Effect of a nutrients and inhibitors combination of bacterial growth on the development of Salmonella

Abstract
The selection of nutrient bases depends on the microorganism and the purpose of the medium. Inhibitors of bacterial growth are of great importance in selective and differential media and may interfere in the growth of the microorganism of interest.

An adequate balance between promoter substances and inhibitors of bacterial growth is thus required, especially for bacteria that could be found either at very low concentrations or those subject to different stress conditions during storage of the samples containing them, such as Salmonella. The aim was to evaluate the effect of a combination of nutrients of different origins and inhibitors of grampositive bacteria on the development of Salmonella serotypes. 52 Salmonella strains and a representation of other bacteria and yeasts were selected. The nutritional capacity of the composition was determined by spectrophotometric technique formulating variants with mixtures of nutritive bases, and recording the increase in biomass. Recovery capacity and inhibition of two experimental variants with different inhibitors were quantitatively tested. The productivity of the final formulation was compared with a chromogenic medium (Oxoid, England). Salmonella showed abundant growth in the variants made with different nutrient combinations. Both experimental formulations showed their ability to recover microorganisms of interest. The final composition showed productivity values higher than 0.80 in both variants. The mixture of nutrient bases and bile salts as an inhibitor of growth of grampositive bacteria was an effective combination, capable of stimulating the growth of Salmonella genus when these bacteria are found at low concentration.

Key words
salmonella, chromogenic and fluorogenic diagnostician, culture media, bacterial colonization, bacterial nutrition, bacterial inhibitors

Artículo completo
Introducción

Las bases nutritivas, obtenidas por hidrólisis o extracción a partir de diferentes sustratos proteicos, son ingredientes principales de los medios de cultivo destinados al diagnóstico microbiológico, complementando diversos requerimientos nutricionales de los microorganismos.¹

El genoma de Salmonella contiene más de 4000 genes que codifican varias vías metabólicas,^2-4 pero solo el 10% de ellos está relacionado con la capacidad de asimilar uno u otro compuesto como fuente de carbono y energía.⁵

Los compuestos nitrogenados amínicos son requeridos como factores esenciales de crecimiento de bacterias quimiorganotrofas, según lo refiere el Manual Oxoid (1995). Entre las fuentes de nitrógeno asimilables por Salmonella para obtener energía, se encuentran la alanina, los ácidos aspártico y glutámico, la glicina y la prolina,^5,6 aminoácidos presentes en una concentración mayor del 5% en las peptonas o extractos obtenidos de un sustrato de origen animal.⁷ Otros estudios demuestran que la cisteína, aminoácido que se encuentra en las bases nutritivas en forma de cistina,⁷ es esencial durante la respuesta de estrés oxidativo de Salmonella y la tiorredoxina tiene un papel importante en su supervivencia intracelular y replicación.⁸

Las bases nutritivas obtenidas a partir de sustratos vegetales contienen un elevado porcentaje de glúcidos respecto de las derivadas de otras fuentes proteicas. Los glúcidos tales como dextrosa, fructuosa, maltosa, sacarosa, maltotriosa y dextrinas, encontrados en los nutrientes de origen vegetal, no se utilizan en altas concentraciones para el cultivo de bacterias debido a su preferencia respecto de las sustancias nitrogenadas.⁹

En una predicción del crecimiento in silico se detectó que Salmonella era capaz de utilizar 147 fuentes de carbono de un total de 191 ensayadas,^5,6 glúcidos que se encuentran presentes en los productos obtenidos de origen vegetal.⁹ No obstante, varios trabajos han demostrado la variabilidad metabólica entre serotipos o cepas del mismo serotipo de Salmonella.^10,11

La selección de las bases nutritivas tiene estrecha relación con el microorganismo que se desee cultivar y el propósito del medio de cultivo que se desarrolle.

Para la detección de Salmonella resulta necesario emplear composiciones altamente nutritivas debido a que este género puede encontrarse en muy bajas concentraciones y estar sometido a diferentes condiciones de estrés durante el procesamiento y el almacenamiento de la muestra a ensayar. Wang y colaboradores refieren que unas pocas células de este microorganismo en un alimento son suficientes para colonizar el tracto gastrointestinal bajo y producir síntomas clínicos en los seres humanos.¹²

En los medios de cultivo selectivos, la concentración de los inhibidores, además de suprimir la microbiota acompañante en la muestra de ensayo de alimentos o clínicas, debe garantizar un adecuado crecimiento del microorganismo diana.^13-16

