NITRIC OXIDE SYNTHASE, CICLOOXYGENASE AND ARGINASE ARE INVOLVED IN TUMOR PROGRESSION MEDIATED BY ANGIOGENESIS

Abstract
Angiogenesis is an essential step for tumor growth and metastasis. Nitric oxide (NO), the product of nitric oxide synthase isoenzymes (NOS) action on arginine (Arg) and prostaglandins (PGs) originated by COX isoforms from arachidonic acid are important mediators of tumor neovascularization. Arginase (A) is another enzyme involved in this step of tumor progression and shares with NOS the same sustrate, Arg. Tumor angiogenesis can be promoted not only by soluble mediators but also by appropriate cells. Lymphocytes, from tumor draining lymph nodes (TDLN) as well as circulating macrophages, can contact tumor cells triggering positive or negative functions on tumor growth. We observed an up-regulation in neuronal and endothelial NOS isoforms expression in TDLN and demonstrated that the inhibition of NOS activity reduced neovascularization induced by TDLN cells. In addition, we have also studied the role of peritoneal macrophages obtained from tumor bearing mice in blood vessels formation and observed that they induce angiogensis "via" A metabolic products. We can conclude that pro tumorigenic actions are highlighted in immunocompetent cells from tumor bearers.

Key words
Oxido nítrico sintasa, ciclooxigenasa, arginasa, angiogénesis, ganglios linfáticos

