The benefits of antimicrobial peptides in treating diabetic foot ulcers

Abstract
Diabetic foot ulcers are one of the most important complications of diabetes mellitus type 2. In fact, up to 30% of diabetic patients develop this complication. In recent years new therapies have been implemented to try to promote rapid healing in this type of ulcers, focusing on antibiotic therapy, restoration of vascularization, induction of healing and counteracting neuropathy. Antimicrobial peptides are versatile molecules that induce wound healing, have antimicrobial activity and also promote angiogenesis. Because of these properties, they have been proposed as adjuvants in the therapy for diabetic foot ulcers. In order to avoid excessive costs in the treatment of diabetic ulcers with the use of synthetic AMP, some research groups have chosen to induce peptides with exogenous molecules. Many molecules are capable of inducing antimicrobial peptides both in blood cells and in endothelial cells. Research into the use of AMP as adjuvants in the treatment of diabetic foot ulcers continues in several lines of research, such as synthesis of peptides with specific angiogenic activities, use of peptides from insects or amphibians, as well as the use of synthetic peptides. In the present review, we analyze the possible use of AMP and their inducers in the treatment of diabetic foot ulcers based on the reported studies either in vivo or in vitro.

Key words
diabetic foot ulcer, antimicrobial peptides, wound healing, angiogenesis, therapy

Artículo completo
Introducción

La diabetes mellitus tipo 2 (DBT2) es un grave problema de salud pública. En 1980 se estimaba que había 108 millones de personas que la padecían, para 2014 la cifra había crecido considerablemente y el reporte había cambiado a 422 millones de personas afectadas. Actualmente, de acuerdo con la Federación Internacional de Diabetes (International Diabetes Federation [IDF]) se estima que existen 425 millones de personas en el mundo con esta enfermedad, cuya edad varía entre los 20 y los 79 años, y se espera que esta cantidad se duplique para 2045, comprometiendo la calidad de vida de quienes la padecen.²

La DBT2 es un trastorno metabólico complejo condicionado por múltiples factores, entre los cuales destaca la hiperglucemia. La hiperglucemia es orquestada por la resistencia a la insulina (RI) y por el deterioro en la secreción de esta hormona. Esta situación promueve una alta glucotoxicidad hacia estructuras celulares clave dependientes de energía como los miocitos, los adipocitos y las células nerviosas. Se ha descrito que la glucotoxicidad es un mecanismo fuertemente vinculado con la generación de estrés oxidativo, activación de varias isoformas de la proteincinasa C, aumento del flujo de las vías de polioles y hexosamina y formación de productos finales de la glucación avanzada (AGE, por sus siglas en inglés), componentes clave en la patogénesis de la complicaciones crónicas de la DBT2.³ Aunque la DBT2 per se causa un daño importante tanto a la población como a la economía del sector salud en general, las complicaciones relacionadas con la DBT2 son las más detrimentales. Se ha comunicado que la insuficiencia renal asociada con DBT2, retinopatía y úlceras de pie diabético (UPD) son las complicaciones que más afectan a los pacientes. Aunque el diagnóstico temprano de la DBT2 y la prevención es la piedra angular para detener esta epidemia. Desafortunadamente, cuando los pacientes con complicaciones ingresan en el hospital, sus cuadros se hallan francamente avanzadas y dejan a los médicos tratantes con muy pocas posibilidades para revertir cualquiera de los procesos, dado que muchos de los tratamientos son excesivamente caros o bien ya no son eficaces, dejando a los pacientes sin mucha alternativa. Es por eso que en varias ramas de la investigación biomédica se han buscado nuevas estrategias terapéuticas para las diferentes complicaciones de la DBT2.


Úlceras de pie diabético

Las UPD son una de las complicaciones crónicas más devastadoras y con mayores ingresos hospitalarios, se observan en los miembros inferiores de los pacientes diabéticos. Su etiopatogénesis obedece a la suma de diversos factores, entre los más importantes se encuentran la neuropatía periférica (NP), la enfermedad vascular periférica (EVP) y una limitada resistencia a la invasión microbiana.⁴ Dicho lo anterior y bajo estas condiciones, el pie de un diabético es vulnerable a daños neurológicos, observándose los siguientes aspectos: disminución de la sensibilidad al dolor, temperatura, tacto, vibraciones y alteraciones en la biomecánica que contribuyen al desarrollo de las deformidades podálicas. Asimismo, desde el punto de vista de la EVP, los pacientes con UPD se caracterizan por un inadecuado suministro sanguíneo, condicionando la migración leucocitaria y la difusión de oxígeno y nutrientes hacia las respectivas áreas.