Los medios de cultivo selectivos diseñados para la detección de Salmonella utilizan variadas sustancias inhibidoras como: antibióticos (novobiocina en chromogenic ester agar medium), desoxicolato de sodio (agar Rambach y medio ABC) y el tergitol 4 (agar Miller-Mallinson y agar N4), entre otros.^17-21 Otros utilizan una mezcla de inhibidores como: sales biliares, novobiocina y cefsulodina (Salmonella chromogenicmedium [SCM] o sales biliares y verde malaquita [medio SIM-ID]).^17,22

El objetivo del presente estudio consistió en evaluar el efecto de una combinación de nutrientes de origen animal, vegetal y microbiano y de inhibidores del crecimiento de bacterias grampositivas sobre el desarrollo de Salmonella.



Materiales y métodos

Combinación de nutrientes de origen animal, vegetal y microbiano

Para evaluar la capacidad de la combinación de nutrientes de promocionar el crecimiento de Salmonella se diseñaron tres variantes experimentales con bases nutritivas de diferentes orígenes (BioCen, Cuba). La V1 contenía una mezcla de hidrolizado pancreático de tejido animal (5 g/l), extracto de levadura S e hidrolizado enzimático de caseína (3 g/l); la V2 se componía de hidrolizado papaínico de harina de soja (5 g/l), extracto de levadura S e hidrolizado enzimático de caseína (3 g/l); mientras que la V3 combinaba hidrolizado papaínico de harina de soja (5 g/l), hidrolizado pancreático de tejido animal, extracto de levadura S e hidrolizado enzimático de caseína (2 g/l).

Cada mezcla se restituyó en agua desionizada, se dispensó en cantidad de 10 ml por tubo de cultivo y se esterilizó en autoclave (Lequeux, Francia) a 121°C por 15 min.

Se seleccionaron cuatro cepas de la ATCC (American Type Culture Collection) de Salmonella enterica: Salmonella ser. Typhimurium 14028, Salmonella ser. Enteritidis 13076, Salmonella ser. Typhi 19430 y Salmonella ser. Paratyphi A 8005. Cada una se inoculó en caldo cerebro corazón (BioCen, Cuba) y se incubó a 37 ± 1°C por 24 h (se reactivaron).

A partir del medio de cultivo opalescente se preparó una suspensión microbiana estandarizada a una densidad óptica de 550 nm (DO₅₅₀) de 0.3 (espectrofotómetro T70/T70+UV-VIS PGI, Beijing, China). Se inocularon alícuotas de 0.1 ml de las suspensiones en dos tubos en paralelo de cada una de las variantes experimentales diseñadas y se incubaron a 41.5 ± 1°C por 24 h.

La promoción de crecimiento se determinó según el incremento de la biomasa microbiana en el tiempo al medir el valor de la absorbancia, cada hora, hasta completar las 10 primeras horas de incubación y luego a las 24 h en un espectrofotómetro a 640 nm.


Efecto de distintos inhibidores del crecimiento de bacterias grampositivas

Para evaluar el efecto de distintos inhibidores del crecimiento de bacterias grampositivas sobre el desarrollo de Salmonella se diseñaron dos variantes experimentales: la variante 4 (V4) con sales biliares (BioCen, Cuba), 1.3 g/l, y la variante 5 (V5) con desoxicolato de sodio (AppliChem, Alemania), 1.0 g/l. Ambas tenían una mezcla de hidrolizado pancreático de tejido animal (BioCen, Cuba), 5.0 g; extracto de levadura S (BioCen, Cuba), 3.0 g; hidrolizado enzimático de caseína (BioCen, Cuba), 3.0 g; rojo neutro (AppliChem, Alemania), 0.03 g; agar bacteriológico (AgarMex, México), 14.0 g; tiosulfato de sodio (Merck, Alemania), 2.5 g; citrato de hierro y amonio (Merck, Alemania), 0.5 g; L-lisina (Merck, Alemania), una mezcla de sustancias cromogénicas, fluorogénicas y de contraste, 14.20 g (Merck, Alemania; Biosynth, Suiza; AppliChem, Alemania) para la detección de las actividades galactosidasa y glucosidasa de Salmonella y otras especies bacterianas y 1000 ml de agua desionizada. El pH se ajustó a 7.0 ± 0.2 y se calentaron hasta ebullición, se dejaron atemperar hasta 50°C en reposo y se distribuyeron en placas de Petri estériles (Gooselin, Alemania).

