PHAGOCYTOSIS OF PERIODONTOPATHOGENIC BACTERIA BY CREVICULAR GRANULOCYTES IN SEVERE PERIODONTITIS AND MODULATING BY ANTIBIOTICS

Abstract
In vitro-phagocytosis and intracellular killing of Porphyromonas gingivalis ATCC 33277 and of Actinobacillus actinomycetemcomitans FDC 44 by crevicular PMNs were determined in severe periodontitis. Each 18 patients with periodontitis and 9 healthy controls were included. Phagocytosis and intracellular killing were assessed by fluorescence microscopy after staining with acridine orange. The percentage of phagocytosing PMNs were enumerated and then two groups were separated: < 10 bacteria, > 10 bacteria phagocyted. The percentage of PMNs with viable bacteria was also registered. In healthy subjects there were more phagocytes with more than 10 ingested P. gingivalis than in periodontitis patients. The intracellular killing was diminished in the periodontitis group for P. gingivalis and for A. actinomycetemcomitans. Furthermore effects of subinhibitoric concentrations of antibiotics (clindamycin, doxycylin and metronidazole) were tested by the same method. Each granulocytes obtained from 13 - 24 periodontitis patients and 8 - 13 heathy controls were tested. Clindamycin enhanced phagocytosing capacity, contrary both doxycyclin and metronidazole decreased it. These effects were independent of the strain used. Also intracellular killing might be deviated by antibiotics. The results indicate a diminished phagocytosis of periodontopathognic species in periodontitis and an influence of antibiotics used in treatment on this unspecific immune response.

Key words
Periodontitis, fagocitosis, P. gingivalis, A. actinomycetemcomitans

Artículo completo

En los últimos años se ha reconocido a la patogénesis de las formas progresivas de periodontitis como una interacción entre microorganismos específicos de la placa subgingival y numerosos factores de la respuesta inmune específica e inespecífica (1,2). Offenbacher y col. (3) han postulado que la especificidad de las bacterias en la enfermedad periodontal puede tener su origen en las propiedades evasivas de neutrófilos de la bacteria, debido a que los microorganismos tienen la capacidad de evadir a los polimorfonucleares (PMN) o los neutrófilos del huésped no funcionan debidamente. En la periodontitis, Porphyromonas gingivalis y Actinobacillus actinomycetemcomitans juegan un papel importante en la patogénesis de la forma severa o agresiva.

Nos es claro que los pacientes con formas definidas de periodontitis juvenil localizada (LJP) (2) y periodontitis refractaria muestren funciones fagocíticas deprimidas. La mayoría de los trabajos se ha centrado en las propiedades fagocíticas de los PMN de sangre periférica. Por tal motivo, la razón de esta investigación fue obtener información sobre las propiedades de fagocitosis y muerte intracelular de las especies periodontopatogénicas A. actinomycetemcomitans y P. gingivalis por PMN sulculares en la periodontitis severa. Los pacientes a ser estudiados tenían periodontitis rápidamente progresiva (PRP), pero en la nueva clasificación de periodontitis se excluyó la PRP como una forma separada (5).

En el tratamiento de pacientes con enfermedad periodontal severa, la terapia antimicrobiana como metronidazol, doxiciclina y clindamicina es un adyuvante efectivo. Además de su efecto bacteriostático o bactericida, los antibióticos pueden interactuar directamente con células del sistema inmune (7). De esta manera el efecto de los antibióticos en la fagocitosis in vitro también será estudiada.

Material y métodos
Población en estudio. Dieciocho pacientes con periodontitis severa y 9 personas sanas como control de entre 20 y 35 años se incluyeron en esta investigación. Todos los sujetos seleccionados para el estudio eran saludables y no fumadores. Ninguno de ellos había recibido antibióticos en los últimos 6 meses. Los sitios enfermos se caracterizaron por parámetros clínicos y radiológicos. Sumado a esto, el diagnóstico de confirmó por cultivos microbiológicos de muestras de la placa subgingival.

