Abstract
Introduction: Free-living amoebas are microorganisms that can be found in different environments, like water or soil. They live in different ecosystems and may cause serious diseases. These parasites can carry phagocytosis-resistant intracellular bacteria that later invade the host and cause bacterial diseases. Therefore, amoebas are an important vehicle for the transmission of diverse pathologies of public health concern.

Objective: This paper focuses on the identification of free-living amoebas in samples of water from wetlands. The objective was to assess whether the amoebas were carrying potentially pathogenic intracellular bacteria.

Materials and methods: Water samples were collected and temperature, pH and turbidity values were recorded. Culture medium was standardized with Page saline solution, Harmannella 1 and Harmannella 2, to define optimal conditions for amoeba growth. Then, amoebic lysis was generated and spread in blood agar, chocolate agar, and MacConkey agar with the aim of confirming the presence of intracellular pathogens. Also, Gram and Ziehl-Neelsen stains were employed.

Results: A considerable proportion of Acanthamoeba and Harmannella genres were obtained. The implementation of lysis protocols for intracellular bacteria processing enabled Enterobacter cloacae, Klebsiella oxytoca, Escherichia coli, Bacillus licheniformis, and Bacillus cereus to be identified.

Conclusions: Free-living amoebas were isolated from wetland environments, and intracellular bacteria potentially associated to infectious processes were identified in immunocompetent and immunocompromised patients.

Key words
amoeba, freshwater, intracellular bacteria, public health

Artículo completo
Introducción

Las amebas de vida libre (AVL) son un grupo de microorganismos ubicuos presentes en ambientes como agua, suelo y materia orgánica en descomposición, son capaces de causar enfermedades de importancia clínica; como la meningoencefalitis amebiana primaria (MEAP) causada por el género Naegleria y queratitis por Acanthamoeba (QA); encefalitis granulomatosa amebiana (EGA) y acanthamoebosis cutánea (AC) especialmente en población con compromiso inmunológico.

Desde hace varios años la literatura ha venido ilustrando cómo las AVL tienen la capacidad de albergar intracelularmente diversas bacterias que forman fagolisosomas para la digestión,^1-3 lo que les permite convertirse en resistentes, ya que se internalizan o son capaces de sobrevivir, crecer y salir de amebas de vida libre después de este proceso.

Para la salud pública resulta de importancia la identificación de los géneros de las amebas de vida libre que habitan en humedales y zonas inundables en Bogotá y la región de Cundinamarca, de manera tal de establecer posibles asociaciones ameba-bacteria teniendo en cuenta la capacidad de las amebas de asociar bacterias patógenas en un fagolisosoma. Así, el aislamiento a partir de muestras aleatorias de zonas urbanas o rurales permite determinar y caracterizar bacterias intracelulares, lo cual puede convertirse en un posible indicador que relaciona la incidencia de enfermedades emergentes y reemergentes en pacientes inmunocompetentes e inmunocomprometidos, a expensas de las bacterias mencionadas anteriormente.

Este estudio permitió identificar, en las muestras analizadas, amebas de vida libre de los géneros Acanthamoeba, Hartmanella y Naegleria; posteriormente se realizó la lisis amebiana y se aislaron bacterias que están en asociación con las amebas. Se halló Enterobacter cloacae, Klebsiella oxytoca, Escherichia coli, Bacillus licheniformis y Bacillus cereus; estas bacterias se encuentran principalmente en el medio ambiente pero pueden estar implicadas en procesos patológicos.


Materiales y métodos

Dentro de un estudio descriptivo transversal se estableció el protocolo para el cultivo de las amebas de vida libre, seguido de la lisis amebiana y la identificación bacteriana.


Muestreo

Se tomaron en total 20 muestras de agua en siete sitios dentro y fuera de Bogotá, en cada localización se llevó a cabo la medición de temperatura, pH y, de manera cualitativa, la turbidez en escala, baja, mediana y alta.^4-6 El lugar específico de la toma de muestras se ubicó usando las coordenadas geográficas mediante el sistema GPS (Tabla 1).






