NOTCH1 gene mutations in chronic lymphocytic leukemia

Abstract
Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is the most common leukemia in the Western world. The disease has a highly variable clinical course, ranging from very indolent cases to patients with aggressive and rapidly progressing outcome. Genetic studies are useful tools in analyzing this pathology, and have been incorporated in international risk classifications. The analysis of genomic rearrangements and the mutational status of immunoglobulin heavy chain variable have allowed risk groups of high prognostic value to be established. More recently, next generation sequencing studies have identified novel somatic mutations that could explain the wide clinical variability of this pathology. Among them, the analysis of NOTCH1 (neurogenic locus notch homolog protein 1) gene mutations are of interest, as deregulation is associated with tumorigenesis.

NOTCH1 mutations are mostly located at exon 34 (80% of cases) and 3´UTR (untranslated region). They produce premature stop codons that produce a constitutively active and stable NOTCH1 protein. NOTCH1 mutations are associated with adverse prognosis and refractoriness to treatment. The aim of this study was to analyze NOTCH1 mutations in CLL patients by ASO-PCR and sequencing. Our results found 4.4% of cases with NOTCH1 mutated values concordant with international observations (5%-10%). Including them in the genetic status of CLL patients allows the characterization of risk groups, an aspect of great importance in clinical practice and therapeutic decisions, to be refined.

Key words
NOTCH1 gene, mutations, chronic lymphocytic leukemia, cytogenetics, FISH, IgH

Artículo completo
Leucemia linfocítica crónica

Las neoplasias del sistema linfoide constituyen un grupo heterogéneo de enfermedades, con un amplio espectro de variación desde el punto de vista clínico, morfológico, inmunofenotípico, citogenético y molecular. Entre ellas se encuentra la leucemia linfocítica crónica (LLC), que constituye la leucemia más frecuente en adultos de Occidente, dado que representa el 30% de los casos.^1,2 Se caracteriza por la acumulación progresiva de linfocitos B maduros en sangre periférica, médula ósea y ganglios linfáticos, como resultado de un desequilibrio entre la disminución de la apoptosis y el aumento de la proliferación de un subgrupo de células leucémicas. Inicialmente se consideró que se trataba de una enfermedad estable originada por la simple acumulación de linfocitos B quiescentes como consecuencia de una disminución de la apoptosis, pero estudios posteriores demostraron la presencia de linfocitos tumorales con una alta capacidad proliferante,³ asociados con enfermedad más agresiva.⁴

Un aspecto característico de esta entidad es la diferencia en la evolución clínica de los pacientes, con algunos casos que requieren tratamiento inmediato y otros que presentan un curso más indolente de la enfermedad,⁵ sin que sean suficientes los sistemas de estadificación y los parámetros biológicos disponibles para predecir este comportamiento diferente. Esto hace necesario poder contar con marcadores que permitan clarificar en forma más precisa el curso clínico de los pacientes y su respuesta al tratamiento. En este aspecto, los estudios genéticos constituyen herramientas de suma utilidad en la comprensión de la heterogeneidad que la caracteriza, lo que resulta de relevancia por sus repercusiones clínicas en el diagnóstico, el pronóstico y la respuesta al tratamiento, encontrándose incorporados a las clasificaciones de riesgo internacionales. Estos estudios son de utilidad no solo como marcadores de valor diagnóstico o pronóstico, sino también en la comprensión de los mecanismos implicados en el proceso de desarrollo y progresión neoplásica.

En este aspecto, el análisis de los rearreglos genómicos y del estado mutacional de los genes IGHV (immunoglobulin heavy chain variable region) ha permitido establecer grupos de riesgo de alto valor pronóstico.⁶ La presencia de mutaciones a nivel de la región variable de la cadena pesada de las inmunoglobulinas, ubicada a nivel de 14q32, ha hecho factible dividir a la LLC en dos grupos de acuerdo con el nivel de homología respecto de la línea germinal: mutados (M) (< 98%), asociados con mejor pronóstico, y no mutados (NM) (= 98%), relacionados con peor evolución clínica.^7-9 Por otra parte, los estudios citogenéticos han permitido detectar alteraciones clonales en un 40% a 50% de los casos, con repercusiones adversas en la evolución clínica de los pacientes.^10,11 En tanto que la utilización de la técnica de FISH (fluorescence in situ hybridization), ha hecho factible detectar rearreglos genómicos en el 80% de los casos, así como el establecimiento de grupos de riesgo de valor pronóstico.^12,13 En este aspecto encontramos la deleción monoalélica de 13q14, la anomalía más frecuente, observada en aproximadamente el 55% de los pacientes, asociada con buen pronóstico cuando se encuentra como única alteración; las deleciones de 11q22 (10%), donde se encuentra ubicado el gen ATM (ataxia telangiectasia mutated), y de 17p13 (5% a 8%), que involucra al gen TP53 (Tumor Protein P53), relacionadas con mala evolución clínica y escasa respuesta al tratamiento, así como la trisomía del cromosoma 12 (16%), asociada con un pronóstico intermedio.

