The transcervical collection of fetal cells for early and minimally invasive prenatal diagnosis

Abstract
In the last decade, many studies have documented the presence of fetal cells in samples collected transcervically in early pregnancy. Since fetal cells are present in these samples as early as 7 weeks\' gestation, and some of the methods for sample collection (i.e. mucus collection) appear absolutely non-invasive, this approach is regarded as an earlier and safer alternative to all the techniques currently used for prenatal genetic diagnosis. Our studies in this field have contributed to assess the efficacy of different methods for the collection and analysis of transcervical cell samples; all in all it seems that intrauterine lavage the only valuable option, since fetal cells are present in most samples and at a very high rate. In addition, our experience shows that fetal cells in these samples can be reliably identified, sorted under microscope, and then analysed by many different procedures among which QF-PCR is probably the most promising; indeed, this latter technique enables the rapid and simultaneous assessment of the chromosomes most commonly involved in aneuploidies. Further work is required to assess the impact of transcervical cell sampling, and notably of intrauterine lavage, in continuing pregnancies before the possible clinical use of these techniques.

Key words
Células transcervicales, diagnóstico no invasivo, prenatal, FISH, PCR, reacción de cadena de polimerasa

Artículo completo

Estudios recientes han despertado gran interés ante la posibilidad de llegar al diagnóstico genético prenatal mediante procedimientos no invasivos¹ que podrían reemplazar la amniocentesis y la obtención de material de las vellosidades coriónicas (MVC), las cuales causan un pequeño pero significativo riesgo de pérdida del embarazo. Estos métodos alternativos incluyen la obtención y aislamiento de células fetales de la circulación materna y la toma de muestras de células transcervicales (CTC). La presencia de varias subpoblaciones diferentes de células fetales en la circulación materna ha sido bien documentada, pero lamentablemente su número parece ser bajo;² además, se requieren complejos métodos de separación celular para eliminar el exceso abrumador de células contaminantes provenientes de la madre. Aunque este fenómeno precisa estudios más amplios para comprender su importancia biológica, el interés de los investigadores en ese campo se ha desplazado actualmente de las potenciales implicaciones para el diagnóstico prenatal a la detección de estas células y de ADN fetal libre de las células en la sangre materna en vista del posible uso como marcador de placenta defectuosa y las complicaciones derivadas del embarazo.³

El primer estudio sobre la presencia de células fetales en muestras obtenidas del cuello uterino de mujeres embarazadas data de antes del año 1970, ⁴ pero es apenas en la década de 1990 que la información se concentró sobre este aspecto a partir del advenimiento de procedimientos más precisos de análisis molecular tales como la reacción de cadena de polimerasa (PCR) y los ensayos de hibridación fluorescente in situ (FISH). Cuando iniciamos nuestras experiencias sobre material celular transcervical (CTC) en 1998, la mayoría de los estudios disponibles habían documentado ya la presencia de células fetales en las secreciones con CTC, pero aun había discusión sobre los métodos ideales tanto para la recolección de la muestra como para el análisis. ⁵ Dentro de este contexto, el objetivo de nuestro estudio fue primero y principal conseguir extensas series de CTC para permitir comparaciones apropiadas y confiables entre estos métodos, debido a que sentíamos que un tamaño pequeño de la muestra había sido la limitación mayor de la generalidad de los estudios anteriores disponibles.

Primero analizamos el lavado intrauterino en 87 mujeres con indicación terapéutica de interrumpir sus embarazos. El lavado se realiza por medio de un catéter insertado a través del cuello, que atraviesa el orificio cervical interno; esta técnica, que supone todavía cierto grado de invasividad, probó realmente ser muy eficaz para conseguir células fetales con alto rédito, y sería posible con ensayos de PCR y FISH rectificar la información sobre el sexo del feto en el 87% y 90% respectivamente. ⁶ Tal como la mayoría de los estudios anteriores, nuestra investigación tuvo una limitación en el enfoque usado para el análisis de las CTC, ya que las muestras contenían también células maternas en una proporción variable e impredecible; como una situación de hecho, con los análisis de FISH y PCR pudimos identificar directamente la presencia de células fetales en la muestra detectando el material derivado sólo del cromosoma Y en embarazos con feto masculino, pero no conseguimos discriminar verdaderamente entre las células maternas y las de fetos femeninos. Independientemente, nuestros hallazgos fueron importantes porque demostraron que las células fetales estaban presentes en la enorme mayoría de las muestras de CTC de embarazos masculinos y con una frecuencia muy elevada (valor medio 45%), sugiriendo claramente la utilidad de la técnica en la práctica clínica.