Artículo completo
Introducción
Las investigaciones realizadas en los últimos 30 años establecieron que la angiogénesis es una etapa esencial en la progresión tumoral. Si bien en un principio se pensó que la angiogénesis era el resultado directo de la acción de un factor soluble sobre las células endoteliales, hoy se sabe que en la iniciación del proceso de neovascularización intervienen múltiples factores que actúan en diferentes niveles induciendo el crecimiento de los vasos sanguíneos.¹ El estímulo que provoca la iniciación del proceso angiogénico puede ser también indirecto, a través de las células del sistema inmune del huésped: macrófagos, linfocitos, mastocitos.
La Arg puede escindirse en citrulina y NO debido a la acción de una familia de isoenzimas: óxido nítrico sintasa neuronal (NOS1), endotelial (NOS3) e inducible (NOS2). El NO liberado está involucrado en la regulación de importantes funciones fisiológicas y patológicas y es un importante componente del microambiente tumoral ya que puede ser producido por las propias células tumorales, por las células endoteliales de la microvasculatura tumoral o por los macrófagos y células del estroma tumoral. Nosotros determinamos el papel que desempeña el NO sobre el crecimiento tumoral al actuar como parte de la cascada de señales que desencadenan el proceso angiogénico.² La Arg es el sustrato común de NOS y de arginasa (A) y esto significa que a partir de un mismo aminoácido, según cuál fuere la enzima que está disponible, se pueden obtener diferentes productos como la molécula reactiva NO (en el caso de las distintas isoformas NOS) o urea y ornitina (cuando actúan las isoformas AI y AII). La ornitina es un aminoácido precursor de poliaminas esenciales en el proceso de proliferación celular, o sea que, de alguna manera, los productos de estas enzimas están involucrados en la progresión tumoral. Las PG, que también regulan el desarrollo tumoral, son una serie de compuestos en cuya síntesis participan las isoformas COX-1 y COX-2. Su producción se vincula con la liberación de NO, lo que indica la existencia de interacciones entre las vías de señalización de ambas enzimas, COX y NOS. Nosotros demostramos que en las células tumorales LMM3, derivadas de un adenocarcinoma mamario murino, la PGE₂ modula positivamente la actividad de NOS, mientras que, por el contrario, el NO ejerce una retroalimentación negativa sobre la actividad COX.³
En numerosos estudios de biología tumoral, tanto experimentales como clínicos, se demostró que el NO, producido de manera endógena, promueve el crecimiento tumoral y la angiogénesis. Por otro lado, también se ha demostrado su participación en la inducción de apoptosis (muerte celular programada) tanto de células del sistema inmune como de células tumorales.⁴ Estos efectos opuestos del NO, contra el huésped o contra el tumor, dependen de dos variables de gran importancia: el nivel de producción de NO y la carga genética de las células tumorales.^5,6 Nosotros pudimos determinar que las células tumorales de diferentes líneas de adenocarcinomas murinos producen diferentes cantidades de NO y mostramos que existe una correlación inversa entre los niveles de NO y la citotoxicidad mediada por NO.⁷
Por otra parte, en la respuesta inmune antitumoral, es de crucial importancia la actividad regulatoria que ejercen los nódulos linfáticos regionales de un portador de tumor que puede conducir a un desequilibrio dependiente de la respuesta celular T.^8,9 Los macrófagos son importantes componentes del infiltrado leucocitario en los tumores, el papel que cumplen en la progresión tumoral es contradictorio, ya que pueden ser reguladores positivos al promover el crecimiento tumoral o reguladores negativos por su acción citotóxica contra el tumor y ambas acciones se ejercen a través de la via metabólica de la Arg.¹⁰
La participación aparentemente contradictoria del NO, las PG y las poliaminas en la relación huésped-tumor sugiere gran complejidad de su función sobre la biología tumoral y, por lo tanto, constituye un enorme desafío para profundizar su estudio.
Materiales y métodos
Animales
Se utilizaron ratones hembra de la cepa BALB/c, de 8 a 12 semanas de edad, criados en el bioterio de nuestro Instituto. El cuidado de los animales se realizó de acuerdo con los procedimientos indicados en la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (NIH 1986).
Tumores
El tumor S13 es un adenocarcinoma mamario débilmente metastásico que apareció espontáneamente en ratones BALB/c y que se mantiene por trasplantes subcutáneos (s.c.). Los implantes del tumor S13 se realizan en el flanco izquierdo, con un trócar, para evaluar el crecimiento tumoral y las metástasis posquirúrgicas. Cuando se realizó la prueba de Winn se inoculó una suspensión enzimática de 1.5x10⁴ células tumorales en la almohadilla plantar de ratones normales.
La línea de células tumorales LMM3 se obtuvo previamente a partir de un adenocarcinoma mamario singeneico MM3. Los cultivos celulares se mantienen en monocapas a 37°C con 5% de CO₂ en medio de cultivo F15 suplementado con 5% suero fetal bovino y su viabilidad se determina con azul Trypan, se utilizan suspensiones con más del 90% de viabilidad.
Los ratones portadores de tumor se obtienen por inoculación subcutánea en flanco de 4x10⁵ células LMM3. Para la obtención de células peritoneales, los animales se sacrifican a los 7 días de portación del tumor.
Crecimiento tumoral
El crecimiento del tumor s.c. se expresa como diámetro promedio geométrico del tumor en mm, midiendo los dos diámetros perpendiculares de la masa tumoral que se determinan mediante un calibre Vernier 3 veces por semana.
Las metástasis pulmonares posquirúrgicas (operados el día 10) se observan al momento del sacrificio (25 días postrasplante) con una lupa. La incidencia metastásica se determina como porcentaje del número de animales que presentan metástasis con respecto al total de los animales operados.
Test de Winn
Este ensayo de neutralización in vivo consiste en inocular en la almohadilla plantar 1.5x10⁶ células del GLDT junto con 1.5x10⁴ células del tumor S13 en 0.05 ml de medio. El crecimiento del tumor se determina midiendo el grosor de la pata por medio de un calibre Mitutoyo, tres veces por semana, hasta el sacrificio de los animales.
Purificación de macrófagos
Las células de la cavidad peritoneal de animales normales y portadores de tumor LMM3 de 7 días se obtienen por lavado con medio de cultivo MEM suplementado con 10% de SFB. Los Mf normales (MfN) y Mf de portadores de tumor (MfT), se purifican por la técnica de adhesión al plástico durante 2 hs a 37°C. Luego de realizar 2 lavados con PBS, los Mf adheridos se recuperan por raspado y se resuspenden en medio de cultivo. La viabilidad de las células se determina por el ensayo de exclusión con azul Trypan, siendo siempre superior al 95%.Ensayo de angiogénesis
Ratones hembras normales de la cepa BALB/c se inoculan por vía i.d. en ambos flancos con: 2x10⁵ células LMM3 solas o cocultivadas con MfN o MfT (2x10³), 2x10⁵ células S13 o 4x10⁶ células de GLDT, en un volumen total de 0,1 ml de medio MEM con azul Trypan para localizar el sitio de inoculación. Luego de 5 días, los animales se sacrifican y la respuesta vascular se observa en la cara interna de la piel con la ayuda de un microscopio de disección WILD. El método utilizado para cuantificar la respuesta angiogénica se basa en la determinación de la densidad de vasos, expresada como número de vasos/mm² de piel. Para ello se fotografían los sitios de inoculación, se proyectan sobre una cuadrícula y se cuenta el número de vasos. La densidad de vasos (δ) se determina por la fórmula:

Determinación de la actividad de NOS
Los MfN y MfT (10⁵/200 μl de medio) se siembran en placas de plástico de 96 hoyos y se cultivan por 24 hs a 37°C. La concentración de nitrito en el sobrenadante libre de células se determina por la reacción colorimétrica de Griess. Brevemente, se mezclan iguales volúmenes de sobrenadante del cultivo con reactivo de Griess (1% de ácido sulfanílico en 30% de ácido acético en agua con 0.1% de cloruro de N-1-naftiletilendiamina en ácido acético al 60%. A los 15 minutos se lee la absorbancia a 590 nm con un lector de ELISA. La concentración de nitrito se determina con respecto a una curva estándar de nitrito de sodio diluido en medio. Los resultados se expresan en micromolar de NO^-₂ por 10⁶ células (μM/10⁶ cél).
Determinación de la actividad arginasa
La actividad de arginasa se determina en lisados celulares según el método descrito por Modolell. Brevemente, 10⁵ MfN y MfT se lisan con 0.5 ml de buffer Triton X-100 al 0.1%. Después de 30 minutos se agregan 0.5 ml de Tris-HCl 25 mM conteniendo MnCl₂ 5 mM, pH 7.4. La enzima se activa por calentamiento a 56 °C durante 10 minutos. La hidrólisis de arginina se realiza incubando 25 μl del lisado activado con 25 μl de arginina 0.5 M, pH 9.7, a 37°C por 60 minutos. La reacción se detiene en medio ácido y la concentración de urea se determina a 540 nm, después de agregar 25 μl de α-isonitrosopropiofenona 9% (disuelta en etanol 100%). Los resultados se obtienen por extrapolación con una curva de urea, y se expresan en μmoles de urea/10⁶ cél.hora.
Determinación de la actividad de COX
Los Mf (2x10⁶) se incuban por 90 minutos a 37°C en 1 ml de medio con o sin el agregado de indometacina (INDO) 10^-6 M. Los sobrenadantes se congelan a -80°C hasta la determinación de PGE₂ por radioinmunoensayo (RIA) de acuerdo con el método de Granstrom. Brevemente, 100 μl de muestras o estándares se mezclan con 500 μl de antisuero anti-PGE₂ hecho en conejo. Posteriormente, se agrega 100 μl (5 pg) de [³H]-PGE₂ en cada tubo. Luego de la incubación se agrega una suspensión de carbón-dextrán para separar la fracción libre de la unida. La radiactividad presente en los sobrenadantes se determina con un contador de centelleo líquido utilizando solución centelleadora biodegradable. Los resultados se expresan en picogramos por 10⁶ células (pg/10⁶ cel.).
Detección de las isoformas de NOS por Western blot
Los Mf (10⁷) se lavan con PBS frío y luego se agrega 1 ml de buffer de lisis (Tris-HCl 50 mM, pH 8, 100 mM NaCl conteniendo EGTA 2 mM, EDTA 2 mM , Triton X-100 1%, PMSF 10 mM, aprotinina 20 μg/ml, leupeptina 20 μg/ml, inhibidor de tripsina 100 μg/ml). El lisado celular se centrifuga a 10 000 g por 20 min. Los sobrenadantes se conservan a -80°C hasta su uso. La concentración proteica se determina por el método de Lowry. Las muestras se siembran en minigeles de SDS-poliacrilamida junto con estándares de peso molecular conocido. Finalizada la electroforesis, las proteínas se transfieren a una membrana de nitrocelulosa y se lavan con agua destilada. Las membranas de nitrocelulosa se bloquean con buffer Tris-HCl 20 mM, NaCl 500 mM, Tween 20 (0.05%) con 5% de leche descremada (TBST) durante 1 hora a temperatura ambiente. Posteriormente se incuban con anticuerpos policlonales anti-nNOS, anti-iNOS o anti-eNOS en TBST por 24 hs. Después de varios lavados con TBST, se incuban con el segundo anticuerpo (cabra anti-ratón o conejo anti-ratón conjugado con fosfatasa alcalina diluido 1:4 000 en TBST) a 37°C durante 1 h. Las bandas se revelan con una mezcla de cloruro de nitroazul de tetrazolio/5-bromo-4cloro-3-indolilfosfato-p-toluidina (NBT/BCIP). Las bandas se cuantifican por medio de un densitómetro computarizado conectado a un analizador de imágenes.