Más recientemente, estudios de secuenciación de última generación (NGS; next generation sequencing) permitieron la detección de mutaciones somáticas previamente desconocidas en esta enfermedad, que podrían explicar, en parte, la amplia variabilidad clínica observada en estos casos y las respuestas disímiles a la terapia.^14-16 Entre ellas cabe mencionar las observadas en el gen NOTCH1 (neurogenic locus notch homolog protein 1), que posee un papel crítico en funciones como proliferación, diferenciación y apoptosis, y cuya desregulación se asocia con el desarrollo tumoral.^17,18

 
Características del gen NOTCH1

El gen NOTCH1 se encuentra ubicado a nivel de 9q34.3, y presenta 34 exones que abarcan 50 kb (Figura 1.A). Este gen codifica para un receptor transmembrana, que es sintetizado a partir de un único precursor y clivado por una convertasa en el aparato de Golgi. El receptor maduro posee un dominio extracelular (EC), conformado por 36 repeticiones del epidermal growth factor (EGF)-like-repeat, 3 repeticiones que poseen residuos de cisteína (LNR), un dominio de heterodimerización (HD) y una porción transmembrana (TM) seguida de un dominio intracelular (IC) (Figura 1.B). La activación de NOTCH1 ocurre cuando uno de sus dos ligandos, SERRATE/JAGGED o DELTA, expresados en una célula adyacente, se une al receptor. Dicha unión induce un cambio conformacional en TM, lo que permite un primer clivaje, el cual es realizado por la desintegrasa ADAM metalopeptidasa, que se encuentra localizada en el espacio extracelular, lo que provoca la liberación del dominio EC. Luego se produce un segundo clivaje por una gamma-secretasa, que determina la liberación del dominio IC, el cual es translocado al núcleo, donde desplaza al complejo CSL (CBF1/supresor de Hairless/Lag-1)-represores transcripcionales y se une al factor de transcripción RBP-Jk (human J kappa recombination signal sequence binding protein) para regular la expresión de varios genes blanco.^17,19-21






A la fecha se conocen solo algunos genes blanco de NOTCH1. Entre ellos encontramos dos familias: HES (Hairy enhancer of Split) y HEY (Hairy/enhancer of spit related with YRPW motif), cuyas proteínas son factores de transcripción helix-loop-helix que actúan como represores transcripcionales. También se conocen distintos genes blanco de la vía se señalización de NOTCH1, como ciclina D1, c-MYC, p21, p27, TK, mTOR y VEGE, entre otros, algunos de los cuales son dependientes de la señalización de NOTCH1 en varios tejidos, mientras que otros son específicos de tejido.²² Inicialmente, NOTCH1 fue considerado esencial para dirigir el compromiso de linaje de las células T a expensas del desarrollo de las células B, lo que demostró su potencial oncogénico en la leucemia de células T.^23,24 Posteriormente, se encontró alterada la vía de NOTCH1 en numerosos tumores sólidos y neoplasias hematológicas.²⁵ En un estudio pionero se demostró que las células de LLC expresan altos niveles del receptor NOTCH1 y de sus ligandos JAGGED1 y JAGGED2. En este aspecto, resulta de interés señalar que las células del estroma de los ganglios linfáticos también expresan JAGGED1, que induce la activación de NOTCH1, sustentando que una actividad aberrante de este gen podría contribuir a la aparición de la LLC.²⁶ También se detectó que NOTCH1 podía estar constitutivamente activo, contribuyendo a la supervivencia de las células que lo expresan y confiriendo resistencia a la apoptosis.¹⁷

