Treatment of global cerebral ischemia in Mongolian gerbils

Abstract
Ischemic stroke is a relevant health problem worldwide, but until now pharmacological treatments have not achieved a significant impact in the reduction of stroke recurrence at the same time that their use is associated with different adverse events, so the search for new therapeutic alternatives is a current problem. This study was aimed to compare the therapeutic efficacy of policosanol plus aspirin (ASA), policosanol plus atorvastatin and ASA on global cerebral ischemia in Mongolian gerbils. Gerbils were divided into 5 groups: a negative control (vehicle) without cerebral ischemia (CI) and 4 groups with CI: positive control (vehicle), policosanol (100 mg/kg) plus ASA (60 mg/kg), policosanol (100 mg/kg) plus atorvastatin (20 mg/kg), and ASA (60 mg/kg). All treatments were administered after CI induction. Clinical symptoms (CS), locomotion activity, histological score (HS) and plasma malondialdehide (MDA) and sulphidriles groups (GSH) were assayed. Policosanol plus ASA, policosanol plus atorvastatin, and ASA reduced significantly the CS (66.5%, 65.2%, and 56.5%, respectively), the hyper-locomotion (73.5%, 61.04% and 37.8%, respectively), the HS (44%, 44% and 35.9%, respectively). Both combined therapies significantly reduced MDA (77% and 78.2% inhibition, respectively) and GSH (55.2% and 60.3% inhibition, respectively) plasma concentrations, but ASA did not modify it. Therapeutic combination policosanol plus aspirin and policosanol plus atorvastatin similarly protected against cerebral ischemia in Mongolian gerbils, being slightly higher than aspirin monotherapy. Both combinations presented antioxidant effects, unlike monotherapy with aspirin, which gives them an additional benefit.

Key words
aspirin, atorvastatin, policosanol, cerebral ischemia, therapeutic combinations

Artículo completo
Introducción

El ictus isquémico es una enfermedad cerebrovascular que se presenta como complicación de la aterosclerosis y consiste en un déficit neurológico súbito debido a trastornos en la circulación sanguínea cerebral.¹ Representa la primera causa de discapacidad resultante, la segunda de demencia y la tercera de muerte en la población adulta mundial.^2-4

Del 15% al 30% de los pacientes que sobreviven al ictus isquémico padecen incapacidad permanente (parálisis parcial y dificultades con la memoria, razonamiento, lenguaje y movimientos), por lo que muchos requieren cuidados en instituciones médicas.^5,6

Cada año cerca de 15 millones de personas sufren un ictus y su tasa anual se incrementa dada la creciente expectativa de vida, calculándose que para el año 2020 se mantendrá entre las tres primeras causas de muerte tanto en los países desarrollados, como en aquellos en vías de desarrollo.^7,8 Por otro parte, se aprecia una nueva tendencia de aparición en edades más tempranas de la vida.⁹

Por tales motivos, el ictus isquémico constituye uno de los problemas más relevantes de salud a nivel mundial.

La estrategia terapéutica del ictus isquémico está dirigida a lograr una recuperación que reduzca la discapacidad resultante. La terapia farmacológica de primera línea ha sido el uso de agentes antiagregantes plaquetarios, los cuales disminuyen el riesgo de ictus al reducir las complicaciones trombóticas de la ateroesclerosis debido a la inhibición de la función plaquetaria, siendo la aspirina el agente terapéutico más ampliamente utilizado.^10,11 Sin embargo, hasta el presente, este tipo de agente solo ha alcanzado una reducción de la recurrencia de ictus isquémicos en un 15% a 20%,^12,13 y produce eventos adversos asociados con hemorragias de mayor o menor cuantía.¹⁴

Otra alternativa terapéutica en el tratamiento del ictus incluye las estatinas, fármacos hipolipemiantes que inhiben la enzima HMG-CoA reductasa. Esta clase terapéutica incluye la atorvastatina, cuyo uso reduce el riesgo relativo de la recurrencia de ictus en pacientes que han presentado un ictus reciente o ataque isquémico transitorio.¹⁵ Aunque de modo general es un fármaco bien tolerado, su uso se asocia con la aparición de eventos adversos como incrementos de los niveles séricos de las transaminasas y de creatina fosfoquinasa, así como mialgias y miopatías.¹⁶

