Activation of osteogenic Wnt/beta-catenine pathway by strontium salts in osteoblastic cells

Abstract
Bone remodeling consists of coupled activities of bone resorption and formation, existing a balance between osteoblasts and osteoclasts activities in order to regulate osteogenesis. However, the mechanisms that regulate this process remain still unknown. The objective of this study was the in vitro analysis of the effect of different strontium and calcium salts in bone formation, mainly in the canonical Wnt/beta-catenin signaling pathway. Materials and methods: MC3T3-E1 murine preosteoblasts were stimulated with strontium (Sr) salts (chloride, hydroxide and ranelate) and calcium chloride. Assays of proliferation, mineralization and determination of differentiation markers were carried out at different times and stimulus concentrations. The levels of beta-catenin protein and the expression of components of the Wnt pathway were determined. Intracytosolic calcium and strontium levels were quantified. Results: This study demonstrated the active role of strontium in cell proliferation, being SrRn the most potent inducer of mineralization and differentiation. SrRn activates the Wnt/beta-catenin canonical pathway, inducing the translocation of beta-catenin to the nucleus and regulating the genes expression of the pathway components (Wnt1 and LRP5). In addition, Sr penetrates into the cell cytoplasm more efficiently when it is bound to ranelate, regulating intracellular calcium levels. Conclusions: SrRn has been shown as the most potent inducer of osteogenesis, producing changes in the activation of the Wnt/beta-catenin pathway mediated by Wnt1 and LRP5 genes. The biological processes regulated by SrRn are a very useful source of information about new molecular targets for therapeutic purposes.

Key words
osteogenesis, strontium ranelate, calcium, wnt, b-catenin

Artículo completo
Introducción

El tejido óseo de nuestro esqueleto se forma durante el crecimiento y se mantiene durante la vida adulta por una continua renovación de la matriz ósea, a través de lo que se conoce como remodelado óseo. En él participan dos tipos celulares: los osteoclastos, que son las células que actúan durante la resorción ósea, y los osteoblastos que, por el contrario, son las células formadoras del hueso. Durante el crecimiento, la formación ósea excede a la resorción y como resultado hay una aportación positiva. Mientras que en el envejecimiento se produce un desequilibrio que resulta en un balance óseo negativo.¹ La renovación ósea está ligada al inicio aleatorio de procesos de resorción, donde la diferenciación y activación de los osteoblastos sigue a la de los osteoclastos. Por tal motivo, se ha puesto tradicionalmente más énfasis en conocer la biología y regulación de los osteoclastos, cuyo conocimiento es más completo que el de las células osteoformadoras. Sin embargo, existe una fuerte asociación entre ambos mecanismos, que lleva a que el control de los procesos de osteoformación, ligados a la actividad de los osteoblastos, esté influido por muchos mediadores liberados durante la resorción ósea.²

La observación de disfunciones esqueléticas asociadas con alteraciones de tipo hereditario, junto con hallazgos en modelos animales modificados genéticamente, han aportado conocimiento sobre sistemas reguladores cuya implicación en el metabolismo óseo no se hubiera sospechado. Éste es el caso de sistemas moduladores tales como Wnt (wingless).² Wnt es un conjunto de 19 proteínas de secreción, con funciones determinantes en el crecimiento, diferenciación y muerte celular. A nivel óseo, su vía canónica de actuación, llamada Wnt/ß-catenina, define un sistema clave para la diferenciación de preosteoblastos a osteoblastos maduros. La asociación de Wnt/ß-catenina con el hueso procede, entre otros hallazgos, a la presencia de mutaciones en la proteína 5 relacionada con el receptor de lipoproteína de baja densidad (LRP5) con variaciones en la pérdida o ganancia de masa ósea según las mutaciones detectadas.³ LRP5 actúa como correceptor de varias proteínas del sistema Wnt como Wnt1 o Wnt3a, las cuales se unen al receptor putativo Frizzled para activar la cascada Wnt. El complejo ternario resultante estabiliza la proteína ß-catenina que se acumula en el interior de la célula y se transloca al núcleo activando genes diana de la osteogénesis.^4-7

Numerosos estudios que utilizaron concentraciones variables de calcio (Ca) han demostrado la capacidad de este catión para inducir la activación de células óseas.^8,9 En este sentido, el estroncio (Sr) es un catión muy cercano al Ca en la tabla periódica, y también ha demostrado acciones farmacológicas sobre el metabolismo óseo.^10,11 En ciertos modelos experimentales estimula la osteoblastogénesis, lo que ha despertado interés sobre las vías capaces de promover la formación ósea.

