THE EFFECT OF NUTRITIONAL STATUS ON THE LEUCINE REQUIREMENT AND SPLANCHNIC UPTAKE OF LEUCINE IN ADULT INDIAN MEN

Abstract
The current international estimates of indispensable amino acid requirements in adult humans are probably too low. The best method for determining amino acid requirement is by the tracer based estimation of daily amino acid balance at different amino acid intakes. The lowest amino acid intake that supports a neutral amino acid balance is considered to be the minimum daily requirement. The leucine requirement of otherwise healthy, well and undernourished Indian adult males was studied by the 24h tracer balance technique. This technique has been validated for leucine, as its kinetics are well characterized and validated. Twenty subjects in each group were studied at 2 intakes of leucine in a randomized crossover fashion, such that 10 subjects in each group were studied at 4 levels of leucine intake (14, 22, 30 and 40 mg.kg-1.d-1). The splanchnic uptake of leucine was also studied by the administration of oral, deuterated leucine tracer. Linear regression of the leucine balance against intake gave a zero balance intercept at a leucine intake of 37.3 and 39.6 mg.kg-1.d-1 in the well and undernourished subjects respectively. The splanchnic uptake of leucine was 39.8 and 16.5% in the well and undernourished groups respectively. These data show that the current recommended daily intake for leucine, of 14 mg.kg-1.d-1, is too low, and that the actual requirement is about 2.5 times this value. The data also show that the prior nutritional status is not a determinant of the leucine requirement, and that this leucine requirement is applicable globally.

Key words
Desnutrición crónica, requerimiento de leucina, oxidación de aminoácidos, balance de aminoácidos

Artículo completo
Introducción
Las estimaciones actuales de los requerimientos indispensables de aminoácidos (IAA) en seres humanos de distintas edades han sido establecidas en el documento de 1985 del Joint FAO/WHO/UNU Expert Consultation de necesidades de energía y de proteínas.¹ Creciente evidencia indica recomendar, en el caso de personas adultas, que se cumplan las pautas revisadas de ingesta básica de aminoácidos,^2,3 las cuales proponen valores entre 2 y 3 veces más altos que las estimaciones internacionales previas.¹ Las primeras recomendaciones se basaron en los resultados de estudios a corto plazo con marcadores^4,5 y con pérdidas obligadas preestablecidas.² Las mayores demandas IAA fueron consecuencia de modificaciones en el modo de medición de los requerimientos IAA de adultos. El método de estimación de las demandas diarias a partir del balance de nitrógeno es inadecuado⁶ e indujo a recomendaciones diarias IAA para adultos tan bajas que virtualmente podían ser cubiertas con cualquier tipo de dieta. De hecho, la calidad proteica de la dieta en este caso podría tener pocas consecuencias prácticas en la nutrición proteica de seres humanos adultos. El método actual preferido para estimar los requerimientos IAA es la determinación del balance diario de aminoácidos (ingesta de 24 horas - oxidación irreversible de 24 horas) con el uso de un isótopo estable a distintos niveles de aminoácidos en la dieta. El nivel mínimo de incorporación de aminoácidos que se asocia con un balance cero se considera la demanda mínima diaria. Un requisito importante de este procedimiento consiste en la determinación precisa del índice de oxidación de aminoácidos que, por su parte, necesita la medición exacta del enriquecimiento isotópico del conjunto, sustrato de oxidación. Este parámetro es difícil de establecer para la mayoría de los aminoácidos, con excepción de leucina⁷ y probablemente metionina⁸ La cinética de la leucina se conoce bien⁹ y el método del balance de 24 horas ha sido validado.¹⁰ Los primeros estudios de balance con marcadores mostraron que el requerimiento diario de leucina era superior a los 14 mg kg^-1 d^-1 establecidos en 1985 por la FAO/WHO/UNU³ y alcanzaba a 40 mg kg^-1 d^-1 aproximadamente.^4,5 Uno de los argumentos en contra de los estudios de oxidación de aminoácidos aduce que éstos se realizan en pocas horas, con extrapolación de los valores a las 24 horas; es posible que las variaciones en la velocidad de oxidación de leucina en distintos momentos del día compliquen la extrapolación. Un avance importante en este contexto se debe al grupo de Young, mediante el uso de un protocolo de balance del marcador de 24 horas luego de la adaptación de los individuos a sus dietas experimentales (o niveles de prueba de ingesta de aminoácidos) en una semana.