Se seleccionaron 16 cepas de colección: cinco cepas de S. enterica subsp. Enterica y 11 bacterias grampositivas y levaduras (Tabla 1) y se reactivaron en caldo cerebro corazón.






Combinaciones de nutrientes e inhibidores del crecimiento bacteriano

Para evaluar el efecto de las combinaciones de nutrientes e inhibidores del crecimiento de bacterianas grampositivas sobre el desarrollo de Salmonella se comparó la formulación experimental V4 (antes descrita) con el medio de cultivo cromogénico SCM (Oxoid, Reino Unido).²⁴

Se utilizaron cinco cepas de referencia de la ATCC de S. enterica: Salmonella ser. Typhi 19430 y 7251, Salmonella ser. Typhimurium 14028 y 13311y Salmonella ser. Paratyphi A 8005 y se reactivaron en caldo cerebro corazón.


Método de inoculación

Las cepas se estandarizaron a DO₅₅₀ de 0.125 para las bacterias y 0.3 para las levaduras, equivalentes a 1.5×10⁸ y 3×10⁸ UFC/ml, respectivamente. Se prepararon diluciones seriadas con solución salina estéril al 0.85% (p/v) hasta alcanzar una concentración microbiana teórica de 1.5 UFC/ml para Salmonella, 1.5×10³ UFC/ml para los microorganismos grampositivos y 3×10³ UFC/ml para las levaduras. Las composiciones preparadas se inocularon por triplicado con las cuatro últimas diluciones para Salmonella y con todas para el resto de microorganismos, utilizando el método de siembra por inundación de la superficie. Se incubaron a 37 ± 1°C por 24 h.

El agar triptona soja (BioCen, Cuba) se utilizó como medio de cultivo de referencia.¹⁵


Productividad y selectividad

Se calculó la productividad de las formulaciones experimentales y del medio de cultivo SCM con respecto al medio de referencia y en la evaluación del efecto de distintos inhibidores sobre el crecimiento de bacterias grampositivas, además, se calculó la selectividad de ambas composiciones experimentales.²⁵


Estadística

Los datos obtenidos en la evaluación de la combinación de nutrientes de diferentes orígenes y en la combinación de nutrientes e inhibidores del crecimiento de bacterias grampositivas sobre el crecimiento de Salmonella se procesaron mediante un análisis de varianza (ANOVA) con la utilización del paquete estadístico “Statistica8” (StatSoft, Inc., EE.UU., 2008). Además, se analizó la existencia de diferencias significativas entre los valores obtenidos con la prueba de Tukey para un 95% de confianza.


Resultados

Salmonella mostró un crecimiento favorable en todas las combinaciones de bases nutritivas (Figura 1).















La V1 reveló diferencias significativas con respecto a las V2 y V3 en cuanto a la promoción de crecimiento de Salmonella ser. Enteritidis a las 9, 10 y 24 h de incubación, alcanzando valores de absorbancia hasta 0.640 a las 24 h, mientras que las V2 y V3 mostraron 0.530 y 0.510, respectivamente.

El crecimiento microbiano de Salmonella ser. Typhiy Salmonella ser. Paratyphi A se vio ligeramente favorecido en la V1 a partir de las 8 h de cultivo, con respecto al resto de las variantes. Sin embargo, a las 24 h de cultivo no se hallaron diferencias significativas entre ellas, siendo estos valores en las V1, V2 y V3 de: 0.270; 0.260 y 0.260, respectivamente, para Salmonella ser. Typhi y 0.360; 0.340 y 0.360 para Salmonella ser. Paratyphi A.

Las variantes V2 y V3 mostraron una mayor recuperación de Salmonella ser. Typhimurium comparada con la V1 entre las 4 y 10 h de cultivo. A las 24 h de cultivo, se registraron valores de absorbancia (a 640 nm) semejantes entre las variantes, siendo estos valores de 0.730 (V1); 0.740 (V2) y 0.700 (V3).

Los mayores valores de absorbancia se registraron con el cultivo de Salmonella ser. Typhimurium a las 24 h de incubación, ya que, aunque Salmonella ser. Enteritidis presentó los mayores valores de absorbancia a las primeras 10 h de incubación, no se registró un aumento significativo de sus valores a las 24 h. Los menores valores se registraron en el cultivo de Salmonella ser. Typhi.

Se obtuvo un buen crecimiento de Salmonella en las variantes diseñadas con diferentes inhibidores del crecimiento bacteriano. No obstante, los valores de productividad en la formulación que utilizó sales biliares (V4) fueron superiores con respecto a la variante que empleó desoxicolato de sodio (V5) (Tabla 2).