A pesar de los efectos positivos del Sr en el hueso, los mecanismos moleculares y celulares subyacentes todavía no se conocen por completo, por lo que resulta particularmente atractivo el estudio del Sr como un posible agente estimulador de la vía canónica Wnt/ß-catenina en un contexto de la osteogénesis. La hipótesis de este trabajo consiste en que la activación de la ruta osteogénica Wnt depende de la sal de Sr con la que se efectúe el estímulo, y en que el Sr es un activador osteogénico más potente que el Ca. Los resultados encontrados en este trabajo muestran diferencias en los efectos desencadenados en osteoblastos por las diferentes sales de Sr, destacando la importancia del ácido ranélico en las acciones osteoformadoras.

Materiales y métodos
Cultivos celulares y tratamientos

Se empleó la línea celular preosteoblástica murina MC3T3-E1 (subclon 4) (ATCC® CRL-2593^TM, Sigma-Aldrich, St. Louis, EE.UU.). Las células se mantuvieron en medio de cultivo compuesto por Alpha Minimun Essential Medium suplementado con 10% de suero bovino fetal, 2 mM L-glutamina, 100 U/ml penicilina y 100 µg/ml estreptomicina (Invitrogen, CA, EE.UU.) en una estufa de incubación a 37ºC y atmósfera húmeda de 5% CO₂. Para la realización de los ensayos, las células fueron crecidas hasta una confluencia de 60%-70%. Antes de cualquier estímulo, se mantuvieron durante 24 horas en medio con 2.5% de suero bovino fetal. Tras este período, se trataron con ranelato de estroncio (SrRn, AK Scientific Inc, EE.UU.), cloruro de estroncio (SrCl₂), cloruro cálcico (CaCl₂), e hidróxido de estroncio (Sr(OH)₂) (Sigma-Aldrich) en una concentración de 2 mM durante los tiempos especificados en cada experimento. Los estímulos se prepararon en el medio de crecimiento de las células. Para tratamientos prolongados, 50% del medio de cultivo se renovó y se añadió el tratamiento correspondiente cada tres días.

Ensayo de proliferación celular

Las células se sembraron en una placa de 96 pocillos (4 x 10³ células/pocillo) y se incubaron durante 48-72 horas con los estímulos ya descriptos, a una concentración final de 2 mM. La proliferación celular se midió con el ensayo Cell Proliferation ELISA II (XTT-assay, Roche Applied Science, Mannheim, Alemania) siguiendo las instrucciones del fabricante. La absorbancia se midió a 450 y 650 nm a 37ºC en un lector de placas Victor™X3 2030 Multilabel Reader (Perkin Elmer, Massachusetts, EE.UU.).

Ensayo de mineralización

La mineralización celular se cuantificó utilizando rojo alizarina (ARS, Sigma-Aldrich), un colorante orgánico capaz de unirse a depósitos de calcio de las células. Se emplea como marcador de la capacidad de formación de la matriz calcificada.¹² Las células MC3T3-E1 se sembraron en placas de seis pocillos y se sometieron a los tratamientos descriptos, a una concentración final de 0.2 y 2 mM durante 7, 14 y 21 días. Las células se lavaron con buffer fosfato (PBS) y se fijaron con 10% paraformaldehído (Sigma-Aldrich) 15 minutos y se trataron con solución de ARS (40 mM; pH 4.1) durante 20 minutos a temperatura ambiente. Para el estudio cuantitativo, se añadió ácido acético 10% (Sigma-Aldrich) durante 30 minutos; posteriormente, se recogió la suspensión celular y se incubó a 85ºC durante 10 minutos seguido de 5 minutos en hielo, se recogió el sobrenadante tras centrifugar 5 minutos a 20 000 g y se le añadió hidróxido de potasio al 10%. Finalmente se determinó la intensidad de la fijación de ARS midiendo la absorbancia a 405 nm en el lector de placas Victor™X3 2030 Multilabel Reader.

