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El paso transplacentario de hematíes fetales a la circulación materna puede ser causa de aloinmunización materna contra cualquier antígeno (Ag) fetal heredado del padre y ausente en los hematíes de la madre. La isoinmunización Rh(D) es aún la causa más grave de enfermedad hemolítica del recién nacido (EHRN); los casos de sensibilización a otros Ag eritrocitarios que requieren intervención médica antes del parto son escasísimos. En las 2 últimas décadas ha disminuido mucho la incidencia de EHRN por isoinmunización Rh(D) gracias al uso generalizado de inmunoprofilaxis con gammaglobulina anti D. Los casos residuales se atribuyen a: no administración de gammaglobulina; administración de dosis insuficiente; inmunización anterior a las 28 semanas de edad gestacional (fecha habitual de administración de la 1ª dosis de inmunoprofilaxis); o transfusión previa a una mujer Rh(D) negativo, en edad fértil, de sangre Rh(D) positiva.¹ Las dosis recomendadas de gammaglobulina anti-D son diferentes en distintos países, y van desde 100 µg a 300 µg. En Europa, la pauta más extendida es la administración de una única dosis de 200-300 µg sin realizar cuantificación del volumen de la hemorragia feto-materna (HFM), a pesar de que se prevé que con esta pauta 0.3% de madres Rh(D) negativo se sensibilizarán al Ag D.² En algunos países, como Inglaterra, se administra una dosis de 100 µg que elimina 4 ml de hematíes fetales D positivo y se realiza sistemáticamente el test de Kleihauer para valorar la necesidad de dosis adicionales para prevenir inmunización. En España, la dosis habitual es de 300 µg, que resulta insuficiente para casos con un volumen de HFM superior a 15 ml y, por otro lado, excesiva en la mayoría de las pacientes. Esta estrategia supone un gasto innecesario de un producto escaso cuya única fuente de obtención hoy día es la inmunización de donantes Rh(D) negativo con hematíes Rh(D) positivo.La administración de dosis ajustadas de gammaglobulina anti D se basa en la medición precisa del volumen de HFM, ya que una dosis de 100 µg de gammaglobulina anti D neutraliza 4 ml de hematíes fetales. Tradicionalmente, se han aplicado diversas técnicas de detección de HFM de volúmenes importantes (superiores a 15 ml) basadas en la marcación del antígeno Rh(D), tales como la técnica de antiglobulina enzimática o el test de formación de rosetas. Estos procedimientos no han tenido un uso generalizado por su laboriosidad técnica.^3,4El test de Kleihauer, que se basa en la tinción de la hemoglobina fetal, resistente al pH ácido en contraposición con la del adulto, sigue siendo el más utilizado a pesar de sus limitaciones. Para obtener resultados fiables se precisa personal de laboratorio correctamente adiestrado y experimentado tanto en la realización de la técnica como en la interpretación de los resultados. Es una técnica difícil de estandarizar, subjetiva, poco reproducible y que proporciona resultados falsos positivos en situaciones que cursan con aumento de hemoglobina fetal, tales como hemoglobinopatías o aumento fisiológico de Hb fetal observado en el embarazo.^5-7 Recientemente, también se ha aplicado una técnica semicuantitativa de aglutinación en gel basada en el consumo de reactivo anti D por los hematíes fetales Rh(D) positivo. Esta técnica permite discriminar entre resultados negativos y la presencia de hematíes fetales en proporciones de 0.1%, 0.2% y ≥0.4%, pero debe complementarse con técnicas más precisas como la citometría de flujo para cuantificar volúmenes > 0.4% de hematíes fetales.⁸ La frecuencia esperada de hematíes fetales en la circulación materna en el embarazo no complicado es inferior al 0.1%. Para asegurar un conteo exacto a concentraciones tan bajas se precisan técnicas muy sensibles y precisas, que analicen gran número de células. La citometría de flujo es una técnica cuantitativa muy precisa por su capacidad para analizar poblaciones celulares individuales, y detecta poblaciones minoritarias en muestras heterogéneas. Se han descripto muy buenos resultados con diversas técnicas citométricas basadas en la marcación de Ag presentes en los hematíes fetales y ausentes en los hematíes de la madre: Ag D en incompatibilidad Rh(D) o en la marcación de hemoglobina fetal.^9-13 La técnica citométrica basada en la tinción de la hemoglobina fetal es algo más laboriosa que la marcación del Ag D, ya que requiere pasos intermedios de fijación y permeabilización antes de la tinción. Permite aplicar la detección de hematíes fetales a diferentes situaciones clínicas y no condiciona su utilización a la incompatibilidad Rh(D). Tiene la ventaja adicional sobre el test de Kleihauer de no sólo detectar la presencia o ausencia de hemoglobina fetal sino cuantificar el contenido de ésta. Por tal razón, la técnica citométrica es capaz de diferenciar los hematíes fetales verdaderos de los hematíes con aumento del contenido en hemoglobina F que se observan en otras patologías como la persistencia hereditaria de hemoglobina fetal o el aumento fisiológico de hemoglobina fetal en los hematíes maternos durante el embarazo. En estos procesos, en los que es menor la concentración eritrocitaria de hemoglobina fetal, la señal de fluorescencia emitida es menos intensa, quedando dicha población claramente diferenciada de la de los hematíes fetales.