the murine model of tuberculosis, the immune response based on the T helper type 1 pathway prevails and it has been characterized as "clean" and "non toxic" by the majority of the experts for a long time. Latent M. Tuberculosis is able to escape from the granuloma to the alveolar space slipping away to the Th1 response adapting its metabolism to the stress generated and avoiding its replication. M. Tuberculosis is now located inside partially activated foamy macrophages in the alveolar space and it is able to multiply and to destroy the host cell spreading through the alveolar space leading to the death of mice. Taking into account that this process may occur in initial phases of the human infection and in the presence of a paramount extracellular bacillar population in the intragranulomatous necrosis, a switch to the polyantigenic strategy, which includes antigens from the latent bacilli and the stimulus of the humoral response, would be needed in the development of future vaccines.

Key words
Tuberculosis, modelo experimental, ratón, bacilo latente, vacuna

Artículo completo
En primer lugar el lector me permitirá recalcar la ambigüedad calculada del título que implica una doble vertiente del problema del control de la tuberculosis: geoeconómico y puramente patogénico. Por ello apunto como preámbulo que aunque en la década de los noventa la OMS explicitó la situación desesperada de esta enfermedad, declarando la "situación de emergencia" e intentando estimular todo tipo de sensibilidades para hacerle frente de una forma más eficaz, las perspectivas para el período 2002-2020 son extraordinariamente pesimistas. Se calcula que se infectarán 1 000 millones de personas, que se declararán 150 millones de enfermos nuevos y que se ocasionarán 36 millones de muertes.¹Más allá de las valoraciones sociopolíticas del problema, me centro en la segunda acepción el significado del título y reitero su oportunidad: la erradicación de Mycobacterium tuberculosis de los tejidos del hospedador infectado es altamente compleja y de aquí la intención de este artículo, que no es sino la de hacerles participar de una serie de reflexiones surgidas a partir del trabajo diario de nuestro grupo en el modelo de tuberculosis experimental inducido en ratones mediante aerosol.Evolución de la infección por M. tuberculosis
La infección tiene su inicio, en la mayoría de los casos, con la inhalación de un aerosol que contiene M. tuberculosis. Una vez que consigue llegar al espacio alveolar, el bacilo es fagocitado por los macrófagos alveolares. Puesto que M. tuberculosis es capaz de evitar la unión entre la bomba de ATPasa y el fagosoma que lo contiene, la acidificación de éste no tiene lugar y por tanto el bacilo es capaz de multiplicarse en su interior.² Este parece ser el mecanismo primordial de virulencia de la bacteria. En esta situación, el macrófago infectado procede a la síntesis de diferentes quimiocinas y citocinas para atraer células inflamatorias a su alrededor y hacer frente a la agresión, siendo la más importante el factor de necrosis tumoral (TNF).³ Este estímulo se traduce en la formación a su alrededor de una estructura pregranulomatosa formada por monocitos, macrófagos y linfocitos mezclados sin ningún orden aparente.A pesar de todo, M. tuberculosis sigue multiplicándose eficazmente hasta el punto de que su presencia puede implicar a todos los tejidos del hospedador. Efectivamente, su crecimiento desborda la capacidad de control de la respuesta innata del hospedador, y empieza a diseminarse no tan sólo localmente, sino a través de los conductos linfáticos y hemáticos. Dentro de esta dinámica catastrófica, aparece la actuación de las células dendríticas. Sean de origen monocítico o linfocítico, estas células penetran en los tejidos infectados con una cinética muy diferente a la de los macrófagos. Estos últimos tienen el objetivo de permanecer en el parénquima para destruir a cualquier agente nocivo, ya sea en el espacio intersticial o alveolar; finalmente pasan a este último, y de allí al árbol bronquial superior, tráquea, para ser deglutido hacia el estómago donde es destruido, o simplemente para ser expulsado al exterior.