Marcadores de diferenciación osteoblástica

La diferenciación celular, se determinó cuantificando los niveles de osteocalcina (OCN) y fosfatasa alcalina (ALP). Las células se sembraron en placas de 96 pocillos y se sometieron a los estímulos a 2 mM durante 3, 7, 14 y 21 días. Los cultivos se lavaron con PBS, se recogieron con Tritón X-100 0.1%-PBS y se sonicaron a 4ºC. Tras centrifugar a 4ºC a 20 000 g durante 5 min, la OCN se cuantificó en el sobrenadante de las células empleando el kit Osteocalcin ELISA (DRG Diagnostics, Marburg, Alemania), siguiendo las instrucciones del fabricante y se cuantificó la absorbancia a 450 nm en el lector de placas.
La actividad ALP se determinó en el sobrenadante mediante el ensayo ALP Reagent (Thermo Scientific, Massachusetts, EE.UU.), siguiendo las instrucciones del fabricante. Se determinó la absorbancia a 405 nm y 660 nm a 37ºC cada min durante 10 min en el lector de placas. En todas las determinaciones se utilizó el lector Victor™X3 2030 Multilabel Reader.
La concentración de proteína se determinó mediante el método colorimétrico de Bradford (BioRad, Hemel Hempstead, Reino Unido). La actividad ALP se expresa en µg de producto formado por minuto de reacción sobre la cantidad de proteína presente en el sobrenadante (U/mg).

Análisis mediante Western blot
Los extractos proteicos totales se obtuvieron de las células tratadas con 2 mM de los estímulos durante 15, 30, 45 y 60 minutos se homogeneizaron en buffer de lisis (50 mM Tris-HCl pH 7.4; 150 mM NaCl y 0.5% Nonidet P-4) al que se añadieron inhibidores de fosfatasas (1 mM ortovanadato sódico, 10 mM NaF) y proteasas (10 µg/ml aprotinina, 10 µg/ml leupeptina, 100 µM PMSF, Sigma-Aldrich) y se centrifugaron a 16 100 g, a 4ºC. Para obtener las fracciones de proteínas nucleares y citoplasmáticas se empleó el kit NE-PER Nuclear and Citoplasmic Extraction Reagents (Fisher Scientific, Hampton, USA); 40 µg de proteína cuantificada mediante el ensayo Bradford se resolvieron en geles de 8-12% SDS-PAGE y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa (Hybond ECL, Fisher Scientific) con el equipo Trans Blot Turbo Transfer System (Biorad). Después del bloqueo (5% leche desnatada en polvo y 0.1% Tween 20 en PBS 1X), las membranas se incubaron con los anticuerpos primarios durante 16 horas: ß-catenina (1:2000, Santa Cruz Biotechnology, Oregon, EE.UU.), ?-ß-catenina (1:1000, Izasa, España), ß-actina (1:2000, Sigma-Aldrich, Saint Louis, EE.UU.) como referencia para cuantificar el nivel de expresión relativa de proteína y a-lamina A/C (1:2000, Cell Signaling) como marcador nuclear. Todos los lavados se realizaron con PBS-0.1% Tween 20. Los anticuerpos primarios se detectaron utilizando un anticuerpo anti-conejo acoplado a peroxidasa durante 1 hora (1:2000, Santa Cruz Biotechnology). Las proteínas se detectaron mediante quimioluminiscencia empleando ECL Detection Reagents (Fisher Scientific) en la cámara CCD LAS-3000 Imagen (Fujifilm).

Inmunofluorescencia

Los estudios de inmunofluorescencia se realizaron con las células sembradas sobre cubreobjetos tratados con fibronectina 0.1% (Sigma-Aldrich) y se trataron con 2 mM CaCl₂o SrRn durante 15, 30 y 60 minutos. Los cultivos se fijaron con paraformaldehído al 4% y se permeabilizaron con PBS-Tritón 0.1%. Las muestras se trataron con solución de bloqueo (3% albúmina sérica bovina (Sigma-Aldrich) en PBS 1X) y se incubaron con ß-catenina (1:200) durante 1 hora. La detección se realizó con un anticuerpo anti-conejo IgG-FITC 1 hora (1:1000, Santa Cruz Biotechnology). Las preparaciones se incubaron con Hoestch 5 µg/ml en PBS 1X (Invitrogen) y se montaron sobre portaobjetos empleando Slow Fade Gold antifade (Invitrogen). Para la visualización se utilizó un microscopio de fluorescencia (Nikon Eclipse E400). Se emplearon cubreobjetos incubados con anticuerpo secundario para establecer el ruido de fondo previo a la adquisición de imágenes. El procesamiento de las imágenes y la cuantificación de la intensidad de fluorescencia se llevó a cabo utilizando ImageJ 1.45v.

