EXPERIMENTAL SUBCHRONIC MYCOTOXICOSES IN RATS: TOXIC EFFECTS INDUCED BY FUMONISIN B1 (FB1), AFLATOXIN B1 (AFB), AND BY A FB1-AFB1 MIXTURE.

Abstract
Maize co-contamination with aflatoxin B1 (AFB1) and fumonisin B1 (FB1) is frequently found in the nature. Although the alterations induced by these mycotoxins when administered individually to laboratory animals are rather characterized, little is known about the effects produced by AFB1+FB1 mixtures. We have observed some nutritional and immunobiological alterations induced in rats intoxicated for 90 days with a control diet, with a diet containing 40 ppb of AFB1, with 100 ppm of FB1, and with a diet containing 40 ppb of AFB1+100 ppm of FB1. Additionally, we observed some toxic effects induced on spleen mononuclear cells (SMC) and adherent peritoneal cells (APC) coming from normal rats, exposed in vitro to both toxins individually or as a mixture. In the AFB1+FB1-fed rats, the main histopathologic changes were found in liver, kidney, small intestine and lung. Besides, in SMC coming from these animals, alterations in the ConA-stimulated proliferation; as well as in the IL-2, IL-4 and IL-10 synthesis were observed. When stimulated with phorbol 12-myristate 13-acetate, the APC coming from AFB1+FB1-intoxicated rats released higher levels of H2O2. These results demonstrate different nutritional and immunobiological changes induced by the AFB1+FB1 mixture, compared to those induced by both toxins individually administered

Key words
Micotoxinas, fumonisina B1, aflatoxina B1, micotoxicosis

Artículo completo

Las micotoxinas son metabolitos secundarios sintetizados por algunos hongos filamentosos luego de su fase de crecimiento exponencial (Calvo y col., 2002). Entre los hongos toxicogénicos, algunas especies de los géneros Aspergillus, Penicillium, Fusarium y Alternaria son las principales productoras de toxinas (Hocking AD, 1997; Pitt JI, 1997; Bullerman LB, 1997). Estos hongos pueden crecer y sintetizar micotoxinas sobre materias primas o alimentos elaborados y, en consecuencia, la principal vía de intoxicación de animales y humanos es a través del consumo de alimentos contaminados con estas sustancias (Atroshi y col., 2002). La naturaleza química de las micotoxinas es muy diversa, lo que les confiere diferentes propiedades físicas, químicas y biológicas, y distintas estabilidades frente a diversos métodos de descontaminación. En términos generales, los procesos tecnológicos utilizados en la actualidad para la producción de alimentos elaborados logran reducir sólo parcialmente los niveles de micotoxinas encontradas en las materias primas, formándose en algunos casos compuestos que presentan mayor toxicidad (Bullerman y col., 2002). Aunque existen más de 300 micotoxinas que han sido aisladas y caracterizadas químicamente hasta el presente, las investigaciones se han focalizado en aquellas que producen daño significativo al hombre, sus cosechas, o animales de crianza. Estas incluyen aflatoxinas, fumonisinas, ocratoxinas, tricotecenos y zearalenona (Hussein y col., 2001).

Las enfermedades causadas por el ingreso de micotoxinas en animales y humanos se conocen bajo el nombre de micotoxicosis; están caracterizadas como enfermedades trasmitidas por alimentos, no contagiosas, no transferibles, no infecciosas y no atribuibles a otros microorganismos que no sean hongos. Los factores que afectan la magnitud de la toxicidad en seres humanos y animales que consumen alimentos contaminados con micotoxinas incluyen especie, sexo, mecanismo y modo de acción de las toxinas, metabolismo y sistemas de defensa del organismo afectado (Hengstler y col., 1999; Voss y col., 1996). En función de las dosis y tiempos de exposición, las micotoxicosis pueden clasificarse en agudas (pueden producir la muerte del organismo afectado en el término de pocas horas), subcrónicas y crónicas. La exposición crónica a bajas dosis de micotoxinas representa, posiblemente, el principal problema causado por estas sustancias sobre la salud de animales y seres humanos (International Programme on Chemical Safety. JECFA Monographs and Evaluations, 2001; IPCS-WHO Food Additives Series, 1998).

