Hemolytic uremic syndrome and renal handling of proteins

Abstract
Hemolytic uremic syndrome (HUS) is defined by the triad of hemolytic anemia microangiopathic, thrombocytopenia and acute renal failure. In Argentina it constitutes the first cause of acute renal failure in Pediatrics. Approximately 2-4% of patients die during the acute phase of the disease, and only a third of the remaining 96% survive with renal sequelae, such as the persistence of proteinuria.

A healthy adult filters around 5000 mg/day of proteins, with an excretion in urine of 150 mg/day. The little quantity of proteins excreted indicates the presence of a reabsorption mechanism at the level of the proximal tubule. Therefore, the tubular reabsorption plays a very important role since it is the main mechanism responsible for preventing the depletion of protein.

For approximately 30 years, it has been known that albumin is reabsorbed in the proximal tubule. Protein reabsorption occurs by a clathrin-dependent receptor mediated endocytosis mechanism and by fluid phase endocytosis. The basic mechanism of renal damage in typical and atypical HUS has been described as a thrombotic microangiopathy, but of different causes. However, the pathophysiology of this disease is more complex than what was believed since the emerging tubular alteration will ewvolve into failures of the protein endocytosis mechanism that are added to the alterations at the level of the glomerular filtration barrier.

Key words
proteinuria, megalin, cubilin, FCRN, podocyte, endocytosis, slit diaphragm, hemolytic uremic syndrome, atypic hus, renal failure

Artículo completo
Introducción

El síndrome urémico hemolítico (SUH) está definido por la tríada de anemia hemolítica microangiopática, trombocitopenia e insuficiencia renal aguda. El 90% de los casos de SUH es típico, con la presencia de diarrea asociada con bacterias patógenas como Escherichia coli 0157-H7, productora de toxinas Shiga tipo I y II.¹

En Argentina constituye la primera causa de insuficiencia renal aguda en pediatría; la fuente de contagio más común es el consumo de carne mal cocida. Asimismo, la transmisión de persona a persona ha sido comprobada en convivientes de niños que lo padecían.²
Aproximadamente, entre el 2% y el 4% de los pacientes fallecen durante la fase aguda de la enfermedad, y solo un tercio del 96% restante que sobrevive lo hace con secuelas renales, como la persistencia de la proteinuria. Los parámetros a tener en cuenta en la evolución a la cronicidad³ son la persistencia de la proteinuria asociada con la aparición de fibrosis tubulointersticial.⁴
La forma de SUH atípica obedece a diversas etiologías⁵ y representa alrededor del 5% al 10% de los casos; la forma familiar corresponde a menos del 3% y se vincula principalmente con la desregulación en la vía alternativa del complemento. Se han descrito patrones de herencia autosómica, tanto dominante como recesiva, implicados en la región cromosómica 1q32. Esta región del genoma humano contiene el denominado sistema regulador de la activación del complemento humano (human regulator of complement activation; RCA) un conjunto de genes que codifican proteínas del complemento presentes en el plasma o en las superficies celulares, cuya función es regular la activación del complemento como el factor H.⁵
Aunque las lesiones glomerulares observadas en el SUH típico involucran principalmente la aparición de microangiopatía trombótica, es muy poca la información disponible hasta el momento acerca del efecto de la toxina Shiga en la evolución de la lesión renal y el origen de la proteinuria.

 
Manejo renal de proteínas en condiciones normales

Un individuo adulto sano filtra alrededor de 5000 mg/día de proteínas,⁶ con escasa excreción en orina (150 mg/día). La escasa cantidad de proteínas excretadas indica la presencia de un mecanismo de reabsorción a nivel del túbulo proximal.^6,7 Por lo tanto, la reabsorción tubular renal desempeña un papel muy importante ya que, ante una función glomerular normal, es el principal mecanismo encargado de evitar la depleción proteica corporal.

La principal proteína del plasma de los mamíferos es la albúmina, la cual cumple con funciones vitales para el organismo.^8,9 El riñón es el órgano encargado de mantener la concentración plasmática de albúmina evitando su pérdida por orina. La albuminuria ha sido utilizada desde hace años como marcador de lesión renal, ya sea que esta pérdida esté originada en una disfunción glomerular, en una alteración de la reabsorción tubular o en una combinación de ambas.

  
Función glomerular

El primer sitio de la nefrona donde se inicia el manejo renal de las proteínas es el glomérulo, que presenta uno de los más altos niveles de permeabilidad al agua de los tejidos de mamíferos, mientras que actúa simultáneamente como una de las mayores barreras selectivas para solutos en el cuerpo. 