Aislamiento de ARN y Rt-PCR cuantitativa

Las células sembradas se trataron con SrRn en diferentes tiempos y concentraciones de estímulo. El ARN total se aisló con el reactivo Trizol (Invitrogen) siguiendo las instrucciones del fabricante y se comprobó la cantidad y pureza obtenida determinando la absorbancia a 260 y 280 en Nanodrop ND-100 (Thermo Fisher Scientific, Wilmington). Se utilizó el kit Maxima first strand cDNA Synthesis kit for RT-qPCR (Thermo Scientific) para la reacción de transcripción reversa (RT). Las reacciones de RT-PCR a tiempo real se llevaron a cabo en un 7500 Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems) utilizando sondas Taqman de la misma casa comercial: Ctnnbip (Mm00517812_m1), LRP5 (Mm01227476_m1), Wnt1 Mm01300555_g1 y GAPDH (Mm99999915_g1), esta última para normalizar la expresión de los genes.

Cuantificación del calcio y estroncio intracitosólico

Para estudiar la internalización del catión estroncio en las células, los cultivos se sometieron a los tratamientos durante tres días. El pellet celular se procesó en el Servicio de Espectrometría de Masas con fuente de Plasma de Acoplamiento Inductivo (ICP-masas de la Universidad de Valencia, Campus de Burjassot, Valencia, España). La medida del Ca² citosólico con Fura-2 se realizó como se describió previamente.¹³ Las células se sembraron sobre cubreobjetos de 24 mm, y se incubaron en una solución HCSS (Gibco, ThermoFisher Scientific) suplementada con 30 mM de glucosa, 0.06% de ácido plurónico y 5 µM Fura-2AM (Molecular Probes) durante 30 minutos a 37ºC. Después se lavaron con HCSS 30 mM de glucosa 2 mM CaCl₂ y se sometieron a los distintos tratamientos. La emisión de fluorescencia (510 nm) se analizó utilizando Metafluor para Leica desarrollado por Metamorph (Universal Imaging).


Análisis estadístico

Todos los análisis estadísticos se llevaron a cabo con el programa GraphPad Prism v5. Se determinó la distribución normal de los datos cuando fue necesario mediante la prueba estadística de Kolmogorov-Smirnov. Los experimentos se analizaron mediante la prueba de la t de Student. Los datos se expresan como la media ± la desviación estándar de triplicados, valor máximo y valor mínimo. El nivel de significación estadística se estableció en valores de p < 0.05, para todas las variables analizadas.

Resultados
El estroncio promueve la proliferación celular de preosteoblastos

Numerosos trabajos han descrito el papel del Sr como inductor de la replicación osteoblástica.^14-18 La Figura 1 A-B presenta el efecto de las diferentes sales estudiadas sobre la proliferación celular a 48 y 72 horas. Todos los estímulos indujeron significativamente la proliferación celular en comparación con el control, siendo el CaCl₂ el estímulo que produjo el mayor grado de proliferación (p < 0.001).





A las 48 horas (Figura 1A), el porcentaje de proliferación es ligeramente mayor tras el tratamiento con SrCl₂ con respecto al Sr(OH)₂ (p < 0.0225) y SrRn (p = 0.0304). Mientras que a las 72 horas todas las sales de Sr produjeron un discreto pero significativo incremento en la proliferación celular respecto dell control (Figura 1B), sin encontrarse diferencias entre las sales. Estos resultados revelan un papel activo del Sr en la inducción de la proliferación celular.