Los cereales, especialmente el maíz y alimentos derivados, pueden constituir una importante fuente de ingreso de micotoxinas con la dieta. Los mohos toxicogénicos pueden comportarse como endofitos, e infectar tempranamente a los cereales durante su cultivo en el campo o durante su almacenamiento. Desde el punto de vista toxicológico, la infecciones del maíz por los géneros Fusarium spp (desde el comienzo del desarrollo del cultivo en el campo) y Aspergillus spp (principalmente durante las últimas etapas del cultivo y durante el almacenamiento de los granos) adquieren la mayor importancia en la salud humana y animal. F. verticillioides, uno de los principales productores de FB1, y A. flavus, uno de los principales productores de AFB1, son especies frecuentemente encontradas como co-contaminantes de maíz (Etcheverry y col., 1999; Ali y col., 1998; Dalcero y col., 1997). Consecuentemente, el consumo de maíz y alimentos derivados por animales y humanos se encuentra asociado, fundamentalmente, con micotoxicosis producidas por mezclas de FB1 y AFB1. En este sentido, en ciertas áreas de África y China se ha establecido una relación entre la alta incidencia de cáncer de esófago e hígado observados en la población, y el consumo de maíz y productos derivados contaminados con altos niveles de FB1 y AFB1 (Pitt, 2000).En 1993, la Agencia Internacional para la Investigación del Cáncer de la OMS (WHO-IARC) evaluó el potencial carcinogénico de AFB1. Esta micotoxina fue clasificada como carcinógeno para el hombre (grupo 1) y las fumonisinas fueron clasificadas como posibles carcinógenos (grupo 2B) (International Agency for Research in Cancer, 1993a,b). Luego del descubrimiento y caracterización química de FB1 y AFB1, se han desarrollado numerosos estudios para evaluar los efectos tóxicos inducidos por estas toxinas individualmente, en diferentes modelos de intoxicación aguda, subcrónica o crónica. A pesar de ello, las alteraciones producidas por el consumo de mezclas de FB1 y AFB1 son sólo parcialmente conocidas (Casado y col., 2001; Theumer y col., 2002; Gelderblom y col, 2002; Theumer y col., 2003). En nuestro grupo de investigación hemos desarrollado un modelo de intoxicación oral subcrónica en ratas administrando las siguientes dietas: alimento libre de micotoxinas (control), con 100 ppm de FB1 (FB1), con 40 ppb de AFB1 (AFB1), y con mezclas de 100 ppm de FB1 + 40 ppb de AFB1 (M), para evaluar la toxicidad producida a nivel sistémico y sobre componentes del sistema inmunológico. En el siguiente gráfico se encuentra resumido el modelo experimental utilizado para los estudios de toxicidad in vivo.

Para los estudios de toxicidad in vitro , se obtuvieron CMB y CPA de ratas normales, que posteriormente fueron cultivadas en medio de cultivo (control); o expuestas a 20 µM de AFB1 (AFB1), 10 µM de FB1 (FB1), y 20 µM de AFB1 + 10 µM de FB1 (M).

En la determinación de parámetros nutricionales durante el esquema experimental (figura 1), a los 90 días se observó menor consumo de alimentos, ganancia de peso corporal y peso corporal en los animales alimentados con FB1. En ratas que consumieron AFB1 se registraron mayor ganancia de peso en el día 30; y mayores pesos corporales a los 30, 60 y 90 días de alimentación. Por otro lado, en ratas alimentadas con M se observaron disminución de la ganancia de peso a los 30 días de alimentación, y menores pesos corporales a los 30, 60 y 90 días del esquema.

Figura 1. Determinación de parámetros nutricionales de animales alimentados con diversas dietas: libre de micotoxinas (control), con 100 ppm de FB1 (FB1), con 40 ppb de AFB1 (AFB1), y con una mezcla de con 100 ppm de FB1 + 40 ppb de AFB1 (M). El consumo de alimentos (gramos), el peso corporal (gramos) y la ganancia de peso corporal (gramos) fueron registrados a los 30, 60 y 90 días de intoxicación. Los resultados fueron analizados mediante análisis de varianza de una vía (ANOVA). *, p < 0.05; **, p < 0.01; ***, p < 0.001 con respecto a los animales que consumieron la dieta libre de micotoxinas.

En el estudio de los parámetros bioquímicos, al final del esquema de intoxicación se observaron disminución de los niveles séricos de triglicéridos y aumento de la actividad fosfatasa alcalina (FAL) en animales alimentados con FB1, mientras que la actividad FAL estuvo disminuida en animales alimentados con AFB1.