^10,11 Estos estudios directos de balance de 24 horas (24 h DAAB) sobre las necesidades de leucina confirmaron que éstas son casi tres veces más altas que las estimaciones actualmente vigentes.¹ Los hallazgos de requerimientos mayores en hombres jóvenes sanos de Norteamérica no fueron confirmados en otras poblaciones del mundo. Este punto es particularmente importante en los países en vías de desarrollo, en los cuales es posible que existan adaptaciones a una ingesta de leucina o de proteínas inferior a la normal y, por lo tanto, reducción de los requerimientos diarios de leucina. Decidimos evaluar las demandas diarias de leucina en la población de la India mediante la técnica de 24 h DAAB con el uso de mezclas de L-aminoácidos asociadas con niveles graduados de incorporación de leucina luego de un período de adaptación de una semana.¹² Es importante tener en cuenta que aproximadamente el 50% de la población adulta de la India tiene alimentación inadecuada crónica cuando se emplea el índice de masa corporal (IMC, kg m^-2) estándar de 18.5 kg m^-2 como valor de corte.¹³ Por este motivo, se llevó a cabo un estudio adicional para determinar las demandas diarias de leucina en varones jóvenes mal alimentados en forma crónica, también con la aplicación de la técnica de 24 h DAAB.¹⁴ En este artículo, comentamos y resumimos los resultados de estos dos estudios originales.^12,14 Métodos
Se incluyeron 20 adultos jóvenes saludables y bien alimentados y 20 hombres con alimentación deficiente. Los primeros se reclutaron de la población de estudiantes del St John\'s Medical College de Bangalore, mientras que los segundos eran individuos de los barrios pobres de la misma ciudad. Las características físicas de los participantes se muestran en la tabla 1.

Pueden observarse diferencias considerables en los sujetos de ambos grupos en términos de talla, peso, IMC, masa grasa corporal y masa magra (FFM). La ingesta diaria habitual de proteínas de las personas del segundo grupo es más baja que la de los hombres bien nutridos (0.8 y 1 g kg^-1 d^-1 en personas con alimentación deficiente y buena alimentación, respectivamente). A cada participante se le explicó el propósito del estudio y los posibles riesgos, y se obtuvo el consentimiento escrito de cada uno de ellos. El Human Ethical Approval Committee del St. John\'s Medical College aprobó el protocolo de la investigación. El primer día de la fase de alimentación del experimento se efectuaron las mediciones antropométricas y del pliegue cutáneo. La sumatoria de 4 pliegues¹⁵ se utilizó para estimar la densidad corporal, a partir de la cual se determinó el porcentaje corporal de grasa.¹⁶ El experimento con el marcador se realizó luego de un período de 6 días de alimentación con un particular nivel de leucina en la dieta. Por ende, cada participante fue evaluado en dos períodos dietéticos separados, aleatoriamente asignados, durante los cuales recibieron alimentación para mantener el peso, en base a una mezcla de L-aminoácidos (tabla 2). Los cuatro niveles de ingesta diaria de leucina durante los respectivos momentos del estudio fueron de 14, 22, 30 y 40 mg kg^-1 d^-1 (tabla 2). Tabla 2Se estableció una ingesta energética diaria destinada a mantener el peso corporal; las demandas de energía se calcularon cercanas a 1.6 x BMR desde el primero al sexto día y de 1.35 x BMR aproximadamente al séptimo día (día del estudio con el marcador). Se alentó a los participantes a mantener el nivel acostumbrado de actividad física y abstenerse de realizar ejercicio físico intenso. El aporte energético se proporcionó mediante una fórmula de azúcar y aceite, y de galletas de almidón de trigo libres de proteínas. De esta forma, el contenido de grasa y de hidratos de carbono de la dieta fue de alrededor de 43% y 56%, respectivamente. El resto de los nutrientes se administraron en cantidades adecuadas. Con la finalidad de lograr bajo contenido de ¹³C en la dieta y una cantidad relativamente estable basal en el ¹³CO₂ de la respiración a lo largo del período de estudio de 24 horas, la única fuente de carbohidratos fue remolacha y almidón de trigo. En todos los casos, se corrigió la cantidad de ¹³CO₂ en aire espirado durante los experimentos con el marcador para representar los pequeños cambios en la eliminación basal de ¹³CO₂ que podrían haber ocurrido sin el marcador de ¹³C-leucina, mediante la infusión de placebo. Al final de la dieta experimental se realizó una infusión de 24 horas de¹³C-leucina. La brecha entre las sucesivas fases del experimento, o sea entre la primera y segunda dieta, fue de 1 a 4 semanas. Durante este intervalo los participantes consumieron sus dietas habituales. Se utilizó el abordaje de infusión del marcador luego de