En este sentido, los daños resultantes de la NP y la EVP contribuyen a la pérdida de los estímulos protectores y predisponen al pie a sufrir, de forma inadvertida, un traumatismo físico, químico o mecánico que se refleja en una herida cutánea, que sin ninguna intervención puede infectarse y progresar a la cronicidad y destrucción de los tejidos profundos, conllevando a una extensa necrosis tisular y por ende a una intervención quirúrgica (amputación) parcial o total de la extremidad afectada⁵ (Figura 1). La resolución de las úlceras infectadas del pie diabético requiere la consideración de distintos aspectos clínicos que incluyen el control de la hiperglucemia, la cirugía (desbridamiento, drenaje o revascularización) y tratamiento de las infecciones asociadas con tejidos blandos u osteomielitis. En general, se puede mencionar que se necesita hacer más énfasis en el control de los niveles de glucosa, impulsar una correcta revascularización (derivativa o angiogénica), contrarrestar la neuropatía, promover la proliferación del epitelio para fomentar la cicatrización y al mismo tiempo combatir las infecciones. En este sentido, los esfuerzos se deben concentrar en la búsqueda de una molécula que cumpla con todos esos requisitos, como los péptidos antimicrobianos (AMP) o péptidos de defensa del huésped (PDH), los cuales tienen varias de estas funciones y pueden ser prometedores para el uso en la terapia de las UPD.


Generalidades de los péptidos antimicrobianos

Los péptidos antimicrobianos (AMP) son moléculas pequeñas (50-100 aminoácidos) de naturaleza catiónica (por ser ricos en residuos básicos: lisina y arginina) y presentan una estructura anfipática. De acuerdo con su tamaño, estructura conformacional y organización de aminoácidos se agrupan en familias que corresponden a: defensinas (HNP/HBD), catelidicina (LL-37/hCAP-18) e histatinas (His). Son producidos por todos los organismos vivos y dentro de las moléculas del sistema inmune innato son altamente conservados.⁶ En los seres humanos, los AMP son secretados de forma constitutiva o inducible por diversas estirpes celulares en respuesta a estímulos infecciosos, inflamatorios u hormonales.⁷ Su principal función corresponde a su efecto antimicrobiano directo sobre bacterias⁸ virus, hongos y parásitos.⁹






Se ha descrito que las defensinas beta (hBD) 2 y hBD-3 se encuentra en el epitelio de las superficies interna y externa del cuerpo humano como la piel, los tractos respiratorio e intestinal. Asimismo, se ha observado que su expresión aumenta por la presencia de patrones moleculares asociados con patógenos (PAMP) tales como lipopolisácarido (LPS), peptidoglucano (PG), lipoarabinomanana (LAM) o por citocinas proinflamatorias como TNF-a e IL-1ß.¹⁰

Por otro lado LL-37, un péptido originado a partir de su precursor hCAP-18, tiene una cadena de 37 aminoácidos. Se encuentra en los gránulos secundarios de los neutrófilos y macrófagos, es secretado por las células epiteliales, monocitos, macrófagos, linfocitos T y células cebadas cuando se encuentran en contacto con los PAMP. La LL-37 también presenta actividad quimiotáctica, principalmente sobre neutrófilos y linfocitos T CD4. Asimismo, se ha descrito que la LL-37 tiene propiedades tanto proinflamatorias como antiinflamatorias, por ejemplo, la diferenciación de los monocitos a macrófagos en presencia de LL-37 promueve una respuesta proinflamatoria, lo que resulta en la regulación a la baja de IL-10 y la regulación positiva de IL-12p40. Además, la exposición de LL-37 aumenta la producción de IL-1ß a través de la activación de P2X7R, el cual es un inductor en la activación de los inflamasomas en los macrófagos y monocitos.¹¹ No obstante, diversos estudios señalan que más que un efecto directo, estos presentan efectos inmunomoduladores interesantes en el campo de la regeneración tisular, específicamente en el área de cicatrización de heridas tal y como se describe a continuación.