El SrRn incrementa la mineralización y diferenciación celular

Es conocido que el Sr se incorpora a la matriz ósea,¹⁹ en este trabajo se evaluó el impacto de las sales de Sr y CaCl₂ en la capacidad de mineralización de preosteoblastos MC3T3-E1. Se observó un incremento de la mineralización de manera dependiente del tiempo y de la concentración del estímulo (Figura 1C). Luego de tres días de tratamiento, en ningún caso se detectó mineralización (datos no mostrados). Sin embargo, a partir de los siete días de tratamiento, se produjo un aumento significativo de la mineralización inducida por SrRn con respecto al control (p = 0.0317) y un efecto leve de las otras sales (Figura 1D), incremento que se mantuvo tanto a los 14 días (datos no mostrados) como a los 21 días (p = 0.0317). Estos resultados confirman el mayor efecto del Sr sobre la mineralización celular cuando está unido a ranelato.
Tanto ALP como OCN son marcadores de diferenciación osteoblástica, y un incremento en su actividad y expresión, respectivamente, se considera indicador del aumento de actividad de osteoblastos maduros. Para determinar el incremento de actividad osteoblástica inducida por los tratamientos, se analizaron los niveles de actividad ALP (Figura 1E) y concentración OCN (Figura 1F) a 3, 7, 14 y 21 días. La actividad ALP fue mayor en las células tratadas en todos los tiempos estudiados respecto del control (Figura 1E). Se observó una disminución de la actividad ALP a los siete días de tratamiento para luego incrementar nuevamente su actividad, excepto con la sal SrRn, con la que se observa una actividad inferior respecto al control. El SrRn produjo una reducción progresiva en el tiempo de la actividad ALP (Figura 1E).
En la Figura 1F se representa la concentración de OCN en los cultivos celulares sometidos a los diferentes tratamientos. Se observó un incremento de la concentración OCN en los sobrenadantes de las células tratadas con respecto al control en función del tiempo. Este incremento fue mucho más evidente en las células tratadas con SrRn, detectándose el máximo a los 21 (Figura 1F). Por el contrario, la sal Sr(OH)₂ parece ser menos efectiva en inducir la expresión de OCN.

Estos resultados indican que el SrRn promueve una mayor diferenciación osteoblástica definida por los niveles de OCN, y sugieren el distinto comportamiento a nivel intracelular del catión cuando se encuentra en su forma ranélica.

El SrRn promueve la translocación de ß-catenina

Existen pocos estudios sobre las rutas osteogénicas en las que participa el Sr, puesto que sólo un estudio ha propuesto la relación del Sr con la señalización Wnt, en el cual han utilizado ranelato de sodio (Na₂Rn) y SrCl₂ para constituir la molécula.¹² Para estudiar el efecto del SrRn sobre la vía de Wnt se realizó un análisis mediante Western blot de las fracciones subcelulares utilizando los anticuerpos ß-catenina y ?-ß-catenina (Figura 2A). El tratamiento con CaCl₂ produce un incremento inicial de ß-catenina nuclear a 15 minutos que coincide con la disminución de ?-ß-catenina en el citosol, manteniéndose los niveles con poca variación hasta 60 minutos (Figura 2A, panel derecho). Por el contrario, la fracción nuclear de ß-catenina se incrementa tras el tratamiento con SrRn de manera progresiva cada 15 minutos, coincidiendo con la reducción de los niveles de ?-ß-catenina citoplasmática (Figura 2A). Este efecto de traslocación nuclear de ß-catenina no se observó al tratar con las sales SrCl₂ y Sr(OH)₂ (datos no mostrados). En ambos casos los niveles de ß-catenina citoplasmática se mantuvieron constantes.





La traslocación nuclear de ß-catenina mediada por SrRn se confirmó también mediante inmunofluorescencia (Figura 2B). La cuantificación de la intensidad de fluorescencia reveló que la ß-catenina nuclear incrementa en presencia de SrRn con respecto al control sin estímulo (Figura 2B, panel derecho) además de observarse un aumento de sus niveles con el tiempo de estímulo. Con la sal CaCl₂ y al igual que ocurre con Western blot, hay un incremento inicial de ß-catenina nuclear, pero este incremento no se mantiene con el tiempo de tratamiento sino lo contrario, a 60 min se reduce con respecto al control (Figura 2B). Estos resultados revelan que el SrRn promueve la activación continuada de la vía de Wnt/ß-catenina en preosteblastos murinos, ya que la defosforilación de ß-catenina permitiría su liberación del complejo de degradación en el citoplasma, favoreciendo así su traslocación nuclear.