Diseño del protocolo de medios de cultivo

Se eligieron medios de cultivo óptimos para el crecimiento y viabilidad de las amebas de vida libre, medios con base en solución salina de Page (agar no nutritivo), Hartmannella 1 y Hartmannella 2.⁷

Las muestras de agua se filtraron y centrifugaron a 1500 rpm durante 10 minutos, para el proceso de filtración se utilizó gasa estéril, luego se sembraron en cada uno de los agares y se incubaron a 37°C.

Al agar no nutritivo se le adicionaron de dos a cuatro UFC de una cepa ATCC de Escherichia coli⁷ para proveer nutrición a las posibles AVL que se encontrasen en la muestra sembrada. A las 24 horas, se observaron las placas de agar en fresco al microscopio para comprobar la presencia de amebas; para hidratar los medios a diario, se agregó 1 ml de la solución de Page al agar no nutritivo y al agar Hartmanella 1. Se realizó montaje en fresco durante siete días para observar las características microscópicas que presentaron los medios.

Al terminar la observación de siete días, se determinó que el uso de los medios agar no nutritivo y Hartmanella 2 proporcionaron mayor crecimiento y menor contaminación de las AVL; por lo tanto, estos medios fueron seleccionados para la continuidad del estudio.


Elección y ejecución de cepas para lisis

Después de una observación en fresco durante 10 días de cada una de las muestras, se aislaron de los agares los trofozoítos de AVL, se lavaron con solución salina y se centrifugaron durante 15 min para su purificación y sedimentación; el sedimento se centrifugó por 30 min, después de ese tiempo se montaron en fresco, y se verificaron cambios morfológicos, se repitió el proceso de centrifugación a 3000 rpm, finalmente se realizó un montaje en fresco en el que se hallaron algunas bacterias, el producto de esta lisis amebiana se sembró en agar sangre, agar chocolate y agar MacConkey a 37°C durante 24 horas; también se realizaron coloraciones de Gram y Ziehl-Neelsen.


Sistema de identificación bacteriana

Se analizó el crecimiento en cada uno de los agares sembrados y por medio de la coloración de Gram se determinó la afinidad por coloración, posteriormente mediante el sistema BBL Crystal® se identificó el género y la especie de las bacterias producto de la lisis amebiana.


Resultados

In situ se determinaron las propiedades fisicoquímicas, el pH promedio fue de 8.0 y la temperatura de 18°C, en relación con la turbidez, fue valorada cualitativamente como media.

A todas las muestras recolectadas se les realizó un seguimiento desde el día de la siembra de la muestra en agar no nutritivo y Hartmanella 2 hasta el día 10, en el cual se tomaron las muestras que presentaron formas de trofozoítos, para continuar la segunda etapa del estudio, que correspondió a la lisis de las amebas de vida libre.

Se logró determinar, al igual que otros autores,^9,10 que el agar no nutritivo es el medio de cultivo propicio y el que más rendimiento ofrece para el cultivo de AVL, tanto para formas quísticas como de trofozoítos; se halló que el medio Hartmanella 2 también sirve para el cultivo de AVL y que también se logra obtener formas de quistes y trofozoítos, aunque este medio presentó mayor contaminación al albergar diversidad de bacterias y levaduras, las cuales son difíciles de eliminar con las resiembras.


Caracterización de las amebas de vida libre

Se identificaron amebas de vida libre en los puntos de muestra, la identificación adicionalmente determinó la presencia en el medio de bacterias y levaduras, los hallazgos y la clasificación se relacionan en la Tabla 2.






En el montaje en fresco algunas de las amebas de vida libre mostraron características morfológicas como trofozoítos de entre 17 y 25 µm con seudópodos finos y gruesos alargados, de aspecto más redondo y núcleo central, endoplasma con vacuolas digestivas; quistes de 10 a 12.5 µm, con membrana refringente, pared lisa; morfología compatible con Acanthamoeba spp. tipo II, según la clasificación de Pussard y Ponds (Figura 1).






También se identificaron trofozoítos alargados de 20 µm, con lobópodos gruesos, núcleo central y endoplasma con vacuolas digestivas; quistes de 10 µm, con membrana refringente, pared lisa; morfología compatible con Hartmanella spp.; en algunos casos sus movimientos fueron lentos, con la proyección de seudópodos (Figura 2).