Actividades cicatrizantes y angiogénicas de los péptidos antimicrobianos

La correcta cicatrización de las heridas cutáneas depende de fenómenos dinámicos, complejos y ordenados en el que interactúan células sanguíneas, componentes de la matriz extracelular y células del parénquima. En este sentido, los AMP tienen fuertes implicaciones. Se ha descrito que la hBD-2 se encuentra en el estrato córneo y se almacena en cuerpos laminares de los queratinocitos de la capa espinosa, su expresión induce la migración y proliferación de queratinocitos mediante la activación del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), STAT1/STAT3).^12,13 Asimismo, en otro reporte se describe que la hBD-3 muestra actividad antiinflamatoria in vitro e in vivo mediante la inhibición de las vías de señalización de TLR en células inmunitarias,¹⁴ lo que sugiere su posible participación en la resolución del proceso inflamatorio en las etapas tempranas de la cicatrización. Del mismo modo, se ha informado que la LL-37 juega un papel clave en la cicatrización, contribuyendo a la reepitelización celular y a la secreción de citocinas (IL-6, IL-8, IL-10, IL-18 y IP-10) y quimiocinas (MCP-1, MIP-3a y RANTES) que permiten la llegada de células inmunes al sitio de lesión, evitándose así la formación de biopelículas bacterianas en la piel lesionada.¹⁵

Es interesante destacar que se reportó que ratones deficientes de CRAMP eran más susceptibles a infecciones en la piel por estreptococos del grupo A, en comparación con los ratones de tipo silvestre.¹⁶ En adición, la LL-37 puede proteger de la apoptosis a los queratinocitos mediante la activación de la vía de la ciclooxigenasa 2 (COX-2)/prostaglandina (PGE2).¹⁷ Además, se ha reportado que la LL-37 puede inducir angiogénesis, tal y como se demostró en un modelo in vitro e in vivo, mediante la activación del receptor FPRL1 expresado en células endoteliales, resultando en una mayor proliferación y formación de estructuras similares a los vasos sanguíneos.¹⁸ Asimismo, otros autores sugieren que el efecto angiogénico de la LL-37 obedece a la liberación de PGE2 dependiente de la activación de la vía de la COX-1. La Figura 2 resume los procesos antes descritos. En conclusión, la información recabada muestra que los AMP son importantes para la reparación de las heridas y sería interesante estudiarlos en condiciones de hiperglucemia e investigar su comportamiento bajo un esquema terapéutico, es decir explorar su expresión bajo la influencia de la insulina, la metformina o la glibenclamida.






Cambios en la expresión de los péptidos antimicrobianos durante la diabetes mellitus tipo 2 y sus consecuencias

La DBT2 es un problema de salud pública que ha ido aumentando en las últimas décadas y se ha asociado fuertemente con diversas comorbilidades como cáncer,¹⁹ infecciones virales (p. ej.: VIH)²⁰ y bacterianas (tuberculosis),²¹ entre otras. En cada una de ellas, se encuentra un común denominador, una supresión parcial o total de la respuesta inmune debido a la hiperglucemia per se. Se ha descrito que los pacientes con DBT2 tienen una respuesta inmune anormal, que incluye fallas en la inmunidad humoral, defectos en la fagocitosis, defectos en la extravasación de células inflamatorias, disfunción de los neutrófilos así como de la respuesta inmune mediada por células T.¹ Sin embargo, a pesar del avance que se tiene en el conocimiento de la respuesta inmune en individuos con DBT2, se conoce muy poco acerca de los cambios en la expresión de los AMP durante esta enfermedad y qué consecuencias podrían traer. Nuestro grupo reportó que los niveles de AMP: LL-37, HBD-2, HBD-3 y HBD-4 están disminuidos a nivel sérico en personas con DBT2, con tuberculosis o sin ella;²¹ esto sugiere que la deficiencia en la producción de estos AMP en los individuos con DBT2 los hace más susceptibles a la tuberculosis pulmonar. Más tarde, se demostró que concentraciones crecientes de glucosa se correlacionaban con una baja expresión de LL-37 en macrófagos no infectados, mientras que en macrófagos infectados por Mycobacterium tuberculosis, la expresión de LL-37 aumentaba en altas concentraciones de glucosa, no obstante, la micobacteria no se eliminaba,²² esto podría atribuirse al efecto inmunomodulador de la catelicidina, aunque se necesitan más estudios para determinar el papel de catelicidina en la DBT2 durante la infección por M. tuberculosis.
Otros estudios han demostrado la importancia del papel de la vitamina D para la inducción de AMP ya sea en individuos aparentemente sanos o con DBT2.²³ Se ha demostrado que algunos pacientes con DBT2 tienen menor expresión del receptor para vitamina D (VDR), esto se traduce en menor producción de HBD-2 y LL-37.²⁴ Además, el aumento de la dosis de vitamina D induce un incremento en el VDR, lo que conlleva al aumento tanto de HBD-2 como de LL-37, eliminando así las bacterias intracelulares.²⁵ Resultados muy similares fueron encontrados por otros grupos, que además de encontrar una disminución en la concentración de vitamina D y catelicidina en pacientes con DBT2, existe una asociación con la producción de IFN-?, IL-4 e IL-17.²⁶