El SrRn activa la vía Wnt/ß-catenina

Para profundizar en el mecanismo molecular mediante el cual SrRn induce la activación de la vía de Wnt/ß-catenina, se estudió si la traslocación nuclear de ß-catenina se acompaña con cambios en la expresión de genes que participan en esta cascada de señalización (Figura 3). No se observaron cambios en la expresión de ß-catenina hasta después de 24 horas de tratamiento (Figura 3A), tiempo en el que se observó una reducción significativa de la expresión de ß-catenina (p = 0.0021). Estos hallazgos apuntan que la traslocación nuclear de ß-catenina no se regula vía el aumento de su expresión, sino que, a tiempos prolongados, el SrRn promueve la estabilidad del ARN-m de ß-catenina e inhibe su degradación.





En paralelo se estudió la expresión del ligando Wnt1 a diferentes tiempos y dosis de tratamiento. Se observó un pico de expresión de Wnt1 después de tres horas de tratamiento (p = 0.0016) (Figura 3B), encontrando además que a ese tiempo el efecto del SrRn sobre dicho ligando es dependiente de la dosis y significativo en todos los casos (Figura 3C). Estos resultados revelaron que SrRn activa la cascada Wnt a tiempos breves y dosis bajas de tratamiento vía el ligando Wnt1. El máximo de expresión de Wnt1 se observó a las tres horas de estímulo, y analizamos si este cambio iba acompañado también de un cambio de expresión de LRP5, correceptor de Wnt. Se observó un incremento estadísticamente significativo de la expresión LRP5 (Figura 3D) dependiente de la concentración de estímulo. Estos resultados sugieren que el SrRn actúa a través del ligando Wnt1 y del receptor LRP5 para activar la cascada de señalización Wnt/ß-catenina.

El estroncio penetra en las células cuando se encuentra en forma de sal ranélica y regula los niveles de calcio intracelular

Poco se sabe del mecanismo de internalización del ión Sr al citosol, puedeo ingresar directamente a la célula o bien el efecto de activación que se observa es debido a una acción externa. Por tal motivo, se determinaron los niveles de Sr intracelular en preosteoblastos murinos tratados con las distintas sales de Sr durante tres días mediante espectrometría de masas. Los resultados revelaron que hay una mayor detección de Sr en el citoplasma de las células cuando se administra en forma de ranelato (Figura 4A) en comparación de las otras sales estudiadas. Se confirmó además que el SrRn penetra en las células regulando los niveles de Ca intracelular (Figura 4B) mediante microscopia utilizando la sonda Fura-2. Como se observa en la imagen, el tratamiento con SrRn reduce los niveles de Ca intracelular, que se restablecen al añadir CaCl₂. Además, el tratamiento con SrCl₂ o SrOH₂ no produce variaciones en los niveles de calcio intracelular (Figura 4B). Estos hallazgos confirman nuevamente que el catión Sr unido al anión ranelato es responsable de los efectos de activación de la osteogénesis y que el ácido ranélico influye en la eficiencia de internalización en preosteoblastos, sugiriendo que esta introducción es fundamental para desencadenar los eventos celulares.