un diseño estándar en todos los sujetos. La administración del marcador se inició a las 18:00 del sexto día y duró hasta las 18:00 del día siguiente. La última comida del primer día de infusión se había efectuado a las 15:00. A intervalos de una hora, los individuos recibieron 10 pequeñas comidas isoenergéticas e isonitrogenadas desde las 06:00 hasta las 15:00 (equivalente a la ingesta dietética de 24 horas para ese día). Con la misma frecuencia se efectuó calorimetría indirecta y cada media hora se tomaron muestras de sangre para la determinación de ¹³C-ácido α-ceto-isocaproico (KIC). Durante las 24 horas del estudio, los sujetos permanecieron en posición reclinada, excepto durante las horas de sueño. La administración intravenosa de 1-¹³C-leucina (99.3 átomos%; MassTrace, Woburn, MA) se realizó a un índice de aproximadamente 2.8 µmol kg^-1 h^-1, la concentración del isótopo cebador fue cercana a los 4.2 µmol kg^-1. El bicarbonato se administró por vía intravenosa, con 0.8 µmol kg^-1 de ¹³C-bicarbonato de sodio (99.9 átomos%; MassTrace, Woburn, MA). En los participantes que recibieron el nivel más alto de leucina (40 mg kg^-1 d^-1; n = 10), la captación esplácnica de leucina se determinó con la administración oral simultánea intermitente (cada hora) de ²H₃-leucina en dosis de 2.8 µmol kg^-1 h^-1 a una concentración de aproximadamente 4.2 µmol kg^-1. Los ensayos espectrométricos de masa para leucina y KIC en plasma se efectuaron en forma convencional;¹² la oxidación de leucina (µM kg^-1 30 min^-1) se calculó a intervalos consecutivos de media hora¹² como la relación entre el índice de producción de ¹³CO₂ (µM kg^-1 30 min^-1) y la cantidad plasmática de ¹³C-KIC (porcentaje de exceso de mol) en ese momento. El balance de leucina (mg kg^-1 d^-1) se calculó como la diferencia entre la incorporación de leucina (leucina de la dieta + marcador intravenoso) menos la eliminación de leucina (sumatoria de la oxidación de leucina a intervalos de una hora). La captación esplácnica de leucina se calculó para 12 horas en estado de ayuno y de alimentación con la siguiente fórmula:¹²

En esta fórmula, el enriquecimiento se refiere a la concentración plasmática promedio de las doce horas de ayuno y de alimentación, corregidas según el índice de infusión del marcador. Los datos se expresan como media ± desvío estándar. Para cada estudio, las variables metabólicas se analizaron con análisis de varianza con modelos mixtos que incluyeron el período de dieta y la ingesta de leucina. Cuando se registró un efecto significativo de la incorporación de leucina, en la comparación se utilizaron modelos opuestos. El punto de equilibrio cero de leucina se determinó a partir del mejor modelo lineal de balance con la ingesta de leucina; el intervalo de confianza del 95% (IC 95%) se calculó mediante el método Fieller. La captación esplácnica de leucina se estimó sólo en los individuos que recibieron 40 mg kg^-1 d^-1 de leucina mediante ANOVA. Se consideró significativo un valor de p de 0.05. Se combinaron los resultados de los dos estudios con la finalidad de comparar el balance de leucina y la captación esplácnica de leucina entre los sujetos bien alimentados y aquellos con alimentación inadecuada, y de evaluar la relación entre la captación visceral de leucina y el IMC. El balance de leucina y la captación esplácnica se analizaron con modelos mixtos de varianza y con ANOVA, respectivamente. En cada modelo se incluyeron factores para la ingesta de leucina, grupo de sujetos y la ingesta por interacción de grupo. En la comparación de grupos para cada ingesta se emplearon modelos opuestos. Se calculó el coeficiente de correlación de Pearson entre la captación visceral y el IMC. Los datos se analizaron con el programa SAS, versión 8.2 (SAS Institute Inc., Cary, NC). Resultados
En ninguno de los grupos se detectó interacción entre la ingesta de leucina y la fase metabólica (ayuno o alimentación), lo cual indica que los efectos de la ingesta de leucina sobre su oxidación fueron similares en ambas fases metabólicas. Se comprobó un efecto significativo de la incorporación de leucina sobre la oxidación (p < 0.0001) en los pacientes con alimentación inadecuada y fue inferior con ingestas de 14, 22 y 30 mg kg^-1 d^-1 en comparación con la de 40 mg kg^-1 d^-1 (p < 0.05, tabla 3). Tabla 3En los individuos con buen estado de alimentación, la oxidación de la leucina tendió a ser más alta con la ingesta de 40 mg kg^-1 d^-1 pero las diferencias entre las dietas no fueron estadísticamente significativas (tabla 3). El balance diario de leucina se vio afectado por la ingesta de leucina (p < 0.01) en ambos grupos de individuos (figura 1).