Detección de isoformas de arginasa por Western blot
Los MfN o MfT purificados se lavan 2 veces con PBS frío y se resuspenden con 300 μl de buffer de lisis: Tris-HCl (pH 7.5) 50 mM, EDTA 0.1 mM, EGTA 0.1 mM, leupeptina 1 μg/ml, aprotinina 1 μg/ml y PMSF 0.1 mM. La lisis se completa por sonicado. Las muestras (25 μg por calle) son sometidas a electroforesis en geles de SDS-PAGE al 10%. Las proteínas se transfieren a una membrana de nitrocelulosa por el método semilíquido. Después de varios lavados con agua destilada, se bloquean los sitios inespecíficos con buffer TBST con 5% de leche descremada, se incuba con el anticuerpo monoclonal anti-A I o con un anticuerpo de conejo anti-A II durante 18 hs a 4C y luego 1 h con el segundo anticuerpo anti-IgG de ratón o de conejo conjugado con fosfatasa alcalina. Las bandas se visualizan con una mezcla NBT/BCIP. La cuantificación se realiza por densitometría en un analizador de imágenes computarizado.
Detección de CD31 (PECAM-1) por Western blot
Se obtienen muestras de piel del sitio angiogénico desprovistas de pelo y se las homogeneiza a 4C en 4 volúmenes de Tris-HCl 20 mM, EGTA 10 mM, EDTA 10 mM, PMSF 1 mM, DTT 1 mM, leupeptina 10 μg/ml, aprotinina 10 μg/ml, inhibidor de tripsina 10 μg/ml, pH:7.4. Los homogenatos se centrifugaron a 4°C, 10 000 rpm por 10 minutos. Los sobrenadantes se guardan a –80ºC y la concentración de proteína se determinó por el método de Lowry. Las muestras fueron sometidas a electroforesis en geles de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE) al 10%, sembrándose aproximadamente 30 μg de proteína por calle. Luego, las proteínas se transfieren a una membrana de nitrocelulosa por el método semi-líquido. Después de varios lavados con agua destilada se las incuban con TBS-T durante 1 h a temperatura ambiente. Se incuba durante 18 hs. con un anticuerpo policlonal anti-PECAM-1. Luego de 4 lavados con TBS-T se agrega el segundo anticuerpo anti-IgG conjugado con fosfatasa alcalina disuelto en TBS-T. Las bandas se visualizan con una mezcla NBT/BCIP. La cuantificación se realiza por densitometría en un analizador de imágenes computarizado.
Drogas
Todas las drogas fueron provistas por SIGMA-Aldrich, salvo otra especificación. Las soluciones se prepararon en el momento de cada ensayo. Se utilizó como inhibidor de NOS: N^ω nitro-L arginina metil ester (L-NAME) 10^-3 M y como inhibidor de COX: indometacina (INDO) 10^-6 M; para interferir la vía de la arginasa se utilizó L-valina (Val) 5x10^-2 M.
Estadística
Todos los experimentos se realizaron por lo menos 3 veces obteniéndose resultados comparables. La significación de los ensayos se determinó utilizando el test "t" de Student, el de ANOVA o el de Mann-Withney, utilizando el programa STAT Primer. Las diferencias entre las medias se consideraron significativas cuando p < 0.05. Los resultados son expresados como promedio ± E.S.
Resultados y discusión
Uno de los objetivos de este estudio fue identificar el papel que cumplen los GLDT S13 sobre el crecimiento tumoral. Confirmamos la participación del NO como promotor de la angiogénesis y de la progresión tumoral. Así observamos que animales tratados in vivo con un inhibidor no selectivo de NOS (L-NAME) presentan una disminución de la respuesta angiogénica, el crecimiento tumoral y la incidencia de metástasis (Figuras 1, 2 y 3). Se ha propuesto que la continua generación endógena de bajas concentraciones de NO por parte de las células tumorales contribuye al aumento de la respuesta angiogénica asociada al crecimiento tumoral.