Finalmente se identificaron trofozoítos alargados de 25 a 35 µm, con lobópodos gruesos, núcleo central y endoplasma con vacuolas digestivas; quistes de 15 µm, con doble membrana refringente, pared lisa, y núcleo excéntrico; morfología compatible con Naegleria spp. (Figura 3).






De las AVL encontradas, purificadas y a las que se les produjo lisis, se recuperaron aislamientos de Enterobacter cloacae, Klebsiella oxytoca, Escherichia coli, Bacillus licheniformis y Bacillus cereus, lo que puso de manifiesto la capacidad albergar bacterias de manera intracelular (Tabla 3). Mediante la coloración de Ziehl-Neelsen se identificó la presencia en el sedimento de las muestras de la zona 7: eje ambiental, la presencia de bacilos ácido alcohol resistentes, en la coloración de Gram se confirmó la existencia de bacterias tanto gramnegativas como grampositivas.

Existe entonces una asociación ameba-bacteria en la que se pueden relacionar procesos ecológicos dentro del microambiente que se origina en la naturaleza.






Discusión

Existe una asociación ecológica entre las amebas de vida libre y las bacterias en el microambiente; una de las principales radica en el biofilm, que consiste en microcolonias bien organizadas envueltas en matrices poliméricas. Dentro de estos biofilmes, las amebas de vida libre constituyen el principal regulador de la población bacteriana y son organismos de interés en la adaptación de las bacterias al interior de las células eucariotas, esto permite la adaptabilidad de bacterias como Legionella y su resistencia a situaciones adversas, así como la propagación rápida en condiciones favorables.^12,13

Algunas asociaciones ameba-bacteria son de tipo intracelular obligado, como Coxiella burnetii; intracelular facultativo, como Listeria monocytogenes, y endosimbiontes tales como Parachlamydia-Acanthamoeba, en función de la citopatogenicidad se encuentra el modelo de Legionella pneumophila.¹⁴ Para este mecanismo de asociación se ha estudiado la interacción mediada por la adaptación auxotrófica con el aminoácido cisteína originando una relación nutricional de L. pneumophila y la ameba como hospedero; este tipo de asociación está además mediado por mecanismos de virulencia presentes incluso en células eucariotas.¹²

Dentro de este mecanismo de virulencia de L. pneumophila se ha estudiado en modelos tales como el de Hartmanella vermiformis, en donde se halló una unión a través de ligandos bacterianos tipo pili; la infección por L. pneumophila está mediada por un receptor inducido por endocitosis.¹⁵ La interacción inicial con el protozoo tiene lugar mediante un sistema de fagocitosis convencional;15 luego, la expresión de las proteínas tipo Phil 2 Lp no permite la unión del lisosoma con el fagosoma, con lo cual se evita la eliminación y se posibilita la supervivencia de Legionella spp. dentro de la ameba.¹⁶

En este estudio, después de las lisis de las amebas de vida libre encontradas se logró identificar aislamientos de Enterobacter cloacae, Klebsiella oxytoca, Escherichia coli, Bacillus cereus y Bacillus licheniformis. En los últimos años han surgido enterobacterias con resistencia a los antimicrobianos, asociadas con cuadros clínicos de las llamadas enfermedades infecciosas reemergentes, con consecuencias sociales y económicas.¹⁷

Adicionalmente, las bacterias gramnegativas aisladas, al disponer de un sistema de cápsula mucoide alrededor de la bacteria que impide la fagocitosis favorecen su frecuencia de presentación en aislamientos de AVL, incluso pueden coexistir con las AVL en la reproducción in vitro en el agar no nutritivo.¹⁸

En relación con la presencia de Enterobacter cloacae, este microorganismo es conocido como agente causal de meningitis neonatal y sepsis, origina infecciones del tracto urinario, sobreinfección en heridas y neumonías.¹⁹ El aislamiento se obtuvo de las zonas 3, 5 y 6, asociado con las AVL Hartmanella spp. y Acanthamoeba spp.