El balance de 24 horas en sujetos mal alimentados tendió a ser menos negativo, especialmente a niveles bajos de ingesta de leucina. Sin embargo, la diferencia entre los participantes con alimentación adecuada y deficitaria sólo se acercó al punto de significación estadística en los niveles inferiores de ingesta de leucina (p = 0.073). Los modelos mixtos de regresión lineal del balance de leucina vs. incorporación de leucina mostraron un punto cero en el nivel de ingesta de 37.7 mg kg^-1 d^-1, con IC 95% de 32 a 50 en los participantes con buen estado de alimentación, mientras que en el otro grupo el balance cero ocurrió con 39.6 mg kg^-1 d^-1, con IC 95% de 32 a 56. Se detectó un efecto significativo de la ingesta de leucina sobre el flujo del aminoácido (p < 0.01) en el grupo con mal estado de alimentación, pero no en individuos bien alimentados. Además, hubo una diferencia significativa entre los grupos en los distintos niveles de incorporación de leucina (p < 0.001). Los porcentajes de captación esplácnica de leucina en el grupo de personas mal alimentadas, calculados a partir de los enriquecimientos de leucina en plasma para los dos marcadores, fueron 22.7 ± 9.7 y 11.5 ± 7.4 en estado de ayuno y de alimentación, respectivamente. Los porcentajes en el grupo de individuos con alimentación adecuada fueron 45.7 ± 17.8 y 33.9 ± 19.2, en igual orden. Las diferencias entre ambos estados fueron estadísticamente significativas en ambos grupos. En el período de 24 horas, la captación visceral de leucina fue, en porcentajes, de 16.5 ± 7.5 y de 39.8 ± 17.1 en los sujetos con alimentación inadecuada y correcta, respectivamente. Estos valores fueron sustancialmente distintos entre ellos (p = 0.001), independientemente del estado metabólico. Cuando se consideró la captación esplácnica combinada de los dos grupos, se relacionó considerablemente con el IMC de los individuos (r = 0.57, p < 0.01) (figura 2).

Discusión
Los hallazgos de estos estudios de balance de leucina aportan mayor información en relación con las necesidades cuantitativas de leucina^10-12,14 y de otros aminoácidos^17-22 en sujetos adultos de la India y Norteamérica. Este patrón de requerimientos de aminoácidos (para leucina y, por extensión, para valina, isoleucina, lisina, metionina y treonina) es similar al patrón de requerimientos de aminoácidos propuesto por el MIT² que recomendamos utilizar en la determinación de las necesidades diarias o en la planificación de la incorporación adecuada indispensable de aminoácidos. Este patrón también brinda la base del esquema recomendado recientemente en la reunión del Grupo de Trabajo sobre Requerimientos de Proteínas y Aminoácidos realizada en Roma en julio de 2001, bajo el auspicio de la FAO/WHO/UNU.²³ Se estudiaron personas bien alimentadas y sujetos con alimentación deficitaria porque es posible que se genere una reducción adaptativa en la demanda de leucina cuando la dieta habitual es baja en proteínas. Por otra parte, es probable que los requerimientos aumenten en respuesta a otros factores como la inmunoestimulación subclínica pero crónica. Los estudios demostraron, en primer lugar, que la demanda de leucina es sustancialmente más alta que la establecida en 1985 por la WHO/FAO/UNU¹ y similar a la establecida por la técnica de la oxidación obligada de aminoácidos de Young y col.² En segundo lugar, estos estudios han mostrado que las demandas de leucina de ambos grupos de personas fueron similares, lo cual sugiere ausencia de reducción adaptativa en las demandas de leucina cuando la dieta habitual es baja en este aminoácido. Los requerimientos de leucina también pueden estar funcionalmente relacionados con los distintos compartimientos corporales más que con el peso corporal. Por ejemplo, la demanda podría asociarse con la FFM o con el componente muscular de la FFM. Este último, en el caso de personas mal alimentadas, es aproximadamente 52% de su FFM en comparación con alrededor de 62% de la FFM en personas con un buen estado nutricional.