⁴ La célula dendrítica tiene una capacidad mucho menor de destrucción del bacilo; su misión es, simplemente, la de fagocitarlo para penetrar en los conductos linfáticos y presentarlo a los linfocitos vírgenes para posibilitar la generación una respuesta inmune específica.⁵ Lo que ocurre en el caso de M. tuberculosis es que su crecimiento es tan importante y a la vez sigiloso (debido a que no se acompaña de síntesis de toxinas ni de destrucción del tejido circundante) que sobrepasa el ganglio linfático regional y acaba diseminándose sistémicamente antes de que se genere la inmunidad.Cuando la respuesta inmune tiene lugar, los linfocitos acuden a los focos de infección del pulmón para reconocer a los antígenos presentados por los macrófagos infectados. Estos antígenos, las proteínas generadas por M. tuberculosis en multiplicación,⁶ han sido procesados esencialmente en el interior de los fagosomas, y por ello estimulan a linfocitos de tipo T CD4 o helper (Th) y primordialmente del subtipo Th1,⁷ es decir, capaces de sintetizar interferón-gamma (IFN-γ) y por tanto de activar a los macrófagos. Evidentemente, también se generan de tipo Th2, caracterizados por la síntesis de interleucina 4 (IL-4), que favorecen la estimulación de los linfocitos B y la formación de anticuerpos. De todas maneras, también se estimulan linfocitos de tipo T CD8,⁸ capaces de sintetizar IFN-γ y de inducir la citólisis de los macrófagos infectados.Sea como fuere, el mecanismo primordial de la destrucción de M. tuberculosis pasa por la activación del macrófago mediante IFN-γ. Un aspecto controvertido es el papel de óxido nítrico (NO) como mediador de este proceso. En realidad, en el modelo experimental del ratón, la enzima oxido nítrico sintetasa inducible (iNOS) juega un papel importante, y se relaciona con la capacidad del NO de generar complejos de nitrógeno oxidados (RNI) y con la capacidad de destrucción bacilar.⁹ La controversia estriba en el hecho de que en las células humanas esta correlación no ha podido ser demostrada y que el NO tiene actividad antiinflamatoria muy potente.¹⁰ En todo caso la activación de la acidificación del fagosoma por parte de IFN-γ sí que ha podido ser demostrada en ambas especies.¹¹Con la aparición de la respuesta inmune y la destrucción de la mayor parte de la población bacilar se objetivan en el parénquima pulmonar los granulomas típicos, caracterizados por un núcleo necrótico envuelto por una capa de macrófagos que a su vez se envuelve de una capa de linfocitos, en presencia de células gigantes multinucleadas. Este tipo de lesión se han demostrado en los modelos experimentales de tuberculosis en el conejo y el cobayo, aunque no se generan en el ratón, y teóricamente se podría encontrar en todos los tejidos del hospedador donde se ha diseminado el bacilo. Los granulomas evolucionan hacia la fibrosis y la calcificación, y con ella la práctica eliminación de la infección. Sin embargo, el proceso de la eliminación del bacilo es muy prolongado por que M. tuberculosis genera un estado de latencia o persistencia que le permite sobrevivir durante largos períodos de tiempo.Finalmente, algunas de estas lesiones sufren un proceso denominado de licuefacción del tejido necrótico que facilita la reactivación de los bacilos latentes presentes en su interior, desencadenando un proceso de recrudecimiento de la reacción inflamatoria, incremento del tamaño de la lesión y finalmente erosión del árbol bronquial y comunicación de la lesión con el medio exterior, y con ello la posibilidad de generar aerosoles que contengan M. tuberculosis.La inducción de necrosis intragranulomatosa