^14-16 La técnica citométrica de tinción del Ag D supone una simplificación metodológica respecto a los tests tradicionales. En el método directo se utiliza un único reactivo anti D conjugado con un fluorocromo, mientras que en el indirecto se realiza una primera incubación de la muestra con reactivo anti D, seguido de la adición de un reactivo anti IgG conjugado con fluorocromo. Se puede aumentar la sensibilidad de la técnica añadiendo biotina-anti IgG humana y posteriormente estreptavidina-conjugada con un fluorocromo.¹⁷ El método directo es más sencillo, rápido y barato, si bien en los casos con antecedentes de gammaglobulina anti D, el bloqueo de Ag D por la inmunoglobulina administrada puede condicionar una señal fluorescente débil y dificultar la diferenciación de hematíes Rh(D) positivo y Rh(D) negativo.^12,18 La tinción indirecta es más laboriosa, pero produce una señal de fluorescencia más intensa en los hematíes D positivo. La utilización de fragmentos Fab de anti IgG, en vez de la molécula completa, puede eliminar la aglutinación de hematíes D positivo observada en volúmenes importantes de HFM. Las células aglutinadas son detectadas por el citómetro como un único evento, condicionando cierta subestimación en el volumen de la HFM. Con volúmenes pequeños (< 5 ml) no se observan dichos aglutinados.^18-20En el análisis citométrico, la población eritrocitaria a estudio es claramente identificable por la señal de dispersión de luz láser del citómetro. La interferencia en la cuantificación de la HFM por otras células (leucocitos o plaquetas) no es significativa. Por lo tanto, no es necesaria la selección positiva de los hematíes marcando Ag adicionales como glicoforina A, que encarece y hace más laboriosa la técnica. Por otro lado, la adquisición en escala logarítmica para la señal de dispersión de luz frontal (forward scatter) y lateral (side scatter) permite excluir los detritus de la ventana de adquisición de los hematíes.Se recomienda adquirir la señal de un mínimo de 50 000 hematíes para garantizar la cuantificación precisa en el rango de los volúmenes esperados.²¹En nuestro laboratorio hemos aplicado varias técnicas citométricas para la cuantificación de la HFM.²² En cada tanda de trabajo se incluyen muestras como control negativo, y positivos en una proporción del 100%, 3% y 0.3% de hematíes fetales para ajustar los dinteles de identificación de éstos. Inicialmente, en 85 muestras aplicamos la técnica de tinción de hemoglobina fetal y en 35 de ellas con incompatibilidad Rh(D) se realizó además inmunofluorescencia indirecta para la marcación del Ag D. En 5 pacientes se detectó 0.1% de hematíes fetales (1.8 ml) y en otros 5 pacientes, 0.2% (3.6 ml), mientras que en las restantes no se detectó HFM. En las 35 muestras analizadas en paralelo, se obtuvo concordancia de los resultados de los dos procedimientos en todas la muestras: 2 presentaron volúmenes de 0.1% de hematíes fetales, 1 paciente presentó un volumen de 0.2% y en las muestras restantes no se detectó HFM. Posteriormente hemos aplicado la técnica de inmunofluorescencia directa de marcación del Ag D presente en los hematíes fetales D positivo y ausente en los hematíes de la madre Rh(D) negativo en muestras de puérperas con incompatibilidad Rh(D). Para ello hemos utilizado un conjugado FITC-BRAD-3. De 274 muestras analizadas, en 255 (93%) el volumen de HFM fue muy pequeño, inferior a 4 ml; en 5 (1.8%) se detectaron volúmenes de 8 ml; y una paciente presentó un volumen de 17 ml.Nuestros resultados concuerdan con los de otras series, que dan una frecuencia estimada de hematíes fetales en la circulación materna por debajo de 0.1% en el embarazo no complicado. La señal fluorescente de la población minoritaria de hematíes fetales es claramente discriminatoria de la población no fluorescente de hematíes del adulto; no fue necesaria la amplificación de la señal con un anticuerpo secundario, puesto que no hubo ninguna interpretación que resultara dudosa. La técnica de inmunofluorescencia directa de tinción del Ag D es la que hemos adaptado para ser empleada de forma rutinaria por ser una técnica sencilla, precisa y rápida, que permite su aplicación para la profilaxis con dosis ajustadas de gammaglobulina anti D. En nuestra serie, la administración de una dosis de 100 µg para proteger, frente a una hemorragia feto-materna de 4 ml, habría resultado suficiente en el 97% de los casos; ello supone un ahorro importante en el consumo de gammaglobulina anti D. Solamente un caso presentó un volumen de hemorragia de 17 ml y precisó una dosis adicional de gammaglobulina anti D.

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