El mecanismo antiisquémico de la atorvastatina es multifactorial e involucra no solo su capacidad para reducir los niveles séricos de colesterol, sino además efectos pleiotrópicos, entre los cuales sobresalen sus efectos antiinflamatorios,¹⁷ antioxidantes^18,19 y moderadamente antiagregantes.²⁰

Teniendo en cuenta que hasta el presente los tratamientos farmacológicos no han logrado un impacto relevante en la reducción de la recurrencia del ictus, al mismo tiempo que su uso se asocia con diferentes eventos adversos, la búsqueda de nuevas y diferentes alternativas terapéuticas constituye una problemática actual.

El policosanol, mezcla de alcoholes de alto peso molecular aislada y purificada de la cera de caña (Saccharum officinarum, L), presenta efecto hipolipemiante, antiagregante plaquetario y antioxidante demostrado en estudios experimentales y clínicos.^21-24 Además, ensayos experimentales previos han sugerido la eficacia del tratamiento preventivo del policosanol en los modelos de isquemia cerebral focal en un hemisferio por ligadura permanente de una arteria carótida y de isquemia cerebral global por ligadura y reperfusión de ambas carótidas,^25,26 mientras que un estudio más reciente mostró también su eficacia terapéutica y comparable con la atorvastatina en ese modelo.²⁷

Por otra parte, ha sido demostrado que la administración conjunta de policosanol y aspirina en un esquema de dosificación preventivo muestra ventajas en relación con las respectivas monoterapias en el modelo de isquemia cerebral unilateral en jerbos de Mongolia.²⁸ Tal ventaja de esta combinación ha sido corroborada en pacientes con ictus isquémico.²⁹

Sin embargo, hasta el presente no se han realizado estudios preclínicos que permitan conocer las posibles ventajas de la combinación de policosanol y aspirina con un esquema de tratamiento terapéutico, ni se ha comparado con otras combinaciones terapéuticas con potencial eficacia antiisquémica, como policosanol y atorvastatina.

El presente estudio tiene como objetivo comparar la eficacia terapéutica de las terapias combinadas con policosanol más aspirina y policosanol más atorvastatina con respecto a la monoterapia con aspirina en un modelo de isquemia cerebral global inducida por isquemia-reperfusión (I/R) en jerbos de Mongolia.


Materiales y métodos
Animales

Se utilizaron jerbos de Mongolia (Meriones unguiculatus) machos (60-80 g) provenientes del Centro Nacional para la Producción de Animales de Laboratorio, La Habana (CENPALAB), los cuales fueron adaptados durante siete días a las condiciones de laboratorio (temperatura de 20 a 25 °C, humedad relativa de 60 ± 5%, ciclos de luz/oscuridad de 12 horas) con libre acceso al agua y la comida. Los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con las normas cubanas para manejo de animales y el Código Cubano de Buenas Prácticas de Laboratorio. El comité de ética independiente del Centro aprobó el uso de animales y el protocolo de estudio.

Esta especie fue seleccionada porque es susceptible a la isquemia cerebral y ampliamente utilizada en la evaluación de sustancias en la isquemia cerebral.^30,31

Administración y dosificación

El policosanol (lote 031061211) obtenido en la Planta de Producción de Productos Naturales (CNIC, La Habana, Cuba), la atorvastatina (lote: 9612002, Laboratorios NOVATEC, La Habana, Cuba) y la aspirina (lote: 1011328, Laboratorios NOVATEC, La Habana, Cuba) se prepararon en suspensión en un vehículo acacia/agua (1 %).

Una vez culminada la cuarentena los jerbos se distribuyeron en cinco grupos: un control negativo que solo recibió vehículo y no se le indujo la isquemia cerebral (IC) y cuatro grupos con IC inducida: un control positivo tratado con el vehículo, un grupo con la combinación policosanol (100 mg/kg) y ácido acetilsalicílico (AAS) (60 mg/kg), un grupo con la combinación policosanol (100 mg/kg) atorvastatina (20 mg/kg) y uno con AAS (60 mg/kg).