En cuanto al origen de la necrosis intragranulomatosa, la teoría más aceptada durante mucho tiempo fue la enunciada por Dannenberg,¹² basada en la distinción en la respuesta inmune entre la "hipersensibilidad retardada" (DTH), entendida como la capacidad del hospedador infectado de reaccionar ante la inoculación intradérmica de un extracto de M. tuberculosis (el PPD, de purified protein derivative), y la "inmunidad celular" (CMI), o la capacidad para activar a los macrófagos, mediatizada por dos subtipos de linfocitos diferentes. La DTH sería la responsable de la destrucción de los macrófagos infectados no activados. Por tanto, los hospedadores "más susceptibles", es decir con pocos linfocitos de tipo CMI, tendrían mayor DTH y con ello se generaría mayor necrosis interna en sus granulomas. Sin embargo, los estudios más recientes ponen en tela de juicio esta teoría debido a que se ha demostrado que los linfocitos capaces de sintetizar IFN-γ también generan la DTH.¹³ Por otra parte nuestro grupo, inspirado en Altiyah y Rook¹⁴ y en las observaciones realizadas en los años 30 por el grupo de Lurie¹⁵ en sus experimentos con conejos, ha podido reproducir esta necrosis intragranulomatosa en ratones, basándonos en la hipótesis de que este fenómeno no era sino una necrosis hemorrágica derivada de la reacción de Shwartzman.¹⁶ Este autor describió que la inoculación local en la piel de lipopolisacárido (LPS), seguida de la inoculación de LPS por vía endovenosa a las 24 horas, provocaba necrosis hemorrágica en el punto de inóculo inicial. Posteriormente, esta reacción se relacionó con la capacidad del LPS de generar TNF y de atraer la presencia de neutrófilos. En este sentido, nuestro grupo interpretó que el granuloma tuberculoso se comportaría como el tejido al que se inocula inicialmente con LPS, puesto que las células del granuloma tuberculoso generan mucho TNF, y lo que hicimos fue introducir LPS intranasalmente para desencadenar la necrosis,¹⁷ con éxito. Y también ha funcionado al administrarlo mediante aerosol (datos sin publicar). Llegados a este punto, ¿cuál es la extrapolación del fenómeno en los hospedadores en los que éste se desarrolla espontáneamente La respuesta cabe buscarla en la misma experiencia de Lurie,¹⁵ en la que observaba la aparición del fenómeno paralelamente al período donde la concentración bacilar era más elevada, y en los estudios sobre la pared celular de M. tuberculosis llevados a cabo por Roach y cols.¹⁸ En estos estudios se demuestra que uno de los componentes más importantes es el lipoarabinomanano (LAM), que tendría propiedades muy similares al LPS. Por tanto, en hospedadores como el ser humano, en las lesiones pregranulomatosas, generadoras importantes de TNF, tiene lugar un crecimiento muy importante bacilar, y con ello gran acúmulo de LAM en un período relativamente reducido, que ocasionaría la necrosis. Si esta teoría puede funcionar en el hombre, el conejo o el cobayo, ¿por qué no funciona en el ratón La respuesta se debe buscar en el hecho que este hospedador tiene muy poco volumen corporal y que, por tanto, debe generar un tipo de respuestas mucho menos importantes que los hospedadores de mayor masa, puesto que de otra manera la respuesta inflamatoria acabaría destruyendo la totalidad de sus tejidos.Latencia y cronicidad en la infección por M. tuberculosis
Otra característica fundamental en el modelo experimental de tuberculosis en los ratones es la mal entendida cronificación de la infección. Mal entendida porque se considera a partir de la monitorización de la concentración bacilar en los tejidos. Efectivamente, considerando la cinética de este parámetro, con la de, por ejemplo, los cobayos, el ratón consigue "controlar" la infección, mientras que el primero es incapaz. De todas maneras, la ocupación del parénquima pulmonar por las lesiones granulomatosas dista mucho de poderse considerar como "controlable" en el modelo del ratón.En este apartado nuestro grupo ha dedicado muchos esfuerzos. En realidad ya hace cierto tiempo que se supone que la muerte sobreviene en los animales infectados debido a la ocupación del parénquima pulmonar por el tejido lesionado.