¹⁷ Por ende, el mismo valor de requerimiento de leucina por unidad de peso corporal en sujetos bien alimentados¹² y en personas con alimentación inapropiada¹⁴ es más bajo en estos últimos cuando la demanda se expresa por unidad de FFM (48 vs. 44 mg kg FFM^-1 d^-1 en sujetos con alimentación adecuada e inadecuada, respectivamente). En cambio, puede ser más alto cuando se la expresa por unidad de masa muscular (77 vs. 85 mg kg músculo^-1 d^-1 en igual orden) si se asumen para el músculo las proporciones de FFM de la referencia 17. Obviamente, estas transformaciones numéricas de los requerimientos de leucina dependen críticamente de la confiabilidad del procedimiento que se utilice en la medición de la composición corporal e indican la importancia de mirar la demanda de aminoácidos desde una perspectiva funcional y metabólica. Independientemente de estas consideraciones, la prescripción práctica de un requerimiento global se expresa mejor en términos de una unidad fácilmente mensurable, tal como el peso corporal. La curva de balance de leucina-ingesta de leucina fue más superficial en los sujetos con alimentación inadecuada (figura 1) de manera tal que el balance de leucina de 24 horas en el nivel más bajo de ingesta de leucina fue menos negativo que en los sujetos bien alimentados aunque la diferencia entre los grupos sólo estuvo en el límite de la significación (p = 0.073). El valor de la pendiente de la línea de relación entre el balance de leucina y de ingesta de leucina fue 0.39 (IC 95%, 0.20 a 0.59) en los pacientes con alimentación inadecuada, mientras que en los bien alimentados fue de 0.66 (IC 95%, 0.37 a 0.94). Cuando el balance de leucina se graficó como una función lineal con ambos grupos combinados no hubo interacción significativa de la ingesta con el grupo (p = 0.15), lo cual indica la ausencia de diferencia sustancial entre las pendientes. Si bien las pendientes no fueron estadísticamente diferentes, la figura 1 muestra que las mismas se desviaron hacia el valor inferior de la ingesta de leucina debido a las diferencias en el balance de leucina entre los grupos en el nivel más bajo de ingesta. Por este motivo, dada la similitud en las intercepciones de los puntos cero entre el balance de leucina - incorporación de leucina en sujetos bien y mal alimentados, la pendiente más superficial en los últimos también podría reflejar una mejor utilización de la leucina en niveles bajos de ingesta del aminoácido, por debajo de los de mantenimiento. Desde un punto de vista fisiológico, es más importante considerar que la utilización eficiente podría variar en los diferentes compartimientos tisulares (por ejemplo, proteína muscular y visceral). Este hecho es particularmente importante cuando se estudian poblaciones con distinta composición corporal. Se requieren más experimentos para esclarecer las diferencias en la eficiencia de la utilización de la leucina y, en forma más amplia, de las proteínas, en sujetos con diferente estado basal nutricional y a distintos niveles de incorporación de leucina y proteínas. Se estima que la cantidad de leucina captada por la región esplácnica es el 10% al 30% de la ingesta en los estados de posabsorción y posprandial.^24,29 En los estudios de la India, la captación esplácnica en sujetos con buen estado alimentario es cercana al 46%,¹² pero es significativamente inferior en los individuos con alimentación inadecuada, alrededor del 26%.¹⁴ La base metabólica de esta diferencia no se conoce. Sin embargo, es llamativo el hallazgo de Boirie y col.,³⁰ quienes econtraron que la captación visceral de la leucina se correlaciona positivamente con el IMC. Nosotros también encontramos una correlación significativa entre el IMC y la captación esplácnica en los adultos jóvenes estudiados. En resumen, la investigación actual de la cinética de leucina marcada de 24 horas en personas de la India con buen estado nutricional y con deficiencia nutricional crónica, para cuatro niveles de ingesta del aminoácido, inclusive el establecido por la WHO/FAO/UNU de 14 mg kg^-1 d^-1, indica que los requerimientos establecidos internacionalmente son de 40 mg kg^-1 d^-1 y se aplica en forma similar a personas con buen o mal estado de nutrición en el Sur de Asia.

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