Péptidos antimicrobianos en las úlceras de pie diabético

Como se mencionó con anterioridad, las UPD son unas de las principales complicaciones de la DBT2, las cuales se caracterizan por baja angiogénesis, escasa cicatrización, neuropatía e infecciones; entre las principales características de los AMP corresponde a su capacidad cicatrizante, angiogénica y, como su nombre lo indica, también tienen propiedades antimicrobianas. Estas características propiciaron el estudio de los AMP en las UPD. Nuestro grupo ha descrito que la mayoría de las biopsias provenientes de UPD tenían una nula expresión génica de LL-37 en el área afectada, lo cual concordaba con la falta de cicatrización, ya que este péptido es conocido por su fuerte actividad angiogénica e inducción de la migración de queratinocitos. Controversialmente, se encontraron los péptidos HNP-1, HBD-2, HBD-3 y HBD-4 aumentados, en comparación con muestras de piel sana. No obstante, al hacer cultivos primarios provenientes de las úlceras y estimularlos con S. aureus los cultivos primarios provenientes de las UPD producían menos defensinas que la piel sana en las mismas condiciones, lo cual sugiere que, aunque las úlceras responden a las infecciones con la producción de AMP, esta producción no es suficiente para controlar la infección e inducir cicatrización.²⁷ En estudios posteriores, se determinó que el péptido RNAsa7 también está disminuido en la UPD y que, además, no se puede inducir su expresión con vitamina D, butirato de sodio o isoleucina L (Rivas-Santiago y col., datos no publicados). Estos resultados sugieren que existe una disminución en la producción de AMP en las UPD; el origen de esta disminución es todavía desconocido, puede ser por la alteración en las vías de señalización causada por la hiperglucemia o bien por una disminución en los niveles circulantes de vitamina D. Sin embargo, se necesitan más estudios para determinar las causas de esta disminución. Es necesario también investigar el efecto de los principales hipoglucemiantes en la producción de los AMP, ya que por una parte podrían inducirlos y esto podría beneficiar para prevenir las ulceraciones diabéticas, y por otro lado podrían inhibir la producción. En este sentido, es necesario llevar a cabo estudios epidemiológicos y de investigación básica para determinar el papel de estos hipoglucemiantes en la producción de AMP.


El uso de los péptidos antimicrobianos como coadyuvantes

Las importantes características procicatrizantes de los AMP y la falta de estos en los procesos de UPD han dado lugar a investigar sobre el uso de estos péptidos para el tratamiento de heridas crónicas. Estudios in vivo usando transferencia adenoviral de LL-37 a heridas de ratones diabéticos ob/ob, mostraron un incremento importante en la producción de LL-37 en la piel de estos ratones, mejorando la reepitelización y la formación de tejido granuloso, disminuyendo el tiempo de cicatrización en comparación de los ratones no tratados;²⁸ esto fue confirmado más tarde en un estudio independiente, en donde se demostró que la LL-37 promovía tanto la reepitelización como la angiogénesis en modelos de heridas crónicas tanto in vitro como in vivo.²⁹ Posteriormente, usando LL-37 y el PDH IDR-1018, el cual es un derivado sintético de la bactenecina de bovino, se demostró que IDR-1018 es menos tóxico que LL-37 in vitro; además, se demuestra que la cicatrización se aceleraba en heridas infectadas por S. aureus tanto en modelos murinos como en porcinos. Sin embargo, al usar este péptido en modelos murinos de diabetes no hubo diferencia entre ambos péptidos en cuanto al tiempo de regeneración del epitelio,³⁰ parece ser que el efecto de la hiperglucemia bloquea la señalización de los receptores a los que se une este péptido o bien existe una glucación en los receptores que impide la actividad cicatrizante de los péptidos, pero esto debe ser estudiado a futuro. Posteriores estudios, usando tanto queratinocitos como células endoteliales humanas, mostraron que el IDR-1018 puede inducir VEGF-165, angiogenina y TGF-B en condiciones de hipoxia con altas concentraciones de glucosa.³¹

Diversos estudios han sugerido como fuertes candidatos a los AMP en el tratamiento de las UPD, pero se tiene que tomar en cuenta el microambiente de las UPD, por ejemplo, se ha informado una alta concentración de metaloproteasas (MMP) en las úlceras.³²

Por lo tanto, la administración tópica de LL-37 es inestable en el microambiente de heridas e infecciones por la acción de estas MMP, las cuales rompen en péptidos más pequeños, incapacitando la función de LL-37,³³ lo cual podría ser evitado usando péptidos con puentes disulfuro o bien remplazando aminoácidos alfa por beta, acompañados de inhibidores de MMP junto con la aplicación de AMP.