Todos los tratamientos se administraron por vía oral mediante entubación intragástrica (0.5 ml/70 g de peso corporal) cuatro horas después (0.5 ml/ 70 g de peso corporal) de la inducción de la isquemia.

La selección de las dosis de policosanol, aspirina y atorvastatina estuvo basada en que estas resultaron moderadamente efectivas sobre el puntaje de daño histológico en cerebro de jerbos con isquemia cerebral global tras su tratamiento terapéutico con dosis únicas.²⁷


Diseño experimental

Los jerbos se anestesiaron en atmósfera de halotano y se les indujo la isquemia cerebral global (I/R), para lo cual se les realizó una incisión en la línea media ventral del cuello, exponiéndose las dos arterias carótidas comunes. Se procedió entonces a aislar y separar dichas arterias colocando un hilo de seda negro a su alrededor, y seguidamente se les permitió recuperarse de la anestesia por 30 min. Culminado este tiempo, se retiró el hilo de seda y se colocó una presilla de presión en cada carótida de manera tal que obstruyera totalmente el flujo sanguíneo durante 5 minutos. Se retiró la presilla para permitir la recirculación sanguínea durante 24 horas, e inmediatamente se realizó la administración de los tratamientos o vehículo. Transcurridas cuatro horas de la intervención quirúrgica se realizó la evaluación de la función neurológica, ya que a este tiempo se hace evidente el daño ella,³² mientras que a las 24 horas de la I/R se investigó la actividad locomotora. Posteriormente se sacrificaron los animales en atmósfera de halotano para la realización de los estudios terminales.


Evaluación neurológica

La evaluación de la función neurológica se llevó a cabo a través de los síntomas clínicos según McGraw (1977):³³ 0, no se presentan síntomas; 1, curvatura del torso o erizamiento del pelo; 2, ptosis; 3, circling; 4, patas traseras extendidas; 5, convulsiones.


Actividad locomotora en campo abierto

A las 24 horas posisquemia los jerbos se sometieron a la evaluación de la actividad locomotora, según Katsumata y colaboradores (2006).³⁴ Para ello, cada jerbo se colocó en el centro de una caja de 60.5 cm de largo x 30 cm de alto x 46 cm de ancho que tiene dividido el fondo en 12 cuadrantes de 14.5 cm², y durante seis minutos se cuantificaron las veces que los jerbos cruzaron los diferentes cuadrantes con las patas delanteras.


Estudios terminales

Culminada la observación conductual, los jerbos fueron anestesiados en atmósfera de halotano y se tomaron muestras de sangre de la vena cava, que se colectaron en tubos plásticos y se mezclaron con EDTA (10%). Inmediatamente, sus cerebros fueron removidos para el análisis histológico.


Determinación de la peroxidación lipídica (PL) y oxidación proteica (OP) en plasma

La sangre se centrifugó a 3000 rpm por 10 min para la obtención del plasma, donde se realizó la cuantificación bioquímica de PL y OP.

Para la determinación de la PL se cuantificó la formación de las sustancias reactivas al ácido tiobárbitúrico (SRATB) según la técnica de Okhawa y colegas, de 1979,³⁵ en plasma. El índice de PL se expresó como nmol malondialdehído (MDA)/mg de proteína.

Para la determinación de la OP se consideraron los grupos sulfhidrilos (SH) con la técnica descrita por Miao-Lin Hu modificada.³⁶ Se tomó una alícuota de 50 ml de plasma, 950 ml de DTNB 10 mM. Se incubó por 20 minutos a temperatura ambiente. La absorbancia del sobrenadante se leyó a 412 nm. El blanco se preparó con DTNB y el total de grupos SH se calculó usando una absortividad de 13.600 cm^-1M^-1 y se expresó en mmol.