Figura 2. Examen histopatológico de muestras de órganos de animales intoxicados con 100 ppm de FB1 durante 90 días. En riñón, apoptosis de células tubulares (A) (400x) y engrosamiento del espacio urinario (B) (100x) fueron las principales alteraciones encontradas. En hígado se observaron infiltrados histiocíticos perivasculares (flecha), y cambios en la arquitectura normal (C) (100x). En intestino delgado, el principal hallazgo fue la presencia de infiltrados linfocíticos (vellocitis) (D) (200x).

El estudio histopatológico en animales alimentados con FB1 (figura 2) mostró que las principales alteraciones se registraban en el riñón (necrosis y apoptosis de células tubulares, figura 2A; aumento del espacio urinario, figura 2B), hígado (cambios en la arquitectura normal e infiltrados histiocíticos perivasculares, figura 2C) e intestino delgado (vellocitis, figura 2D), en tanto que el riñón (aumento del espacio urinario) y los pulmones (apoptosis y engrosamiento de las paredes alveolares) fueron los órganos principalmente afectados en animales que consumieron AFB1. En los animales intoxicados con M, el hígado fue el órgano que presentó las mayores alteraciones, observándose alto número de células en distintas fases de mitosis y células apoptóticas. En estos animales, el riñón y el intestino delgado también estuvieron afectados, aunque en menor grado que el hígado. La presencia de apoptosis en células renales, hepáticas y pulmonares fue confirmada posteriormente mediante de la técnica de Tunel.

Tabla 1. Resumen de los datos obtenidos en el estudio de la funcionalidad de células mononucleares de bazo (CMB) y células peritoneales adherentes (CPA) expuestas a fumonisina B1 (FB1), aflatoxina B1 (AFB1), y a una mezcla de FB1 + AFB1 (M).



^a, Para los ensayos in vivo se utilizaron células de ratas intoxicadas durante 90 días con las dietas conteniendo micotoxinas; mientras que para los estudios in vitro se obtuvieron células de ratas normales y posteriormente fueron cultivadas en presencia de FB1, AFB1 y M. Los datos están expresados como aumento (↑), disminución (↓), o ausencia de cambios (≈) estadísticamente significativos con respecto a los controles.
^b, Proliferación de CMB estimuladas con concanavalina A (ConA)
^c, Producción de H₂O² por CPA estimuladas con forbol 12-miristato 13-acetato (PMA).

En la tabla 1 se encuentran resumidas las principales alteraciones inducidas en CMB y CPA expuestas in vivo o in vitro a FB1, AFB1 y M. Las CMB de animales alimentados con FB1 produjeron mayores niveles de IL-4 y menores concentraciones de IL-10. En cultivo, las CMB de ratas intoxicadas con AFB1 proliferaron más que las CMB de ratas control (en estado basal o en presencia de concanavalina A [ConA]), y produjeron menores concentraciones de IL-2 y mayores niveles de IL-4. En el grupo de animales alimentados con M, las CMB produjeron en cultivo mayores niveles de IL-4 y menores cantidades de IL-10.En estudios in vitro , CMB provenientes de ratas normales expuestas a FB1 tuvieron mayor proliferación cuando fueron estimuladas con Con-A, mientras que liberaron menores cantidades de IL-2. Cuando estas CMB de ratas normales fueron cultivadas en presencia de AFB1, presentaron menor proliferación frente a Con-A. Por otra parte, cuando las CMB de ratas normales fueron expuestas a M, hubo menor proliferación en presencia de Con-A, menor producción de IL-2 e IL-10, y mayores niveles de IL-4.

Además se evaluó, a través de la producción de peróxido de hidrógeno, la capacidad microbicida y antitumoral de CPA, obtenidas a los 90 días de intoxicación con las diferentes dietas (tabla 1). En presencia del estimulante forbol-miristato-acetato (PMA), hubo menor producción de H₂O₂ en CPA de animales alimentados con AFB1 y FB1, mientras que las CPA de animales intoxicados con M produjeron mayores niveles de H₂O₂ en presencia del estímulo. Cuando se estudiaron los efectos de la exposición in vitro de CPA provenientes de ratas normales frente a las micotoxinas, se observó producción significativamente menor de H₂O₂ en CPA que habían sido expuestas a M y estimuladas con PMA.