Figura 1. Las células S13 (2x10⁵/0.1 ml) se inocularon en forma i.d. en ambos flancos de ratones normales no tratados o tratados con L-NAME (50 mg/kg día i.p.) durante los 5 días que dura el ensayo. De igual forma se inocularon 4x10⁶ células de ganglio drenante del tumor S13 (GLDT) provenientes de portadortes no tratados o tratados con L-NAME (1 g/l en el agua de bebida) durante el tiempo de portación del tumor. Los valores son promedios ± E.S. de 6 determinaciones, * p <0.0001.

Figura 2. El tumor S13 se implantó en forma s.c. por trócar en el flanco izquierdo de ratones normales no tratados o tratados con L-NAME (1 g/l en el agua de bebida) durante el tiempo de portación del tumor. Los diámetros tumorales (largo y ancho) se midieron tres veces por semana con un calibre Vernier y se graficó el diámetro geométrico promedio vs. días de progresión tumoral. Los valores son promedios ± E.S. de 10 determinaciones, * p < 0.001.

Figura 3. El tumor S13 se implantó en forma s.c. por trócar en el flanco izquierdo de ratones normales no tratados o tratados con L-NAME (1 g/l en el agua de bebida) durante el tiempo de portación del tumor. La cirugía del tumor primario se realizó a los 10 días de portación y las metástasis pulmonares se observaron al momento del sacrificio de los ratones. La incidencia de metástasis se expresa como porcentaje con respecto al número total de ratones inoculados.

Cuando se extirparon los GLDT, observamos un aumento de tamaño debido a la presencia de histiocitos pero no de células tumorales. Esta observación se corroboró in vivo, pues cuando los GLDT se transplantaron a ratones normales no hubo evidencia de crecimiento tumoral, lo que indica la ausencia de células tumorales. Para estudiar la presencia de células inmunes efectoras (inhibidoras del tumor) o exaltadoras (promotoras del tumor) en los GLDT, se realizó el ensayo de Winn. Esta prueba de neutralización in vivo consiste en la coinoculación de las células tumorales con las células de los GLDT, en este caso se observó una reducción significativa del crecimiento tumoral, comparado con el control (Figura 4).

Figura 4. Se inocularon 1.5x10⁶ células de ganglio drenante del tumor S13 (GLDT) con 1.5x104 células S13 en la almohadilla plantar de ratones normales no tratados o tratados con L-NAME (1 g/l en el agua de bebida) hasta el momento del sacrificio (16 días). El grosor del tumor se midió tres veces por semana con un calibre Mitutoyo. Los valores son promedios ± E.S. de 10 determinaciones.