Discusión

El SrRn es un agente antirresortivo aprobado en Europa para el tratamiento de osteoporosis grave en mujeres posmenopáusicas con alto riesgo de fractura vertebral y de cadera que no pueden tolerar otros agentes antiosteoporóticos. Además, se recomienda su uso para tratar la osteoporosis en hombres con alto riesgo de fractura. Sin embargo, su mecanismo de acción no está claro todavía. Numerosos ensayos clínicos han mostrado que el Sr mejora significativamente la calidad ósea e incrementa la fuerza ósea a través de cambios en las propiedades de la matriz del hueso y la densidad mineral.^20,21 Estudios in vitro confirman la regulación mediada por Sr en la osteogénesis, mostrando que inhibe la resorción ósea inducida por osteoclastos, así como la activación y diferenciación de los mismos²²y que estimula la proliferación y diferenciación de preosteoblastos y la subsecuente función formadora de hueso mediada por estas células. El Sr también promueve la formación de nódulos similares a los de los huesos largos en cultivos osteogénicos y acelera la adquisición del fenotipo osteoblástico en células preosteoblásticas.²³ Esta molécula resulta un atractivo modelo para estudiar y entender los mecanismos de osteoformación, área que no ha sido muy explotada hasta la fecha. El avance en el conocimiento de los mecanismos moleculares que desencadenan la osteogénesis nos conduciría a nuevas dianas moleculares con potencial desarrollo de fármacos más efectivos, siendo este el objetivo principal de nuestro trabajo de investigación.
En este estudio se ha comparado el efecto de tres sales de Sr diferentes sobre preosteoblastos murinos MC3T3-E1, utilizando CaCl₂ como control de efecto positivo. Nuestros resultados demuestran que el Sr promueve la proliferación y diferenciación celular, así como la mineralización, pero su efecto es dependiente del anión al que está unido (Figura 1 A-F). La mineralización de la matriz ósea es el evento final de la osteogénesis.²⁴ En el medio de cultivo utilizado para el crecimiento de las células osteoblásticas está presente el fosfato orgánico, lo que nos permite estudiar la formación de depósitos minerales que contienen hidroxiapatita.²⁵ Entre los compuestos estudiados, el Sr unido al ranelato resultó ser el más potente inductor de la mineralización en comparación con las otras sales de Sr e incluso la de Ca, utilizada como control positivo de mineralización (Figura 1C y 1D). Este proceso estuvo acompañado por un discreto incremento de la actividad ALP asociado con el fenotipo de osteoblastos (Figura 1E). Sin embargo, la mayor actividad ALP se observó con el Sr unido tanto al cloruro o hidróxido, mostrando la variabilidad de la acción del catión según el soporte aniónico que lo acompañe. Es importante destacar que las células usadas en este estudio han sido ampliamente caracterizadas y resultan un excelente modelo para estudios de mineralización, pero presentan una baja expresión de ALP. Se han caracterizado otros subclones de la misma línea celular que tienen una elevada actividad ALP y no tienen capacidad mineralizante.²⁶ Además, es bien conocido que se necesita poca actividad ALP (0.05 U/mg) para obtener fósforo inorgánico in vitro.²⁷ Se ha observado que las células mesenquimales de médula ósea, con baja actividad ALP, fueron capaces de mineralizar.²⁸ Por lo tanto, la actividad ALP observada en las muestras estimuladas con SrRn sería suficiente para producir una matriz de mineralización. Esto último quedó demostrado con la inducción de la formación de focos mineralizados que progresó en los tiempos estudiados de 0, 7 y 21 días. Otros experimentos realizados con estímulos con ácido ascórbico necesitaron tiempos más prolongados para detectar focos de mineralización, de 2 a 3 semanas,²⁷ demostrando la eficacia de la acción del SrRn. Acorde con nuestros resultados, la OCN también incrementó con el tiempo de estímulo y fue dependiente del tipo de sal, detectándose los máximos valores con SrRn en todos los tiempos estudiados (Figura 1F). La OCN es una proteína no colágena de 5kDa, característica del hueso, producida únicamente por células de estirpe osteoblástica, y se relaciona con el proceso de mineralización ósea.²⁹ Después de su síntesis, la mayor parte se incorpora a la matriz extracelular del hueso, pero pequeñas cantidades se liberan a la circulación considerándose un marcador de formación y recambio óseo.^30-32 Bakker y colaboradores han informado, además, que la OCN reduce la osteoclastogénesis 1.9 veces. Este resultado demuestra la existencia de señales paracrinas entre osteoclastos y osteoblastos afectados positivamente por sales de Sr.³³ Puesto que el elevado grado de mineralización observado y el aumento de biomarcadores de osteoformación (OCN y ALP) sólo los pueden ocasionar osteoblastos maduros, la sal SrRn resultó un excelente modelo para estudiar los procesos moleculares que desencadenan la osteogénesis o formación ósea.