En la etapa siguiente se repitió el esquema experimental para obtener, luego de 90 días de intoxicación, distintas muestras biológicas para la posterior evaluación de los efectos producidos por la presencia de AFB1, sobre los niveles de biomarcadores de exposición a FB1. Específicamente, se evaluó en animales alimentados con la dieta control, con FB1 y M, el comportamiento de los niveles de esfinganina (Sa), esfingosina (So), y del ratio esfinganina:esfingosina (Sa:So) en muestras de orina de 24 horas, suero, y en extractos de hígado y riñón. Luego de analizar los resultados observamos que la ingestión de FB1, individualmente o en forma conjunta con AFB1, indujo un desbalance en el metabolismo de los esfingolípidos celulares, con aumento de los niveles de Sa y, en menor grado, de So. Estos cambios se observaron en todas las muestras biológicas estudiadas, aunque los niveles de Sa y So en hígado fueron los más sensiblemente modificados. Con respecto al ratio Sa:So, el consumo de FB1 produjo un aumento en este índice en todas las muestras biológicas analizadas, siendo más importante el incremento registrado en los extractos de hígado y riñón. Finalmente, cuando se administró M, prácticamente en todos los casos, se encontraron mayores niveles de Sa, So y Sa:So, con respecto a la administración de FB1 individualmente. Luego de analizar los resultados obtenidos en la evaluación de los parámetros nutricionales, en este modelo experimental, los principales efectos producidos por AFB1 se desarrollaron durante los primeros treinta días de la intoxicación. Por otro lado, la acción de FB1 sobre estos parámetros fue más leve y, aunque se observó una misma tendencia durante todo el esquema experimental, solamente se obtuvieron resultados significativos a los noventa días de la ingestión de FB1. En el mismo sentido, en los animales alimentados con M se observó un comportamiento más parecido al registrado en los animales que consumieron FB1 pero, a diferencia de este último grupo de animales, en las ratas que consumieron la mezcla de micotoxinas los cambios encontrados fueron estadísticamente significativos desde el primer mes del esquema experimental. En relación a los parámetros nutricionales estudiados, el patrón de cambios encontrados en el grupo intoxicado con M parece responder a un efecto combinado de ambas micotoxinas.

Como se ha mencionado anteriormente, el estudio histopatológico de hígado de ratas intoxicadas en forma subcrónica con M, reveló un alto número de hepatocitos mitóticos y apoptóticos, según se confirmó posteriormente con la reacción de Tunel. En este contexto, la presencia de mitosis, posiblemente como un mecanismo compensador de la pérdida de hepatocitos por apoptosis, aumenta la probabilidad de transformación celular e instalación de procesos neoplásicos a nivel hepático.

Por otra parte, la ingestión subcrónica de FB1, AFB1, y M indujo algunos cambios en la capacidad proliferativa y de producción de citoquinas por CMB, y en la liberación de peróxido de hidrógeno por CPA. Cuando se evaluaron estos parámetros en CMB y CPA de ratas normales expuestas in vitro a las micotoxinas, se obtuvieron resultados que en algunos casos no eran totalmente concordantes con los obtenidos en los estudios in vivo. Posiblemente, en los ensayos in vitro se está evaluando la toxicidad aguda que presentan estas micotoxinas sobre las CMB y las CPA, y esta sea la causa de algunas de las diferencias observadas con los resultados obtenidos luego de la exposición subcrónica.

Si analizamos exclusivamente el comportamiento de los biomarcadores de exposición a FB1, estos resultados pueden sugerir que AFB1 podría estar actuando en forma sinérgica con FB1, o potenciando el desbalance en el metabolismo de esfingolípidos celulares inducidos por el consumo de FB1.

En resumen, los resultados obtenidos en el presente esquema experimental sugieren una acción combinada de AFB1 y FB1 en la producción de los efectos tóxicos. Las alteraciones encontradas en los animales a los que se administraron ambas micotoxinas no pueden ser consideradas la sumatoria de los efectos tóxicos inducidos por AFB1 y FB1 individualmente. Estas observaciones constituyen, por lo tanto, un antecedente importante en el área de la micotoxicología y de la inmunotoxicología, y pone de manifiesto la necesidad de continuar estudiando las interacciones de estos compuestos, y las posibles estrategias tendientes a disminuir el ingreso de micotoxinas en la cadena alimentaria.

Abreviaturas: AFB1: aflatoxina B1; CMB: células mononucleares de bazo; ConA: concanavalina A; CPA: células peritoneales adherentes; Sa: esfinganina; So: esfingosina; PMA: forbol miristato acetato; FAL: fosfatasa alcalina; FB1: fumonisina B1; IL-2: intrleuquina 2; IL-4: interleuquina 4; IL-10: Interleuquina 10.

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