¹⁹ Por otra parte, nosotros hipotetizamos y apoyamos experimentalmente una evolución de las lesiones en el parénquima pulmonar en la que se daba gran valor al aspecto expansivo de ellas.²⁰ Contrariamente a lo que se consideraba hasta la fecha ²¹ nosotros definimos una evolución en la que se podían diferenciar granulomas iniciales (primarios), o los focos dónde se habían multiplicado los bacilos inhalados, y granulomas fruto de la diseminación (secundarios) que, contrariamente a los primeros, se caracterizaban por tener un núcleo con escasos macrófagos infectados y un gran manto de linfocitos a su alrededor. En ambos casos había un patrón de afectación intersticial importante. Posteriormente se desarrollaba infiltración alveolar a su alrededor, protagonizada por macrófagos espumosos.²²Este desarrollo no tendría que ser relevante, puesto que la aparición de macrófagos alveolares alrededor de lesiones parenquimatosas pulmonares es habitual en la fase de resolución de cualquier proceso infeccioso pulmonar, al tratarse de macrófagos que entran en el interior de las lesiones para "limpiarlas" de detritus, y posteriormente seguir su cinética habitual y abandonar el parénquima en dirección ascendente hacia la tráquea a través del espacio alveolar.⁴ Lo que es más importante señalar es que la gran mayoría de estos macrófagos transportan restos de pared celular de M. tuberculosis²³ y en una proporción importante se puede demostrar la presencia de bacilos ácido alcohol resistentes en su interior. Igualmente, la realización de un lavado broncoalveolar revela esta circunstancia, ya sea mediante tinción o cultivo, que objetiva una concentración bacilar muy importante. También hemos podido demostrar, tal como hicieron otros grupos,²⁴ que estos macrófagos están activados hasta cierto punto, puesto que es posible detectar en su interior la presencia de iNOS y NO. Esta circunstancia, que podría parecer paradójica, se puede explicar por el hecho que la destrucción de M. tuberculosis mediante NO o RNIs es dosis dependiente.²¹ En este sentido, el estudio comparativo que hemos realizado²³ entre dos cepas de ratones con mayor o menor susceptibilidad a la infección (cepas C57BL/6 y DBA/2, respectivamente) ha demostrado que, en el primer caso, la síntesis de IFN-γ es más elevada, hecho que se traduce en menor concentración bacilar en el pulmón y en el BAL, y en menor afectación parenquimatosa por parte de los macrófagos espumosos. Lo que nos llamó más la atención fue el hecho de que al realizar la detección de la expresión de mARN de iNOS, en el animal susceptible era significativamente más elevada que en el resistente. Este hecho se explicaba, evidentemente, por la presencia de muchos más macrófagos espumosos, que aunque expresaban iNOS, seguían infectados. Teniendo en cuenta que los macrófagos activados que expresan iNOS inducen inmunosupresión local mediante la inhibición transitoria de los linfocitos T a través del NO,²⁵ nos encontramos con un proceso de difícil control.En efecto, el ratón desarrolla una "segunda" corona (la primera está compuesta por linfocitos) alrededor de los granulomas, que constituye una especie de "santuario" para los bacilos de M. tuberculosis que han sobrevivido a la destrucción generada por los macrófagos activados, es decir, los bacilos latentes que se generan transformando su metabolismo, cesando su multiplicación y engrosando su pared celular tal como hacen muchas otras bacterias ante una reacción de estrés.²⁶ De esta manera podemos considerar dos posibles escenarios para explicar el fenómeno de esta segunda corona. Por un lado tendríamos a los macrófagos infectados y activados que han destruido a la mayoría de los bacilos; por otro la de macrófagos recién llegados que fagocitan los detritus procedentes de los macrófagos y los bacilos destruidos y que además fagocitan a los posibles bacilos latentes extracelulares. En ambos casos, una vez que han sublimado su capacidad fagocítica y se convierten en macrófagos espumosos, abandonan el granuloma a través del espacio alveolar. También, en ambos casos, el macrófago sintetizará NO. En el primer caso como consecuencia de la activación por parte de un linfocito Th1 específico a través del IFN-γ y en el segundo de manera IFN-γ independiente y totalmente inespecífica, mediante la estimulación ejercida por antígenos de la pared celular de M. tuberculosis. Sea como fuere, estos macrófagos no pueden volver a ser activados, constituyendo un medio excelente para la reactivación de M. tuberculosis en fase latente. El mecanismo mediante el cual este bacilo decide reactivar su multiplicación debe ser el de cualquiera otra bacteria en esta situación: neutralización del pH, por ejemplo.