Los linfocitos de los GLDT indujeron una fuerte respuesta angiogénica que se correlacionó directamente con la actividad NOS (aumento del 35% en la actividad enzimática con respecto a los normales). En la figura 1 se observa que este efecto se anula con el tratamiento del inhibidor de NOS, L-NAME.
Como la producción y liberación de PG, de la misma manera que el NO, está asociada al desarrollo de la respuesta angiogénica,¹⁶ determinamos los niveles de producción de PGE₂ en los GLDT. Sorpresivamente, la síntesis de PGE₂ disminuyó en un 50% comparada con la liberación de PGE₂ en los nódulos linfáticos normales. El aumento de la actividad NOS explica, en parte, el aumento de la respuesta angiogénica, pero ¿cómo se explica la disminución en la liberación de PGE₂ ¿Será que esta disminución se relaciona con el efecto protector de los ganglios que se detectó por el ensayo de Winn Efectivamente, el efecto antitumoral de los ganglios drenantes del tumor no fue afectado por la inhibición de NOS que, en cambio, sí disminuyó la respuesta angiogénica. Por lo tanto, los bajos niveles de PGE₂ en los GLDT pueden correlacionarse con su mayor actividad antitumoral (mecanismo independiente del NO) a pesar de su capacidad para estimular la angiogénesis (mecanismo dependiente del NO).
Algunos autores han demostrado que los Mf activados por la presencia de un tumor en crecimiento podían llevar a la muerte de las células tumorales a través de la inducción de apoptosis por mecanismos independientes y dependientes del NO.¹⁷
Nosotros estudiamos la modulación de la angiogénesis tumoral por MfT y observamos que cuando las células tumorales LMM3, que producen respuesta angiogénica, son coinoculadas con MfN no se modifica la respuesta neovascular producida por las células tumorales. En cambio, cuando se coinoculan con MfT (en una relación 100:1, con baja cantidad de Mf que por sí solos no inducen angiogénesis) se produce un fuerte incremento de la actividad angiogénica de las células tumorales (Figura 5). La inoculación de los MfT solos, a dosis mayores (equivalentes a las utilizadas en las células tumorales), promueve la angiogénesis, mientras que los MfN, a todas las dosis estudiadas, son incapaces de evocar una respuesta angiogénica (datos no mostrados).

Figura 5. las células LMM3 (2x10⁵) cocultivadas en MfT (2x10³) se inocularon en forma i.d. En ambos flancos de ratones normales. Los MfT fueron tratados con 10^-6 M de indometaciona y 5x10^-2 M de L-valina (Val). Los valores son promedios ± E.S. de 10 determinaciones.

La respuesta angiogénica cuantificada in vivo, por el número de vasos por mm² de piel, fue corroborada con la detección de CD31, que es una molécula que se expresa en el endotelio de todos los tipos de vasos y es empleada como marcador de vasos sanguíneos, particularmente al comienzo de la neovascularización. Por un ensayo de Western blot se detectó que la expresión de CD31, negativa en piel normal, es evidente en animales inoculados con células tumorales y esta expresión aumenta en la piel de animales coinoculados con células LMM3 y MfT (Figura 5).
Al estudiar la expresión de las isoformas de NOS y de A en las distintas poblaciones de Mf, se determinó que los MfN y MfT expresan constitutivamente las isoformas iNOS y nNOS, es mayor la expresión de éstas en MfN que en MfT.¹⁰ Estos resultados concuerdan con la observación que los MfN producen más NO que los MfT (Tabla I). Por otro lado, los MfN y MfT expresan constitutivamente las isoformas AI y AII, es mayor la expresión de ambas en MfT, lo que también concuerda con el hecho que los MfT producen más urea (producto de la acción de A sobre la Arg) que los MfN. Por lo tanto, la capacidad de los MfT para regular positivamente la angiogenicidad de las células tumorales estaría vinculada a la actividad de las isoformas de A.

La producción de NO, medida como NO^-2 se dterminó en sobrenadantes libres de células utilizando el reactivo de Griess; la actividad de arginasa se cuantificó en lisados celulares por un método enzimático colorimétrico y la actividad de COX se midió cuantificando la síntesis y liberación de PGE₂ por RIA. Los valores son promedios ± E.S. de 4 experimentos.

Entonces, podemos concluir que los MfT, lejos de ejercer una acción tumoricida, cuando se presentan en bajas dosis, contribuyen a estimular la cascada angiogénica, a través de la vía de A. Los MfN, a pesar de que poseen mayor actividad NOS y mayor expresión de las isoformas inducible y neuronal de dicha enzima, son incapaces de inducir angiogénesis.
Por todo lo expresado podemos concluir que en los mecanismos que conducen al desarrollo de la actividad angiogénica, a pesar de que siempre está involucrado el metabolismo de la Arg, algunas veces la regulación se realiza vía NOS y otras vía A. De acuerdo con nuestros resultados, en el caso de los ganglios linfáticos la promoción de la angiogénesis es mediada por NOS y en los MfT se realiza un "switch" en la vía metabólica de la Arg desde NOS a A, disminuyendo los niveles de NO y proveyendo, probablemente los precursores de poliaminas necesarios para la progresión tumoral. Ambos tipos de células inmunocompetentes de un portador de tumor contribuyen a la progresión tumoral a través de la cascada de eventos que estimulan la respuesta neovascular.
Los autores no manifiestan conflictos