 

Mutaciones de NOTCH1 en la LLC

Las mutaciones de NOTCH1 se acumulan en mayor medida en el exón 34 y constituyen fundamentalmente eventos de corrimiento del marco de lectura y cambios sin sentido.²⁴ La mutación más frecuente en los pacientes con LLC es una deleción de 2-pb (c.7541_7542het_delCT) en el exón 34 (80% de los casos), que afecta al extremo C-terminal, donde se encuentra localizado el dominio PEST (secuencia rica en prolina-glutamato-serina-treonina).^27,28 En el año 2015, Puente y col.²⁹ informaron una segunda mutación en la región 3´UTR (3'untranslated region). Las mutaciones más comunes de esta región no codificante ocurren principalmente en las posiciones 7668 371A>G y 7668 378A>G, y en forma menos frecuente en 7668 380A>C. Estas variantes crean un nuevo sitio de aceptación del corte y empalme (splicing), lo que favorece un evento de corte y empalme alternativo con un dador críptico en el exón 34.³⁰ En ambos casos se genera la aparición de codones de terminación (stop) prematuros que originan una proteína NOTCH1 constitutivamente activa y más estable, que carece del dominio PEST en el extremo C-terminal, responsable de la degradación proteasomal.^31,32 Esta activación de NOTCH1 aumenta, entre otros, la actividad del factor nuclear kappa B (NF-?B), cuya sobreexpresión tiene un papel crítico en la patogénesis de la LLC, promoviendo la proliferación y la supervivencia de las células leucémicas.³³

NOTCH1 es el gen más comúnmente mutado en la LLC al momento del diagnóstico, y su frecuencia aumenta con la progresión de la enfermedad, por lo que es considerado un gen clave en la LLC, cuyas alteraciones probablemente representen un proceso oncogénico novedoso en esta entidad.²⁴ Dichas mutaciones ocurren en un 5% a 10% de los pacientes al diagnóstico, con un incremento en la frecuencia que alcanza el 15% al 20% en los casos resistentes al tratamiento con fludarabina, llegando a aproximadamente el 30% en los casos que presentan transformación a síndrome de Richter,^31,34-36 lo que indica una relación entre la desregulación de NOTCH1 y la respuesta al tratamiento. Asimismo, NOTCH1 mutado ha sido detectado en solo el 3% de los casos con linfocitosis B monoclonal,³⁷ entidad asintomática que puede preceder la aparición de LLC. En estudios que emplearon NGS se ha observado la presencia de subclones con NOTCH1 mutado que se encuentran por debajo del límite de resolución de la técnica Sanger, lo que demuestra su papel en la progresión de la enfermedad y la refractariedad al tratamiento, lo que destaca la importancia de su detección.^38,39 Asimismo, la detección reciente de activación no mutacional de NOTCH1 en LLC,⁴⁰ sugiere una función más amplia de este probable marcador pronóstico en la enfermedad.

Las mutaciones de NOTCH1 se asocian con la presencia de trisomía del cromosoma 12 e IGHV-NM, lo cual genera mala evolución clínica con desregulación del ciclo celular y supervivencia breve de los pacientes,^27,32,36,41 lo que sugeriría un papel crítico de la activación de dicho gen en estos pacientes.⁴² Asimismo, el análisis de la distribución de mutaciones en pacientes con receptores de células B de alta homología, denominados estereotipados, permitió detectar mayor frecuencia en los casos correspondientes a los subconjuntos #1, #6, #8 y #59 (22% a 34%), caracterizados por su agresividad clínica,⁴³ lo que sugiere la función potencial de estos BCR estereotipados en la promoción o selección de mutaciones que influencian la evolución de la LLC.²⁴

Considerando los diferentes regímenes de tratamiento, se observó peor evolución clínica en los casos tratados con una inducción de rituximab seguida de consolidación.⁴⁴ Diferentes estudios demostraron menor tiempo al primer tratamiento y una supervivencia más corta en los pacientes que presentaban NOTCH1 mutado respecto de los tipos salvajes,^31,45 resultados que fueron confirmados en estudios más recientes.^46-48 Sin duda, la introducción de los nuevos regímenes de tratamiento que incluyen fármacos que actúan a nivel de las vías de señalización del BCR o de BCL2 ha beneficiado a estos pacientes, mejorando su respuesta al tratamiento.^49,50 Asimismo, resulta de interés señalar que los casos con NOTCH1 mutado muestran baja expresión de CD20, resistencia a la inmunoterapia con anticuerpos anti-CD20 y pronóstico adverso,^44,51 lo que sugiere la importancia de evaluar la presencia de estas mutaciones antes de la inclusión de pacientes en protocolos de tratamiento con este anticuerpo.