²⁶ Lo que pasa es que el metabolismo de M. tuberculosis ya es de por sí muy lento,²⁷ por la cual cosa la reactivación del bacilo latente requeriría no tan solo la relajación del medio estresante en el macrófago espumoso, sino el tiempo que requiere el propio bacilo para rehacer su maquinaria metabólica.Una vez reactivado, el bacilo se multiplica en esta "segunda" corona, que no es sino el espacio intraalveolar repleto de macrófagos espumosos con capacidad inmunosupresora. Al multiplicarse, estos bacilos acaban destruyendo al macrófago que los contiene y vuelven a su condición extracelular. De nuevo son fagocitados por otro macrófago espumoso, al cual destruirán, o por un macrófago atraído por las quimiocinas del macrófago en el cual se ha producido la multiplicación. Esta célula presentará nuevamente antígenos procedentes de la multiplicación del bacilo que tendrán que ser identificados por linfocitos específicos, que en su camino se encontrarán con tantos otros macrófagos espumosos parcialmente activados que suprimirán su capacidad de reconocimiento transitoriamente. Por ello en el ratón se genera un segundo escenario caracterizado por la aparición de grandes espacios alveolares repletos de macrófagos espumosos destruidos o en vías de destrucción dónde se multiplican los bacilos, rodeados de tabiques epiteliales engrosados por fibras de colágeno y linfocitos. Esta reacción de contención, generada proximalmente al núcleo granulomatoso inicial, es tardía y no impide la perpetuación de la invasión de los espacios alveolares a nivel distal. Todos estos procesos explican por qué al medir el área del parénquima afectado por las lesiones granulomatosas y estudiar la proporción entre el área afectado y el global, los valores dibujan un crecimiento aritmético progresivo.²⁰De este modo, la falta de correlación entre la evolución de los valores de la concentración bacilar y los de la ocupación parenquimatosa no hacen sino reflejar el hecho de que el ratón desarrolla una respuesta inmune dirigida contra los bacilos en crecimiento, no contra los bacilos en fase latente.¿Por qué nos empeñamos en reproducir la estrategia errónea del ratón en el diseño de futuras vacunas contra la tuberculosis
Llegados a este punto, el enunciado de este apartado ha de parecer claro y diáfano ante el lector atento. Las vacunas actuales contra la tuberculosis se basan en el principio observado en el modelo del ratón, de seleccionar a los péptidos secretados en crecimiento exponencial para generar una respuesta de tipo Th1. Actualmente los que parecen mejor posicionados para su utilización en ensayos clínicos en seres humanos son los antígenos ESAT 6, CFP10 y el complejo Ag85.²⁸ Los criterios para valorar su eficacia han sido la superación de la eficacia de la vacuna BCG, es decir, la de hacer disminuir más de 1 logaritmo la concentración bacilar máxima en el pulmón 3 semanas posinfección. En ningún momento se ha valorado la cronificación de esta infección, a todas luces enlentecida mediante la inducción prematura de la inmunidad, pero sin duda alguna presente, tarde o temprano. En realidad, recientemente Orme²⁹ ha llegado a plantear la imposibilidad de la obtención de una vacuna en la cual se evite por completo la implantación de un cierto grado de infección latente.Por otra parte, afortunadamente, la respuesta en el ser humano es mucho más agresiva. Tal como he planteado previamente, el