Ensayo sobre fagocitosis. Se obtuvieron leucocitos sulculares de los bolsillos periodontales o surcos gingivales mediante 15 lavados con solución salina con buffer de fosfato (PBS) por medio de una pipeta Eppendorf de 5 µl, como está descrito (8). Para tal propósito se seleccionaron en los pacientes con periodontitis dos bolsillos periodontales preferentemente de 6 a 9 mm de profundidad en cada cuadrante. Para obtener suficiente fluido del surco gingival de los pacientes control fue necesario lavar al menos cuatro surcos gingivales en cada cuadrante. Luego, la preparación de 75 µl de células fue centrifugada a 150 g por 10 minutos y lavada dos veces, y finalmente vuelta a colocar en 250 µl de PBS. El número y la viabilidad de las células PMN se determinaron con una cámara Neubauer. Para contar las células se agregaron 180 µl de solución de Tuerk a la suspensión de 20 µl de células. La viabilidad de los granulocitos se determinó por la prueba de exclusión de azul de trypan.

Se utilizaron las especies P. gingivalis ATCC 33277 (P.g.) y A. actinomycetemcomitans Tanner FDC44 (A.a.) conocidas como cepas productoras de leucotoxina en el ensayo de fagocitosis. (La cepa de A. actinomycetemcomitans fue amablemente suministrada por R. Mutters, Marburg, Alemania). Veinticuatro horas antes del ensayo, las cepas se subcultivaron en agar Schaedler con la apropiada atmósfera anaeróbica o de CO₂.

La suspensión bacteriana se ajustó fotométricamente a 10⁹ bacterias por ml con PBS; 200 µl de esta suspensión se mezclaron con 200 µl de suero anti-AB para opsonización por 30 minutos. Las colonias subsiguientes se centrifugaron a 1000 g por diez minutos y las siembras fueron lavadas y resuspendidas en 1000ml de PBS. Finalmente se adicionó 200 µl de suero fetal bovino.

La fagocitosis in vitro se realizó en un portaobjeto de acuerdo a Smith & Rommel (9) y Pantazis y col. (10). Luego de agregar 50 µl de una suspensión de células, las células se adhirieron en una incubadora de CO₂ a 37 ºC por 30 minutos. Subsecuentemente, 10 µl de una suspensión se transfirieron al portaobjetos y el ensayo de fagocitosis se incubó con 5% de CO₂ a una temperatura de 37 ºC por 30 minutos. Los portaobjetos se tiñeron con naranja de acridina (2.75 mg/7.5 ml PBS) y se examinaron un total de 100 PMN inmediatamente mediante microscopia de fluorescencia. Las bacterias viables y muertas dentro de los granulocitos se pueden diferenciar por la absorción del naranja de acridina, las bacterias viables aparecen verdes y las muertas rojas en el microscopio de fluorescencia. Se cuenta el número de PMN que contienen bacterias. Estas células fagocíticas se separaron en dos grupos de acuerdo con los siguientes criterios: células con menos de 10 bacterias ingeridas y células con más de 10 células ingeridas. Adicionalmente se documentó el porcentaje de granulocitos con bacterias viables no muertas. El test de Mann-Whitney se utilizó para valorar la importancia de los resultados.

Influencia de los antibióticos en la fagocitosis. Los antibióticos para ser evaluados eran clindamicina, doxiciclina (ambos de Ratiopharm, Ulm, Alemania) y metronidazol (Braun, Melsungen, Alemania). Los sujetos que se incluían en la prueba sobre la influencia de los antibióticos en la fagocitosis debían llenar los mismos criterios clínicos. De esta forma se obtuvieron granulocitos de (i) 24 pacientes con periodontitis y 13 sujetos sanos para estudiar la influencia de la clindamicina, (ii) 13 pacientes con periodontitis y 9 sujetos sanos para estudiar la influencia de la doxiciclina, y (iii) 14 pacientes con periodontitis y 8 sujetos sanos para el estudio de la influencia del metronidazol.El método descripto anteriormente fue usado excepto después de la opsonización; el pellet fue dividido en dos partes. Una parte se colocó en PBS y la otra en PBS con 1 µg/ml del antibiótico a ser evaluado. La prueba de Wilxocon se utilizó para validar la trascendencia de los resultados de muestras pareadas.

Resultados
Células del surco gingival. Los pacientes con periodontitis severa tenían más granulocitos en 1 µl de fluido del surco que los controles sanos (periodontitis: 614 ± 471; controles: 188 ± 139; p < 0.05). No se halló diferencia de viabilidad entre los dos grupos (periodontitis: 87.1 ± 6.7%; controles: 88.2 ± 6.9%).