En cuanto a nuestra experiencia, al presente hemos analizado 90 pacientes con LLC (34 mujeres y 56 hombres; media de edad 65.4 años, rango: 44-82 años; con la siguiente distribución de estadios clínicos:⁵² 0: 36.2%, I-II: 38.3% y III-IV: 25.5%). El estudio fue evaluado y aprobado por el Comité de Ética de los Institutos de la Academia Nacional de Medicina. Las muestras fueron tomadas con la conformidad y el consentimiento informado de los pacientes. En todos los casos se efectuó extracción de ADN genómico a partir de células mononucleares de sangre periférica, con el empleo de la técnica de ASO-PCR para la detección de la mutación c.7541_7542delCT. En una proporción de casos se realizó secuenciación bidireccional para confirmar la mutación. La reacción de PCR fue llevada a cabo con 3 primers distintos: uno inverso común Notch1_Rv (5'- AAGGCTTGGGAAAGGAAGC-3') y dos primers hacia adelante: Notch1_Fw C (5'-GTGACCGCAGCCCAGTT-3'), que amplifica tanto el alelo de tipo salvaje como el mutado, generando productos de 283 pb y 285 pb, respectivamente, y un primer Notch 1_Fw Mut (5'- TCCTCACCCCGTCCCGA-3'), que amplifica un segmento de 183 pb solo en presencia de la mutación.⁵³. Asimismo, se efectuó en estos pacientes el estudio citogenético y citomolecular con el fin de evaluar la presencia de anomalías cromosómicas recurrentes en la LLC, así como el análisis del estado mutacional de IGHV, utilizando metodologías previamente descriptas.^54,55

Nuestra cohorte mostró 4/90 (4.4%) casos con NOTCH1 mutado (Figuras 2.A y 2.B). Tres de estos pacientes presentaron IGHV-NM con 100% de homología con la línea germinal, y solo uno fue mutado con 92.7% de homología (Tabla 1). El caso 1 presentó un cariotipo complejo portador de las trisomías 12 y 16 y la pérdida del cromosoma 20. El caso 4 fue analizado en dos oportunidades, mostrando en ambos casos un cariotipo complejo, con múltiples anomalías estructurales y evolución clonal, tanto a nivel citogenético como citomolecular. Al momento de la primera muestra se observó que no poseía mutación en NOTCH1, que sí fue observada en el segundo estudio efectuado luego de 30 meses de evolución, lo que indica la presencia de evolución clonal también a nivel molecular. Este paciente presentó, además, mutación del gen TP53, asociación que ha sido descripta en el 1.2% al 2.6% de los casos.^51,56












Sin duda, la incorporación del estudio de nuevas mutaciones, como NOTCH1, a la caracterización genética de los pacientes con LLC permitirá refinar la categorización de los grupos de riesgo citogenético, permitiendo la reclasificación de aproximadamente un 20% de casos de bajo riesgo. De acuerdo con el modelo integrado de alteraciones por FISH y mutaciones,⁵⁷ los pacientes con NOTCH1 mutado pertenecen al grupo de riesgo intermedio, lo cual corresponde aproximadamente al 15% al 20% de los casos recién diagnosticados, con un 37% de supervivencia a 10 años. Esta posibilidad de recategorizar a los pacientes resulta de suma importancia en el seguimiento clínico, así como en la toma de decisiones terapéuticas, sobre todo teniendo en cuenta que las mutaciones de NOTCH1 son consideradas eventos tempranos en la aparición de la LLC.³⁸ Dado que, a pesar de los avances a nivel terapéutico, la LLC continúa siendo una enfermedad incurable, la profundización de su caracterización genética es de suma importancia en el camino al desarrollo de nuevos agentes capaces de inhibir la actividad de NOTCH1,⁵⁸ incrementando la actividad antitumoral sobre las células leucémicas.

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