hombre parece tener un umbral más bajo de tolerancia ante endotoxinas como el LAM. Por ello suponemos que en las fases más iniciales de la infección, cuando la concentración bacilar llega a cierto nivel, se genera necrosis intragranulomatosa y con ella gran reacción inflamatoria y un proceso de fibrosis importante que permite mejor control físico de la focos infectivos. Tal como hemos apuntado, el mayor volumen parenquimatoso hace posible el desarrollo de este tipo de reacciones inflamatorias agresivas contra la propia integridad física, por cuanto no representan un riesgo importante para la vida del hospedador como podría significar en organismos más pequeños como los ratones. Igualmente, los seres humanos también desarrollamos una respuesta humoral muy importante contra M. tuberculosis, hecho que facilita su opsonización, su mejor fagocitosis y destrucción.²⁹ ¿Por qué se genera este tipo de respuesta, cuando en el ratón es apenas perceptible Indudablemente el presentar una incipiente población bacilar extracelular generada con la necrosis intragranulomatosa puede favorecer el proceso. De todas maneras, según nuestra experiencia, esta respuesta se pone de manifiesto en el ratón en estados muy avanzados de la infección, probablemente cuando la contención de la población extracelular alveolar ya es prácticamente imposible mediante una respuesta de tipo celular.Sea como fuere, la persistencia de M. tuberculosis en los tejidos humanos es una realidad. En este sentido, salvando las distancias, no es descabellado suponer que lo que sucede en el modelo del ratón no tenga relación con el hombre, en el período previo a la fibrosis definitiva del granuloma. Por ello, es probable que, con la adquisición de la inmunidad, también se genere una población bacilar resistente a los mecanismos de estrés bacteriano provocados por los macrófagos activados, y con ello una proporción de bacilos que pasen desapercibidos ante las células del sistema inmune, por cuando al no estar en crecimiento continuo no generan los antígenos reconocidos por este.La utilización de una vacuna inmunoterapéutica, base para la destrucción del bacilo latente
Por todas estas razones, hace ya bastante tiempo que nuestro grupo está trabajando en el diseño de una vacuna para ayudar al sistema inmune en la identificación del bacilo latente. Esta vacuna actuaría como complemento de la inmunidad inducida por la propia infección por M. tuberculosis, por cuanto incluiría una serie de antígenos presentes en el bacilo en estado latente. La vacuna deberá ser necesariamente poliantigénica, para incrementar la probabilidad de encontrar un pequeño número de bacilos, y tendrá que estimular no sólo la inmunidad celular de tipo Th1, sino que deberá potenciar la Th2 para generar anticuerpos que permitan facilitar la fagocitosis de los bacilos extracelulares y su posterior destrucción. Este hecho también tiene que favorecer la identificación de estos bacilos en los pequeños espacios inmunodeprimidos generados en la "segunda" corona por los macrófagos espumosos y en todo caso en la importante población bacilar extracelular generada con la necrosis intragranulomatosa en la tuberculosis humana. Finalmente, pienso que es un error la búsqueda de una vacuna que evite necesariamente la generación de la hipersensibilidad retardada, puesto que debe entenderse como un mecanismo de defensa más, no como la responsable de la necrosis intragranulomatosa, y por que limita extraordinariamente la utilización de muchos de los péptidos que posibilitan la destrucción del bacilo latente.Por ello es importante considerar la posibilidad de incluir estos péptidos no sólo para conseguir una vacuna inmunoterapéutica para disminuir el periodo de tratamiento antibiótico de la infección latente y de la enfermedad, sino para el diseño de una vacuna profiláctica. De esta manera, no sólo se enlentecería la implantación de cierto grado de infección latente sino que se evitaría por completo.

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