La concentración de proteína se determinó por el método de Lowry modificado.³⁷


Estudio histológico

Los cerebros se extrajeron y fijaron en formaldehído tamponado al 10%, se deshidrataron, se incluyeron en parafina y las secciones que contenían el hipocampo se colorearon con hematoxilina y eosina. Las secciones de cada cerebro se evaluaron por un sistema de puntaje por microscopia de luz para la determinación del daño de las células piramidales del área CA1 del hipocampo con promedios bilaterales. Este sistema de puntaje histopatológico se basó en el método utilizado por Bartus y colaboradores (1998),³⁸ que refiere: 0 - células coloreadas normales, densamente pobladas, con soma redondeado y un núcleo central bien coloreado; 1 - algún encogimiento e irregularidad en la forma celular, con una región pálida cromatolítica rodeada por un anillo periférico de citoplasma; 2 - alguna pérdida celular aparente con áreas de células picnóticas; 3 - moderada pérdida celular y picnosis; 4 - pérdida de la sustancia de Nissl, indicando marcada depleción de neuronas y solo alguna neurona ocasional entre numerosas microglías.


Análisis estadístico

Las comparaciones entre grupos se realizaron mediante la prueba no paramétrica de la U de Mann-Whitney. A priori se estableció un nivel de a = 0.05 para la significación estadística. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando el paquete comercial Statistic para Windows (Release 4.2, Stat Soft, Inc., EE.UU.).


Resultados

La Tabla 1 resume los resultados de los efectos terapéuticos de las terapias combinadas policosanol más aspirina, policosanol más atorvastatina y la monoterapia con aspirina sobre el puntaje de síntomas clínicos y actividad locomotora en jerbos de Mongolia con I/R cerebral global.






La oclusión bilateral de ambas arterias carótidas durante 5 minutos y 24 horas de reperfusión provocó síntomas clínicos de daño neurológico en los animales del grupo control positivo, lo cual resultó significativo en comparación con la ausencia de tales síntomas en el grupo control negativo. El tratamiento con dosis orales únicas de las terapias combinadas de policosanol (100 mg/kg) más aspirina (60 mg/kg) y policosanol (100 mg/kg) más atorvastatina (20 mg/kg), así como con la monoterapia con aspirina (60 mg/kg) redujeron de forma significativa (p < 0.05) y marcada (66.5%, 65.2% y 56.5%, respectivamente) el puntaje de síntomas clínicos.

El proceso de I/R produjo un aumento en la locomoción (cruces) de los controles positivos con respecto a los controles negativos. El tratamiento terapéutico con las combinaciones policosanol (100 mg/kg) más aspirina (60 mg/kg) y policosanol (100 mg/kg) más atorvastatina (20 mg/kg) produjo reducciones significativas (p < 0.01 y p < 0.05, respectivamente) y marcadas (73.5% y 61.04%, en igual orden) de la hiperlocomoción. La monoterapia con aspirina (60 mg/kg) redujo significativa (p < 0.05) pero moderadamente (37.8%) esta variable.

La comparación entre los diferentes tratamientos no arrojó diferencias significativas sobre ninguna de las variables conductuales.

La Tabla 2 muestra los resultados del estudio histológico. Los cerebros de los controles negativos no mostraron alteraciones, mientras la totalidad de los cerebros de los controles positivos presentó desaparición y daño de numerosas células piramidales de la región CA1. El tratamiento terapéutico con las combinaciones policosanol (100 mg/kg) más aspirina (60 mg/kg) y policosanol (100 mg/kg) más atorvastatina (20 mg/kg) redujo significativamente (p < 0.001) y de forma moderada el puntaje histológico de daño cerebral, con un 44% de inhibición para ambas combinaciones. De forma similar, la aspirina redujo moderada (35.9%) y significativamente (p < 0.001) el puntaje histológico de daño cerebral. La comparación estadística entre los diferentes tratamientos no resultó significativa.






La Tabla 3 muestra los efectos de la administración de policosanol (100 mg/kg) más aspirina (60 mg/kg), policosanol (100 mg/kg) más atorvastatina (20 mg/kg) y aspirina (60 mg/kg) sobre las concentraciones plasmáticas de MDA y grupos SH en jerbos de Mongolia con I/R cerebral global. El proceso de I/R aumentó significativamente ambas variables en el grupo control positivo en relación con el control negativo. Ambas terapias combinadas provocaron reducciones significativas (p < 0.05) y marcadas de las concentraciones séricas de MDA (77% y 78.2% de inhibición, respectivamente) así como de las concentraciones séricas de GSH (55.2% y 60.3% de inhibición, en ese orden). Por otra parte, la monoterapia con aspirina (60 mg/kg) no modificó ninguna de estas variables oxidativas.