Partiendo de estas premisas, continuamos la obtención de muestras de lavado intrauterino intentando la determinación microscópica de elementos fetales dentro de un espécimen fresco y luego realizando análisis cuantitativo de fluorescencia PCR (QF-PCR) ⁷ además de la PCR tradicional y los métodos FISH. Nuestro ensayo QF-PCR involucró el empleo de dos marcadores de secuencias cortas repetitivas para cromosoma 21. La presencia de ADN fetal en especímenes de lavado fue documentada por la detección de picos paternos además de alelos maternos. y es de notar que en algunos casos pudo ser demostrada independientemente del sexo del feto. Esta metodología resultó verdaderamente exitosa, dado que los filamentos de las vellosidades coriónicas o las pinzas celulares de origen trofoblástico pudieron ser aisladas en casi el 90% de los casos, y los ensayos de QF-PCR revelaron la presencia de picos paternos en el 61% de las muestras microprocesadas con contaminación mínima, cuando la hubo, por células maternas. En una derivación de los experimentos, llevada a cabo en colaboración con el Profesor Matteo Adinolfi (Londres, UK), Judith Bulmer (Newcastle-upon-Tyne, UK) y un grupo de biólogos españoles, las muestras de lavado intrauterino fueron inmunomarcadas con un panel de anticuerpos monoclonales específicos para diferentes subpoblaciones celulares, incluyendo anticuerpo anti HLA-G G233. ⁸ Grupos de citotrofoblastos HLA-G positivos, así como células sinciciales y maternas, fueron entonces recolectadas empleando microdisección láser y analizadas por QF-PCR mediante marcadores de secuencias cortas repetidas para los cromosomas 21, 18 y 13 más amelogenina para el sexo. Aproximadamente el 50% de las muestras evidenció citotrofoblastos positivos para HLA-G; con relación a este elemento, la discrepancia aparente con los resultados obtenidos con FISH y los procedimientos basados en la PCR puede ser atribuida a la sensibilidad inferior de la técnica inmunohistoquímica. La experiencia con microdisección láser de las células marcadas, pese a ser indispensable profundizar la investigación en series más amplias, reveló que esta conducta es posible y podría ser utilizada para aislar de manera inocua células fetales libres de los contaminantes maternos.

Entre las posibles técnicas para la obtención de CTC (cepillado para la recolección de mucus, aspiración, lavado endocervical e intrauterino), nuestro interés se orientó en primer lugar hacia el último, ya que tanto la literatura científica como nuestra propia experiencia parecían demostrar que las células fetales estaban presentes sólo en baja proporción de especímenes recuperados con los otros métodos; ⁹ más aún, solamente el lavado intrauterino podía ser considerado como técnica de cierto valor clínico en términos de consecuencias sobre el diagnóstico prenatal. Sin embargo, decidimos efectuar un estudio de tamaño considerable sobre las muestras recolectadas de mucus por cepillado para develar la controversia; ¹⁰ en ese ensayo, las células fetales pudieron ser halladas en sólo 20% a 30% de las muestras de mucus tratadas con diferentes procedimientos de laboratorio y analizadas con FISH y PCR. Estos resultados son trascendentes en lo que se refiere a las consecuencias biológicas, en que las células fetales detectadas a nivel del orificio cervical externo resultan más comúnmente de una pérdida espontánea, cuya importancia se desconoce; pero antes de implementar alguna técnica para su uso en la práctica clínica, la recuperación de células fetales debe lograrse con regularidad y de manera confiable.