Cada sustancia inhibidora evaluada impidió totalmente el crecimiento de las bacterias grampositivas utilizadas en el ensayo, por lo que su factor de selectividad resultó igual a cinco.

El crecimiento del género Candida en todas las diluciones ensayadas resultó inhibido totalmente en ambas formulaciones, exceptuando dos especies que mostraron un crecimiento de inhibido a escaso, a las 48 h de incubación. Candida albicans tuvo un crecimiento escaso en la V4, en las placas inoculadas con la primera dilución cuyo factor de selectividad resultó igual a cuatro, mientras que para Candida tropicalis se observó, en ambas variantes, un crecimiento pequeño de colonias (< 1 mm de diámetro) en todas las diluciones ensayadas, por lo que el factor de selectividad resultó ser 0 (Tabla 2).

Aunque la variante que utilizó desoxicolato de sodio (V5) se caracterizó por una mayor selectividad sobre los microorganismos no diana, la V4 pudo inhibir todas las bacterias grampositivas evaluadas y la mayoría de las levaduras (Tabla 2), pudiendo ser empleada en composiciones que requieran inhibir el crecimiento de estos microorganismos.

En el medio de referencia todos los microorganismos mostraron un crecimiento abundante, en todas las diluciones inoculadas.

La capacidad de recuperación de Salmonella en el ensayo comparativo entre los dos medios de cultivo que utilizan diferentes combinaciones nutricionales e inhibidores del crecimiento bacteriano y el agar triptona soja, resultó igual o superior al 85% (Figura 2).






La media de la relación de productividad de Salmonella ser. Typhi ATCC 19430 fue de 1.12 ± 0.09 para la V4, mostrando diferencias significativas con respecto a SCM, que fue de 0.85 ± 0.14.

A pesar de que en la media de la relación de productividad calculada para el resto de los serotipos no se hallaron diferencias estadísticamente significativas, se observaron ligeras diferencias. Para Salmonella ser. Typhi ATCC 7251 y Salmonella ser. Typhimurium ATCC 14028 la productividad resultó ligeramente superior para SCM con valores de 1.05 ± 0.09 y 0.88 ± 0.16; respectivamente, en comparación con la V4 en la que se obtuvieron valores de 0.96 ± 0.12 y 0.84 ± 0.15; respectivamente. Con Salmonella ser. Typhimurium ATCC 13311 y Salmonella ser. Paratyphi A ATCC 8005 la formulación exprimental (0.90 ± 0.07 y 1.03 ± 0.10) superó ligeramente a la formulación comercializada por Oxoid (0.89 ± 0.07 y 0.97 ± 0.11).


Discusión

El aumento en la producción de biomasa microbiana en el tiempo puede estar relacionado con el porcentaje de nitrógeno amínico y total, contenidos en forma de polipéptidos, péptidos y aminoácidos, imprescindibles para el crecimiento microbiano.^26,27

La peptona bacteriológica y la de corazón contienen mayor porcentaje de nitrógeno amínico (2.4-4.0% y 2.8-4.8%) y nitrógeno total (13.0-17.0% y 9.8-12.3%) que la peptona de soja (1.71-1.73% y 8.34-8.85%),^27,28 lo que demuestra que las peptonas de origen animal contienen mayor número de péptidos de bajo peso molecular que son asimilables por la mayoría de los microorganismos.⁹

La peptona bacteriológica contiene mayor cantidad de arginina, mientras que la peptona de corazón contiene elevadas concentraciones de ácido glutámico, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, treonina, triptófano y valina.²⁷

Las bases nutritivas de origen animal proporcionan al medio de cultivo mayor cantidad de manganeso que las de origen vegetal, micronutriente fundamental en la activación de muchas enzimas. La peptona de corazón contiene mayor cantidad de fósforo que la peptona de soja, compuesto considerado como macronutriente y de gran importancia en la síntesis de ácidos nucleicos y fosfolípidos.^27,29

Las bases nutritivas desarrolladas en BioCen presentan concentraciones bajas de ion cloruro. Esto favorece el crecimiento de los microorganismos, ya que altas concentraciones de cloruros romperían el equilibrio osmótico entre el medio de cultivo y la célula provocando la lisis de esta última.^27,28 Además, estas bases nutritivas contienen una baja concentración de plomo, elemento tóxico para la célula.³⁰

Los menores valores de absorbancia obtenidos con el cultivo de Salmonella ser. Typhi podrían estar relacionados con que estos microorganismos se caracterizan por un metabolismo lento.²⁰