Fagocitosis. Si los granulocitos del surco eran expuestos a un alto número de bacterias que no pertenecían a la flora propia del paciente, muchos de los leucocitos ingerían estas bacterias. Ambos, los pacientes con periodontitis y los controles, poseían células fagocíticas entre 84% y 91% en cada caso de bacterias agregadas. No se encontraron diferencias importantes entre los dos grupos, pero se observó una tendencia de menos PMN que fagocitaban P. gingivalis (figura 1).

Figura 1. Porcentaje de PMN sulculares fagocitantes en pacientes con periodontitis severa y en controles (media y desvío estándar).

Considerando la absorción cuantitativa de bacterias, se registraron en el grupo de periodontitis menos PMN con más de 10 P. gingivalis ingeridas (54.2% ± 16.9% - número relacionado con todos los granulocitos colectados) en comparación con los controles (72.2% ± 24.9%). Cuando la cepa de A. actinomycetemcomitans debía ser fagocitada, el número de PMN con más de 10 bacterias era inferior en los pacientes con periodontitis que en los controles, pero esta tendencia no se confirmó estadísticamente (figura 2).

Figura 2. Porcentaje de PMN sulculares fagocitantes con más de 10 bacterias ingeridas en pacientes con periodontitis severa y en controles (en relación con el total de granulocitos; media y desvío estándar).

Muerte intracelular. A pesar de que en general los fagocitos contenian un número inferior de bacterias, el porcentaje de granulocitos con bacterias viables era mayor en los pacientes con periodontitis comparado con el grupo control. Este resultado se confirmó estadísticamente para cada cepa de bacterias añadidas (cada una p < 0.05, figura 3).

Figura 3. Porcentaje de PMN sulculares con bacterias viables en pacientes con periodontitis severa y en controles (en relación con el total de granulocitos; media y desvío estándar).

Esto significa que la muerte intracelular está disminuida en la periodontitis.Influencia de los antibióticos en la fagocitocis. El número de granulocitos que fagocitan ambos P. gingivalis y A. actinomycetemcomitans se elevó por medio de la clindamicina y alcanzó casi el 100% en ambos grupos (A.a.: control - p < 0.05, periodontitis - p < 0.001; P.g.: control - p < 0.01; periodontitis - p < 0.001). Al contrario, el metronidazol (cada cepa y grupo - p < 0.01) y la doxiciclina (A.a.: control - p < 0.01, periodontitis - p<0.001; P.g.: control - p < 0.05, periodontitis - p < 0.01) redujeron claramente el número de fagocitos activos (figura 4).

Figura 4. Desviaciones en el porcentaje de PMN sulculares fagocitantes en pacientes con periodontitis severa y en controles luego de la adición de 1µg/ml de antibiótico a cada uno (media y desvío estándar).

Considerando solo a los fagocitos con más de 10 bacterias ingeridas, se alcanzaron resultados similares. Se observó elevación, luego de la administración de clindamicina, en el número de PMN con alta capacidad de fagocitosis (P.g.; control - p < 0.05, periodontitis - p < 0.01; A.a.: control - p<0.05, periodontitis - p<0.001) mientras que luego de la administración de doxiciclina (A.a. control - p<0.05, periodontitis - p<0.01) y metronidazol (P.g.: periodontitis - p<0.05; A.a.: periodontitis - p<0.01) estos disminuyeron (figura 5).

Figura 5. Desviaciones en el porcentaje de PMN sulculares con más de 10 bacteria ingeridas en pacientes con periodontitis severa y controles luego de la adición de 1µg/ml de antibiótico a cada uno(media y desvío estándar).

La clindamicina promovió la muerte de bacterias por parte de los PMN en sujetos sanos. Esto quiere decir que se encontraron menos PMN con bacterias viables en relación al número de granulocitos fagocitantes (P.g. y A.a.: p < 0.05). Luego de la adición de doxiciclina, no se pudieron confirmar diferencias estadísticamente. El metronidazol redujo la muerte de P.gingivalis por parte de los PMN en muestras obtenidas de sujetos sanos (figura 6; p < 0.05).

Figura 6. Desviaciones en el porcentaje de PMN sulculares con bacterias viables en pacientes con periodontitis severa y controles luego de la adición de 1µg/ml de antibiótico a cada uno (media y desvío estándar).