La filtración proteica está determinada por las diferentes capas de la barrera de filtración glomerular. La primera capa es el endotelio vascular, el cual se encuentra revestido por una sialoproteína de carga negativa llamada podocalixina.¹⁰ Es un endotelio fenestrado, cuyos poros miden hasta 70 nm y limitan solamente el paso de los elementos figurados de la sangre.¹¹ La segunda capa es la membrana basal glomerular, con un grosor de aproximadamente 300 a 350 nm, y que está compuesta por tres partes: lámina rara interna, lámina densa y lámina rara externa. Esta segunda capa está formada principalmente por colágeno tipo IV, laminina, nidógeno y proteoglucanos (perlecano y agrina).¹² También tiene carga negativa (antiguamente conocida como polianión de la membrana basal). La membrana basal constituye un filtro físico para moléculas con un peso molecular superior a 1 kDa.^6,13
A pesar de que, históricamente, siempre se consideró a la membrana basal como la principal determinante de la filtración glomerular, actualmente se ha visto que es la tercera capa la que define las características del ultrafiltrado. En efecto, esta capa está formada por las células epiteliales viscerales de la cápsula de Bowman (podocitos). Estos son considerados como uno de los componentes más importantes de la barrera de filtración glomerular, sobre todo en relación con el manejo de las proteínas. Por lo tanto, constituyen un sitio clave en la patogénesis de la enfermedad renal proteinúrica.¹⁴
El podocito tiene una estructura compleja: está formado por un cuerpo y por las prolongaciones primarias de las que se originan los pies o pedicelos en contacto directo con la membrana basal del capilar glomerular. El espacio entre dos pedicelos constituye una estructura conocida como diafragma de filtración, con poros de 4 a 14 nm.¹⁵ En este sitio hay una gran cantidad de proteínas que unen los podocitos entre sí y con el citoesqueleto de actina.
Una de las primeras proteínas descritas fue la nefrina, producto del gen NPHS y una de las proteínas claves en el funcionamiento del diafragma.¹⁶ Aunque la función de la nefrina aún no está completamente dilucidada, estudios recientes indican que actúa como una molécula de señalización que mantiene la estructura del citoesqueleto de actina.^14,17,18 Alteraciones en su función pueden manifestarse como borramiento de los pies de los podocitos.

La superficie externa de los podocitos está cubierta por podocalixina,¹⁰ que también reviste el endotelio capilar. Esta proteína permite la separación entre los pedicelos y la formación del diafragma de filtración. La podocalixina es el blanco del daño en muchas enfermedades renales glomerulares que afectan la forma de los pedicelos y que, por lo tanto, también alteran la expresión de las proteínas del diafragma.^19,20
Una de las consecuencias de la disfunción podocitaria es la aparición de albuminuria. Aunque esta última es un importante marcador del inicio y la progresión de la enfermedad renal,²¹ el mecanismo por el cual se produce la albuminuria aún es tópico de debate. Estudiamos en nuestro laboratorio ratas inoculadas con sobrenadante de cultivo de bacterias recombinantes que expresan Stx2, en dosis letales. Estos animales presentaron un cuadro clínico e histopatológico similar al observado en los seres humanos.²² Mediante técnicas de inmunohistoquímica detectamos una disminución de la señal para nefrina y podocalixina, resultado que fue corroborado por Western blot. Obtuvimos resultados similares en un riñón humano con SUH atípico por déficit de factor H.