En la última década se han sugerido algunos mecanismos del Sr que inducen la osteogénesis.³⁴ Uno de los mecanismos está relacionado con la activación de la ruta ERK. La segunda hipótesis es que el Sr puede inhibir la resorción ósea incrementando la osteoprogesterina (OPG) y decreciendo la activación del ligando del factor nuclear kappa- ß (RANKL) por los osteoblastos. La OPG es una proteína que inhibe RANKL, necesario para la activación y diferenciación de osteoclastos ocasionando la degradación ósea.³⁴ El tercer mecanismo es que por su similitud al Ca, el Sr podría ser capaz de activar al receptor sensor del calcio (CaSR), resultando en la producción de inositol-1,4,5, trisfosfato (IP3) desencadenado la cascada MAPK con la replicación osteoblástica. Sin embargo, se ha descrito que ratones knockout [CaSR(-/-)] y la forma salvaje [CaSR( / )], han presentado un incremento de la replicación y diferenciación de osteoblastos en presencia de sales de Sr.³⁵ Tal vez, esta última cascada de señalización, ha sido la más extensamente estudiada por los investigadores. Lo que indica que el Sr actuaría también de forma independiente al CaSR, existiendo otros mecanismos de acción. Nuestro trabajo demuestra la activación de la vía Wnt/ß-catenina en presencia de la sal SrRn (Figuras 2 y 3). Detectamos mediante Western blot e inmunofluorescencia la traslocación nuclear de ß-catenina desfosforilada cuando el Sr está unido al ácido ranélico, actuando a través del ligando Wnt1 y el receptor LRP5 (Figuras 2 y 3). Estos resultados demuestran no solo que el SrRn es mejor activador que el CaCl₂ de la mineralización y diferenciación osteoblástica (Figura 1), sino que a diferencia del SrRn, el CaCl₂ no promueve la translocación nuclear de ß-catenina (Figura 2). Estos hallazgos sugieren que los efectos de la sal SrRn pueden deberse, también, a mecanismos de acción independientes de CaSR, a diferencia de otros trabajos.³⁶ Otros autores utilizaron para obtener la sal SrRn una combinación de Na₂Rn con SrCl₂,^37-39 en este trabajo hemos empleado una preparación de SrRn íntegra con un porcentaje de conjugación del 100%, similar a la que reciben las mujeres para el tratamiento de la osteoporosis. Por este motivo, estos resultados arrojan evidencias de la importancia del anión ranelato en los efectos osteogénicos que hasta la fecha se han atribuido únicamente al catión Sr.
El calcio es un catión abundante utilizado en numerosas cascadas de señalización celular en un amplio número de tipos celulares. Además, se ha observado que los osteoblastos presentan un elevado nivel de expresión de canales de calcio que son esenciales para la adecuada fisiología de estas células.⁴⁰ En la Figura 4A se observa que el Sr unido al ranelato penetra en el citoplasma celular de los osteoblastos de forma más efectiva que las otras sales, hallazgo que no había sido previamente descripto. Se desconocía que el Sr es capaz de internalizarse en el citoplasma celular, asumiendo que su acción era principalmente externa mediada por diferentes receptores de membrana como el CaSR. Esta incorporación desencadenaría un cambio en el flujo del Ca intracelular (Figura 4B). Se ha informado que el uso de inhibidores de canales de Ca como la nifedipina bloquea también la acción positiva del Sr en osteoblastos.⁴¹ Es necesario diferenciar entre la señalización mediada por Ca y el Ca como mineral. La concentración normal de Ca generalmente permanece entre 50 y 150 mM. La estimulación por agonistas del Ca o tratamientos farmacológicos que liberan Ca intracelular puede incrementar la concentración intracelular a niveles de 200-400 nM. Este aumento se mantiene durante algunos minutos hasta restaurar los niveles normales mediante diferentes bombas dependientes de ATP. Oscilaciones en los niveles de Ca están relacionadas con la estimulación de la secreción, transducción de señales, alteraciones en la expresión de genes, diferenciación celular y apoptosis. Mientras que el Ca como mineral se refiere al Ca² libre que se deposita en el tejido esquelético, y está asociado con un cambio en el pool extracelular, el Ca como señal está asociado con cambios en el pool intracelular.⁹ Ahora bien, en nuestros resultados se observa esto último, pero también se detecta la incorporación de Sr intracelular (Figura 4A), por lo que se requieren futuros estudios en esta dirección para conocer la posible interacción, competición o potenciación de estos cationes en las rutas moleculares que regulan la osteogénesis.
Finalmente, en un estudio realizado por nuestro grupo, en el que analizamos cambios de expresión génica global (microarray) utilizando una matriz que contiene 28 000 genes de ratón en células MC3T3-E1 estimuladas con 2 mM SrRn, hemos observado la activación de más de 1600 genes, siendo los procesos biológicos que cambian con mayor intensidad aquellos relacionados con la regulación de la transcripción, procesos metabólicos, transporte de moléculas y fosforilación-desfosforilación de proteínas, con muy pocos cambios en procesos que involucran muerte celular y daño al ADN.⁴² Esta información, junto con los resultados de este trabajo, abre nuevas ventanas de investigación para comprender mejor el proceso de osteogénesis.

Bibliografía del artículo
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