Bibliografía del artículo

1. L. Davel, M. Miguez, E.S. de Lustig. Angiogenesis induction by lymphocytes from tumor-bearing mice in a singeneic combination. Transplantation 1984, 37(3): 327-328.
2. Jasnis MA, Giri J, Davel L. Nitric oxide is involved in stimulation of tumor growth. Oncol. Reports 1997; 4: 1107-11.
3. L.Davel, A.D\'Agostino, A.Español y col. Nitric oxide synthase-ciclooxigenase interactions are involved in tumor cell angiogenesis and migration. J.Biol.Reg.Homeos.Ag. 2002, 16 (3), 181-189.
4. Xie K, Dong Z, Fidler IJ. Activation of NOS gene for inhibition of cancer metastasis. J.Leukoc. Biol. 1996, 59:797-803.
5. Ziche M, Morbidelli L, Masini E y col. Nitric oxide mediates angiogenesis in vivo and endothelial cell growth and migration in vitro promote by substance P. J.Clin.Invest. 1995, 94: 2036-2044.
6. Pipili-Synetos E, Papageorgious A, Sakkoulas E y col. Inhibition of angiogenesis, tumor growth and metastasis by the NO-releasing vasodilators, isorbide mononitrate and dinitrate. Br.J.Pharmacol. 1995, 116: 1829-1834.
7. Eijan AM, Davel L, Rueda H y col. Differential nitric oxide release and sensitivity to injury in different murine mammary tumor cell lines. Int.J.Mol.Med. 1998, 2: 625-30.
8. Wiers K, Wright MA, Vellody K y col. Failure of tumor-reactivr lymph node cells to kill tumor in the presence of immune-suppressive CD34⁺ cells can be overcome with vitamin D3 treatment to disminish CD34⁺ cell levels. Clin.Exp.Metastasis 1998, 16: 275-282.
9. Bauer H, Jung T, Tsikas D y col. Nitric oxide inhibits the secretion of T-helper 1 and T-helper 2 associated cytokines. Immunology 1997, 90: 205-211.
10. Davel LE, Jasnis MA, de la Torre E y col. Arginine metabolic pathways involved in the modulation of tumor induced angiogenesis by macrophages. FEBS Lett. 2002, 532:216-220.
11. Benacerraf B, Unanue E. Tumor Immunology. En: Texbook of Immunology. Williams & Wilkins Company (ed) Waverly Press, Baltimore, 1980, 204-205.
12. Davel L, Puricelli L, Vidal M y col. Soluble factors from target organ enhance tumor cell angiogenesis. Role of laminin SIKVAV sequence. Oncol. Reports 1999, 6: 907-911.
13. Bredt DS, Snyder SH. Nitric oxide mediated glutamate linked enhancement of cGMP levels in the cerebellum. Proc Natl Acad Sci USA 1989; 86: 9030-9033.
14. Granstrom E, Kindhal H. Radioooimmunoassay of prostaglandins and tromboxanes. En: Prolich, JC ed. Advances in Prostaglandins and Tromboxanes Research. New York: Raven Press, 1978, 119-210.
15. Davel L, Rimmaudo L, Español A y col. Different mechanisms lead to the angiogenic process induced by trhee adenocarcinoma cell lines. Angiogenesis 2004 (en prensa).
16. Davel L, Miguez M, de Lustig ES. Evidence that indomethacin inhibits lymphocyte-induced angiogenesis. Transplantation 1985, 39(5): 564-565.
17. Cui S, Reichner JS, Mateo RB y col. Activated murine macrophages induced apoptosis in tumor cell through nitric oxide-dependent or independent mechanisms. Cancer Res. 1994, 54: 2462-2467.