 
Función tubular

El segundo punto en la nefrona encargado del manejo de las proteínas es el túbulo proximal. Desde hace aproximadamente 30 años se sabe que la albúmina es reabsorbida en el túbulo proximal.²³ La reabsorción proteica se produce por un mecanismo de endocitosis mediada por un receptor dependiente de clatrina y por una endocitosis por fase líquida. Una vez endocitada por cualquiera de los dos mecanismos, la proteína sigue la vía endosomal hacia el lisosoma, donde es degradada,^24,25 o bien puede seguir una vía de transcitosis a través de la célula, desde la membrana apical hasta la basolateral, que la dirige a la sangre sin ser degradada.^26-29
Las proteínas involucradas en la endocitosis dependiente de clatrina incluyen un complejo formado por megalina y cubilina. La megalina tiene un peso molecular de 600 kDa y pertenece a la familia de receptores LDL (LDLR).³⁰ Por su parte, la cubilina tiene un peso molecular de 460 kDa.
La albúmina puede ser rápidamente degradada en pequeños péptidos que vuelven al líquido luminal y son excretados como restos de albúmina en la orina.³¹ La endocitosis no selectiva en fase líquida es un mecanismo rápido de reabsorción.^32,33 Ambos mecanismos (dependiente de clatrina y fase líquida) presentan diferente expresión en los segmentos del túbulo proximal, con lo que la reabsorción y la degradación dependiente de clatrina son mayores en S1.^31,34,35 La endocitosis en fase líquida está relacionada con el receptor Fc neonatal (FcRn), que se expresa en los seres humanos a nivel renal en el endotelio, los podocitos, el túbulo colector y la membrana apical del túbulo proximal.³⁶ Su función es transportar albúmina a través de membranas, preservando las características funcionales de la molécula.³⁷
Tanto las vesículas endocíticas dependientes de clatrina que contienen albúmina unida a megalina y cubilina, como las de fase líquida que contienen albúmina unida a FcRn tienen un pH intravesicular de 5 aproximadamente. Sin embargo, se ha identificado en vesículas endosómicas que incluyen FcRn un comportamiento diferente a la megalina y a la cubilina con respecto al pH intraendosomal. Este pH bajo produce la disociación de la albúmina de la megalina y la cubilina, permitiendo su pasaje al lisosoma y el reciclamiento de los receptores a la membrana. Pero esta disminución del pH aumenta la unión de la albúmina a FcRn.^37-40 De esta forma, la albúmina escapa de la vía de degradación lisosomal^41,42 y realiza la transcitosis,^43-45 permitiendo el pasaje de albúmina de vuelta a la circulación (Figura 1).






Estudios funcionales han demostrado que la megalina^46,47 está regulada por el factor de crecimiento transformante beta 1 (TGF-beta1), afectando el nivel de albúmina urinaria. Existe información de que el daño tubular observado en el SUH es inducido por efecto directo de la toxina Shiga en las células epiteliales tubulares.⁴⁸ En las ratas inoculadas con dosis letales de toxina Shiga²² hemos caracterizado la respuesta tubular temprana. Detectamos un cambio inmunofenotípico inducido por TGF-beta1. Este es el primer paso en la evolución a una transformación epitelio-mesenquimática y a la aparición posterior de fibrosis intersticial.

Teniendo en cuenta nuestros resultados es factible que la función tubular se encuentre alterada y, por lo tanto, se manifieste con una disfunción a nivel de la reabsorción tubular de proteínas. En efecto, hemos encontrado que la megalina disminuye su expresión en la superficie del túbulo proximal, formando inclusiones intracitoplasmáticas, tanto en el SUH típico como en el atípico.

 
Conclusión

Recientemente, la función específica de la barrera de filtración glomerular y del túbulo proximal en el manejo renal de proteínas y la aparición de albuminuria ha sido reevaluado. La filtración de albúmina bajo condiciones fisiológicas es mayor de lo que se creía hasta el momento. De esta forma, se ha determinado la importancia del túbulo proximal en minimizar la pérdida de albúmina filtrada por medio de la reabsorción de esta sustancia. El túbulo normal reabsorbe prácticamente toda la albúmina filtrada (Figura 2).






Cuando hay una alteración glomerular, el túbulo continúa reabsorbiendo albúmina, pero se pierden las de origen glomerular (proteinuria de causa glomerular) (Figura 3A). Sin embargo, cuando la lesión tubular se observa en ausencia de daño glomerular, se produce una proteinuria caracterizada por la presencia de albúmina, por alteración en la endocitosis (Figura 3B). Cuando, en forma conjunta, existe lesión glomerular y tubular se encuentran proteínas en orina que corresponden a las eliminadas por daño de la barrera de filtración glomerular y a las que no se han podido reabsorber en el túbulo proximal (Figura 3C). Este último sería el caso de producción de proteinuria, tanto en el SUH típico como en el atípico.







Clásicamente se ha descrito que el mecanismo básico del daño renal en el SUH típico y en el atípico es una microangiopatía trombótica, pero de diferentes causas. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que la fisiopatología de esta enfermedad es más compleja de lo que se creía ya que la alteración tubular que surge va a evolucionar en fallas en el mecanismo de endocitosis de proteínas que se suman a las eliminadas por las alteraciones a nivel de la barrera de filtración glomerular.

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