Discusión
En este estudio se analizaron los parámetros de fagocitosis de PMN obtenidos de lesiones periodontales. El método de fagocitosis in vitro por medio de microscopia de fluorescencia se adaptó a PMN del surco gingival. Los granulocitos del surco actúan diferente en relación a los PMN de la sangre periférica, de modo que el porcentaje de granulocitos viables es menor en el surco que en la periferia (11). Los PMN del fluido del surco gingival en pacientes adultos con periodontitis severa se caracterizan por disminución en la superficie de expresión y niveles de ARNm de ciertos receptores Fc, y deteriorada fagocitosis de microesferas opsonizadas en comparación con los PMN de la sangre periférica de estos pacientes (12). Nuestras observaciones confirmaron claramente un número incrementado de granulocitos en el fluido sulcular de los pacientes con periodontitis (13). Este resultado demostró la inflamación en curso en esta región.

En general, ha sido demostrado que solo los PMN obtenidos de pacientes con periodontitis juvenil mostraron función fagocítica deteriorada; así se encontró menor número de microesferas fagocitantes de células (14) y una generación quimioluminiscente decrecida y muerte por MTT reducida durante la fagocitosis de cimógenos opsonizados. Solo aisladamente se demostró disminución en la fagocitocis de partículas de látex en pacientes con PRP (16). Nuestros resultados subrayan este último descubrimiento utilizando bacterias periodontopatogénicas. La fagocitocis de P. gingivalis , la especie más importante en PRP, tiende a estar alterada en esta forma de periodontitis. Se registró una tendencia a tener menos PMN fagocitantes y menor porcentaje con una alta capacidad fagocítica. A. actinomycetemcomitans y especialmente P. gingivalis se encuentran frecuentemente en muestras de la placa subgingival recolectadas de pacientes con PRP. En casos de periodontitis detectada, las cepas de A. actinomycetemcomitans producen la leucotoxina que deteriora a los PMNs (17). Los dolores gingivales y otros productos de colonias de P. gingivalis deprimen la fagocitosis de los PMN en pacientes con periodontitis y personas sanas pero los pacientes con periodontitis son más susceptibles a la inhibición por parte de los productos de las colonias que en los sujetos control (18). En pacientes con periodontitis severa se hallaron más PMN con P. gingivalis y A. actinomycetemcomitans viable. En los pacientes, la muerte de bacterias periodontopatogénicas por PMN sulculares aparenta ser deficiente. Los productos de P. gingivalis, como el sulfuro, disminuyen la muerte de bacterias por parte de los PMN.

El efecto de los antibióticos no dependió de la cepa utilizada. Probablemente éstos puedan deberse a desviaciones de ciertas funciones celulares de los PMN. La concentración de antibióticos utilizada fue baja y el tiempo fue muy corto como para matar a las bacterias con el antibiótico solo. La clindamicina aumenta la capacidad de fagocitosis de los PMN. De esta manera, otros resultados fueron confirmados (20). La clindamicina promovió la expresión de receptores Fc de los fagocitos (21). Se observó mejoría en la capacidad de matar bacilos gramnegativos luego de la administración de clindamicina (22). En el estudio se presentaron estos hallazgos, pero solo pudieron ser confirmados en los sujetos sanos. La doxiciclina disminuyó la fagocitosis. Resultados similares son los que publican Paape y col. (23), pero estos autores realizaron las pruebas en PMN de sangre periférica de animales. La doxiciclina redujo el contenido de F-actina en neutrófilos (24). Pero debe remarcarse que la inhibición de metaloproteinasas de la matriz es un efecto adverso de la doxiciclina (25). Por su parte el metronidazol reduce la fagocitosis in vitro . Esta droga produce rupturas en las hebras de ADN de los linfocitos (26). La migración de los granulocitos puede ser desviada (27). Un estudio demostró que la ciprofloxacina tiene un efecto promotor sobre la fagocitosis de A. actinomycetemcomitans (28). El principal efecto de los antibióticos es la muerte de las bacterias patogénicas. Sin embargo, es necesaria suficiente cantidad de fagocitosis por parte de los PMN para eliminar la bacteria.

En esta investigación se ha aclarado que los PMN del fluido del surco gingival de pacientes con periodontitis severa mostraban deficiencias especialmente en la fagocitosis de una gran cantidad de P. gingivalis y en la muerte intracelular de bacterias periodontopatogénicas. Los antibióticos normalmente utilizados en el tratamiento son capaces de ejercer una influencia sobre la fagocitosis.

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