Discusión

Este estudio demuestra que el tratamiento oral terapéutico con dosis únicas de las combinaciones policosanol (100 mg/kg) más aspirina (60 mg/kg) y policosanol (100 mg/kg) más atorvastatina (20 mg/kg) redujo los síntomas clínicos (SC), la hiperlocomoción y el daño histológico de las células piramidales de la región CA1 inducidos por I/R en un modelo de isquemia cerebral global en jerbos de Mongolia. El tratamiento con la monoterapia de aspirina (60 mg/kg), sustancia de referencia, redujo significativamente estas variables, lo cual demuestra la validez del modelo en nuestras condiciones experimentales.

La eficacia de ambas combinaciones sobre los SC neurológicos resultó muy similar, con porcentajes de inhibición aproximadamente iguales (66.5% y 65.2%, respectivamente). Sin embargo, la eficacia alcanzada sobre la hiperlocomoción,³⁹ indicador de daño sobre las neuronas CA1 del hipocampo, mostró una ligera ventaja con la combinación policosanol más aspirina (73.5% de inhibición) respecto a la de policosanol más atorvastatina (inhibición de 61%) con alrededor de un 10% de diferencia.

Vale señalar que ambas combinaciones, si bien no presentaron diferencias significativas entre ellas ni con respecto a la monoterapia con aspirina, mostraron eficacia superior a la de la monoterapia, tanto sobre los SC como sobre la hiperlocomoción, esta ventaja fue más marcada sobre esta última variable, ya que la combinación policosanol más aspirina superó a la monoterapia en alrededor de un 35%, mientras que la de policosanol más atorvastatina lo hizo en un 23%.

El estudio histológico confirmó los resultados obtenidos sobre las variables conductuales, ya que ambas combinaciones presentaron igual eficacia sobre el puntaje histológico de daño cerebral (44% de inhibición), y si bien su comparación con la monoterapia de aspirina no resultó significativa fueron superiores en alrededor de un 10%.

Estudios previos han demostrado los beneficios de la combinación del policosanol y la aspirina sobre la isquemia cerebral tanto en ensayos preclínicos como clínicos.^28,29 En el presente estudio, esta combinación produjo mayor inhibición sobre las variables conductuales y sobre el puntaje histológico que la alcanzada con la monoterapia con aspirina, lo que refuerza la idea del beneficio de esta combinación. Al mismo tiempo, el hecho de que la combinación con atorvastatina mostrara similar eficacia constituye un resultado promisorio en la búsqueda de nuevas alternativas para el tratamiento del ictus isquémico, máxime dado los efectos adversos de la aspirina.¹⁴

Por otra parte, el estudio sobre las variables oxidativas demostró la eficacia de las dos combinaciones para reducir marcada y significativamente las concentraciones séricas de MDA y de GSH (marcadores de peroxidación lipídica y oxidación proteica, respectivamente) a diferencia de la terapia con aspirina, la cual no modificó estas variables. Aquí, la eficacia de ambas combinaciones resultó muy similar, ya que se corroboraron nuevamente sus efectos equivalentes.

Teniendo en cuenta que el incremento del estrés oxidativo contribuye de manera importante al daño neuronal,⁴⁰ el hecho de que el policosanol mantenga sus propiedades antioxidantes, previamente informadas,²⁴ en combinaciones con aspirina y con atorvastatina les confiere un beneficio adicional a tales alternativas terapéuticas. Este estudio confirma el beneficio terapéutico de la combinación policosanol más aspirina y demuestra el beneficio potencial de la combinación policosanol más atorvastatina, la cual deberá ser confirmada por ulteriores estudios clínicos.


Conclusiones

El tratamiento terapéutico con dosis orales únicas de las combinaciones policosanol (100 mg/ kg) más aspirina (60 mg/kg) y policosanol (100 mg/kg) más atorvastatina (20 mg/kg) redujo marcada y significativamente la isquemia cerebral global en jerbos de Mongolia con una eficacia muy similar entre ellos, y con una eficacia ligeramente mayor que la obtenida con la monoterapia con aspirina. Además, ambas combinaciones presentaron efectos antioxidantes, a diferencia de la monoterapia con aspirina, lo que les proporciona un beneficio adicional.

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