Del mismo modo, otros estudios han propuesto el empleo de LL-37 como coadyuvante en el tratamiento de las úlceras crónicas varicosas, obteniendo resultados parcialmente satisfactorios, es decir que en ninguno de los pacientes tratados se logró la cicatrización completa. Los autores sugieren que los resultados obtenidos son debido al limitado tiempo de tratamiento. Además, también se mencionó que el uso de LL-37 para el tratamiento tendría un costo muy alto, al cual muchos pacientes no tendrían acceso.³⁴

Con el fin de evitar costos excesivos en el tratamiento de ulceras diabéticas con el uso de AMP sintéticos, algunos grupos de investigación han optado por inducir péptidos con moléculas exógenas. Existen muchas moléculas capaces de inducir péptidos antimicrobianos tanto en células sanguíneas como en epiteliales,³⁵ la molécula que se ha señalado con un efecto inductor más acentuado es la vitamina D.³⁶ Se ha informado que el uso de calcitriol e isoleucina L en células procedentes de UPD induce la producción de HBD-2 y LL-37. Los sobrenadantes procedentes de las células estimuladas fueron usados para inducir migración y proliferación de queratinocitos, obteniendo un resultado notable: el uso de anticuerpos para bloquear la LL-37 y la HBD-2 de los sobrenadantes, los efectos relacionados con la cicatrización fueron abrogados. Los autores demostraron también que los sobrenadantes tuvieron actividad antimicrobiana en contra de aislados clínicos procedentes de UPD; sin embargo, muchos de estos aislados tenían el gen para resistencia a la actividad de péptidos antimicrobianos (mprf).³⁷ Estos datos, además, sugieren que el uso de AMP o sus inductores deberá ser acompañado de antibióticos de amplio espectro. Posteriormente, el mismo grupo reportó que el calcitriol además tenía efecto en la inducción de moléculas proinflamatorias importantes como la angiogenina y el VEGF.³⁸ Es interesante señalar que el calcitriol, además de inducir AMP en las UPD, disminuye la expresión de las MMP-1 y MMP-10. Sin embargo, la disminución de la MMP-9 no alcanzó diferencia estadísticamente significativa cuando se comparó con el control.³⁹ A pesar de este último resultado, el calcitriol continúa siendo el inductor más prometedor para ser usado como coadyuvante en el tratamiento de las UPD, sin embargo, se necesitan estudios multicéntricos en pacientes con UPD.


Futuro en la investigación y terapia en las úlceras de pie diabético

La investigación en el uso de AMP como coadyuvantes en el tratamiento de las UPD sigue avanzando en varias líneas de investigación, por ejemplo: la síntesis de péptidos con actividades angiogénicas específicas, el uso de péptidos de insecto o anfibios y los péptidos sintéticos.⁴⁰ Algunos de estos acercamientos han tenido resultados muy sugerentes para su uso clínico; por ejemplo, el pexiganan, el cual es un péptido antimicrobiano análogo de las megaininas aislado de la piel de la rana africana Xenopus leavis,⁴¹ mostró efectividad en el tratamiento de las UPD, incluso si se lo compara con los antibióticos orales.⁴² Otros estudios han mostrado la efectividad de péptidos provenientes de ranas, que son capaces de promover eficientemente la angiogénesis y con actividades cicatrizantes, además de regular los procesos inflamatorios en las úlceras diabéticas.⁴³ Otro péptido derivado de anfibios es la esculetina 1, la cual induce migración en queratinocitos incluso con más potencia que LL-37; se destaca que este péptido tiene una importante actividad antimicrobiana contra P. aeruginosa, sugiriendo su posible uso como agente antimicrobiano en las UPD⁴⁴ (Figura 3).






Actualmente se están desarrollando una gran variedad de péptidos sintéticos derivados de anfibios, de reptiles o de seres humanos para su uso como antibióticos o promotores de la cicatrización.^45-49 Sin embargo, hasta la fecha no se han probado en ambientes con hiperglucemia o en ensayos clínicos.


Conclusiones

Con el tiempo ha empezado a surgir una gran variedad de péptidos que son una promesa para ser coadyuvantes en el tratamiento de las úlceras de pie diabético, algunos mostraron un efecto antimicrobiano acompañado de un marcado efecto angiogénico y promotor de la cicatrización. Sin embargo, de forma realista, sólo algunos serán probados en fase clínica y muy pocos tendrán el efecto deseado; por estos motivos es importante enfocar la investigación en la búsqueda de nuevos péptidos, con el fin de tener candidatos ideales; asimismo es necesario aumentar a nivel clínico la investigación de estos péptidos y de sus inductores.

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