En conclusión, en nuestra experiencia de 5 años con CTC hemos realizado una contribución importante al conocimiento en este campo, demostrando que el lavado intrauterino exclusivo puede considerarse una herramienta promisoria y estimable para el diagnóstico prenatal no invasivo o mínimamente invasivo; de hecho, la mayoría de las muestras de lavado contienen células fetales que pueden ser reconocidas rápidamente, clasificadas sin dificultad en el microscopio y entonces analizadas para identificar aneuploidías comunes. Las células fetales han sido identificadas en los especímenes celulares transcervicales a las 7 semanas de gestación; su uso permitiría un diagnóstico genético prenatal muy temprano. No obstante, hay aspectos que requieren mayor consideración y estudio. Primero y principal, el escaso riesgo del lavado intrauterino debe ser evaluado precisamente en un número extenso de embarazos en curso; al momento actual, sólo existe experiencia muy limitada con procedimientos de muestras de CTC en mujeres no programadas para la interrupción de su embarazo, y a pesar de que algunos ensayos han fracasado en demostrar daño sobre él,^11,12 todavía existe preocupación acerca de las técnicas de lavados y el riesgo de infección. Sería útil también para comprender en su totalidad el proceso por el cual los trofoblastos están presentes en el cérvix y el polo uterino inferior. Podría ser el resultado de una migración, ya que los trofoblastos tienen naturaleza invasiva que podría hacerlos cruzar la membrana que envuelve la decidua capsularis, pero ha sido cuestionado que el lavado intrauterino pueda actuar como una suerte de biopsia placentaria, manteniendo así cierto grado de invasividad.

Nuestro próximo trabajo sobre CTC comprende los aspectos ya mencionados. Ante todo estamos planificando llevar adelante nuestra investigación sobre mujeres en lista para la interrupción del embarazo; no obstante, las tomas de CTC se realizarían al momento de registrarse para el procedimiento y no inmediatamente antes del mismo: esto permitiría monitorear todas las posibles complicaciones relacionadas con la toma de CTC (sangrado, infecciones, contracciones, etc.) en el intervalo de 1-2 semanas que se requiere normalmente entre el momento del registro y la terminación del embarazo. Si ese corto período de seguimiento muestra resultados mejores, entonces comenzaremos a efectuar tomas de CTC en embarazos en curso, un paso esencial hacia el posible uso clínico de este procedimiento.

Además, en el intento de evaluar finalmente la eficacia de diversos métodos para la toma de material para CTC, hemos recolectado mucus y especímenes de lavado intrauterino en la misma mujer, ya que no es quizás apropiado comparar los resultados informados en estudios que incluían diferentes grupos de individuos.

Con respecto a los métodos de laboratorio y análisis, nos encontramos actualmente realizando el ensayo QF-PCR sobre todas nuestras muestras de lavados: éstas son microprocesadas para una suerte de elementos trofoblásticos. Los resultados de nuestras experiencias con QF-PCR sugerirían que los criterios adoptados para la clasificación celular son correctos, ya que los picos paternos son comúnmente identificados; por otro lado, también sugieren que, con microprocesamiento, el problema de la contaminación materna puede ser soslayado. El análisis FISH todavía se realiza en muestras no microprocesadas, esto es, sin tejido trofoblástico evidente para aislar; verdaderamente, nosotros encontramos que algunas muestras negativas para trofoblastos en el microscopio podrían contener algunas células fetales detectables con FISH. Otra rama de nuestros experimentos involucra un abordaje de dos pasos para la detección de células fetales dentro de una muestra: en el primer estadio, se emplea inmunohistoquímica con anticuerpos monoclonales para el trofoblasto para las células blanco fetales; luego, el ensayo FISH puede favorecer la enumeración de los cromosomas. Como una cuestión de hecho, este enfoque no precisa microprocesamiento de las muestras, ya que las células fetales, tanto de concepciones masculinas como femeninas, estarían marcadas y por lo tanto serían sencillamente reconocidas.

Por último, será útil definir y optimizar la técnica para la recolección del espécimen: con relación a esto, el análisis estadístico de nuestros datos, obtenidos de una extensa población, ayudará a definir las características maternas, obstétricas y demográficas que influyen en el descenso de las células fetales, y podrían además aportar información importante sobre el momento ideal para la obtención del material con CTC.

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