Los resultados obtenidos coinciden con lo informado por otros autores, los cuales utilizan estas mezclas de bases nutritivas en una gran variedad de medios de cultivo destinados a este género. Rambach utiliza peptona y extracto de levadura para el desarrollo de Salmonella, mientras que Cooke y colaboradores emplean peptona y triptona. Otros medios, como el caldo Rappaport-Vassiliadis con soja, contiene peptona de soja como fuente de carbono y nitrógeno para el enriquecimiento selectivo.^7,15,16,31

En un estudio realizado sobre la influencia de la combinación de bases nutritivas e inhibidores sobre el crecimiento de Salmonella, se demuestra que la mezcla de bases nutritivas de diferentes orígenes favorece una mejor recuperación en el tiempo, de los serotipos del género con respecto a la composición que contiene una sola fuente de nutrientes.³²

El extracto de levadura constituye una fuente de vitaminas como la B1, B2, niacina (B3) y ergosterol, precursor biológico de la vitamina D. Por ello esta fuente de nutrientes de origen microbiano se encuentra en la mayoría de medios de cultivo para diferentes propósitos.³³

El hidrolizado enzimático de caseína brinda a las composiciones compuestos nitrogenados de un origen diferente, además de calcio, hierro y cinc, elementos fundamentales en el metabolismo celular.^27,29

La mezcla de nutrientes de diferentes orígenes garantiza que exista una amplia variedad de componentes esenciales para una adecuada recuperación y crecimiento de Salmonella, incluso cuando estas bacterias se encontraron en baja concentración (1.5 UFC/ml).

Merritt y Donaldson destacan que las sales biliares pueden causar daños en el ADN, proteínas y membrana celular de un gran número de bacterias. Sin embargo, se ha detectado una variedad de genes y mecanismos involucrados en la resistencia de Salmonella a este compuesto. También informan que la activación de marRAB actúa reduciendo la transcripción de la porina ompF, la cual reduce la entrada de sales biliares a la célula, mientras que acrAB podría promover la excreción de sales biliares fuera de la célula, creando así un mecanismo de resistencia para el efecto dañino de las sales biliares. Además, otras proteínas como RecA, RecBCD, DinB y PolV actúan sobre la reparación del daño del ADN.³⁴

Jang y colaboradores informan que las sales biliares actúan sobre el enlace entre el ácido murámico y la alanina del peptidoglicano que conforma la pared celular, por la activación de la enzima amidasa que depende de la presencia de colina en el ácido teicoico, impidiendo el crecimiento de un grupo de bacterias grampositivas.³⁵

Las levaduras, para su crecimiento, requieren una composición rica en glúcidos como fuente fundamental de nutrientes y en las formulaciones evaluadas los hidratos de carbono se encuentran en poca concentración afectando su desarrollo.⁹

Según la ISO 11133-2 (2003) las composiciones cumplen con el criterio de selección de los medios de cultivo selectivo. Ambos inhibidores pueden ser considerados adecuados para formar parte de la composición final de medios de cultivo destinados para la detección de Salmonella, pero la composición con sales biliares garantiza un mayor valor promedio de productividad.

Los valores cercanos de productividad de la V4 y SCM pueden deberse a que la peptona especial, fuente de nutrientes del medio de cultivo SCM, es una mezcla de hidrolizado enzimático de caseína, hidrolizado enzimático de proteínas de tejido animal y en menor proporción de peptona de soja. Esta base nutritiva mixta tiene una composición fisicoquímica y un contenido de aminoácidos y minerales semejante a las bases nutritivas que componen la variante experimental, solo se destaca una mayor concentración del cinc,²⁷ microelemento que tiene un papel estructural en determinadas enzimas, según lo referido en Merck Manual Microbiology en su duodécima edición.

El uso de antibióticos en los medios de cultivo^22,31,36,37 para aumentar su selectividad disminuye el período de vida útil de estos listos para el uso.

Estos resultados demuestran que se logró un equilibrio en la formulación experimental entre los nutrientes y los inhibidores de las bacterias grampositivas, elemento importante a tener en cuenta para el diseño de diagnosticadores.


Conclusión

La mezcla de hidrolizado pancreático de tejido animal, extracto de levadura e hidrolizado enzimático de caseína y las sales biliares como inhibidor de crecimiento de bacterias grampositivas resulta una combinación eficaz, capaz de promover el crecimiento del género Salmonella cuando estás bacterias se encuentran en baja concentración.

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