Klebsiella oxytoca se ubica dentro del grupo de coliformes que causan infecciones adquiridas principalmente en los hospitales, en su mayoría ocurridas en pacientes con compromiso inmunológico o en aquellos que requieren cuidados intensivos; se han registrado brotes de fuentes ambientales que involucran con frecuencia K. oxytoca, así como otras enterobacterias que han desarrollado resistencia mediante betalactamasas de espectro extendido (BLEE) y carbapenemasas.20 Esta condición de resistencia fue informada en 87 pacientes en un hospital de Toronto.21 Klebsiella oxytoca se encontró en el proceso de lisis de las amebas de vida libre Hartmanella spp., Acanthamoeba spp. y Naegleria spp., en las zonas 3, 7 y 9.

Respecto del aislamiento de Escherichia coli, esta bacteria se asocia más frecuentemente con sepsis bacteriana, meningitis neonatal, infecciones del tracto urinario y gastroenteritis; la composición de E. coli es compleja y se ha descrito gran número de antígenos O, H y K; al menos el 80% de las cepas de E. coli que causan meningitis tienen el antígeno polisacárido capsular K1.²² La clasificación serológica de los aislamientos tiene utilidad para fines epidemiológicos, y ciertos serotipos específicos se asocian con virulencia aumentada.²³ Escherichia coli se encontró en las zonas 1 y 3, después del proceso de lisis de las amebas Acanthamoeba spp. y Hartmanella spp.

Entro los informes de asociación se ha puesto de manifiesto la relación entre A. castellanii con una cepa de E. coli K1. Se encontró que esta cepa es capaz de sobrevivir intracelularmente, creciendo de forma exponencial y provocando la posterior lisis de la AVL en condiciones favorables de nutrientes en medios de cultivo como el medio Hartmanella; un aspecto interesante es que estos hallazgos muestran notables similitudes de interacción de E. coli K1 con los macrófagos humanos. Estas propiedades de E. coli K1 se han atribuido directamente a la expresión de proteína OmpA, determinante para la unión bacteriana, invasión, absorción y supervivencia dentro de A. castellanii.

La presencia de E. coli podría deberse a la nutrición brindada por la cepa ATCC de E. coli a cada una de las muestras sembradas, estando presente solo en las muestras de las zonas 1 y 3; por lo cual es necesario confirmar este resultado por medio de la biología molecular, teniendo en cuenta la capacidad de AVL de albergar bacterias intracelulares.

En cuanto a los aislamientos de microorganismos grampositivos, se recuperaron del género Bacillus; estos se detectan con frecuencia en aguas de consumo, incluso en las que han sido tratadas y desinfectadas mediante procedimientos aceptables. Esto se debe, sobre todo, a la resistencia de las esporas a los procesos de desinfección.²⁴ Se debe considerar que al finalizar este estudio no se encontraron indicios que avalen la presencia intracelular de este tipo de bacterias en las amebas de vida libre, por lo cual se relacionaron con su presencia ambiental ubicua en las zonas en que se aislaron (zonas 5 y 7). Adicionalmente, el hallazgo sugiere la revisión de los posibles modelos de invasión y adherencia de estas bacterias en las AVL.

Bacillus licheniformis se encuentra comúnmente en el suelo y en las plumas de las aves.²⁵ Su presencia se detectó luego de la lisis de la ameba Naegleria spp. de la zona 7, y se relaciona con la presencia de palomas (Columba livia) en el sitio de muestreo. Entre tanto, Bacillus cereus se relaciona con mayor frecuencia con brotes de origen alimentario. Esta bacteria ha sido aislada frecuentemente de hábitats naturales (suelo y plantas), sedimentos, polvo y aguas minerales; el suelo y la rizósfera pueden contener esporas de B. cereus. Los aislamientos se recuperaron de la lisis de las amebas de vida libre de los géneros Acanthamoeba y Naegleria. En las zonas 5 y 7 su presencia se relacionó con aves presentes en los sitios de muestreo: patos (Anas platyrhynchos domesticus) en la zona 5, y palomas en la zona 7.Un hallazgo mediante coloración de Ziehl-Neelsen pero no confirmado en medio de cultivo fue el de bacilos ácido alcohol resistentes (BAAR) recuperados de la zona 7, estos bacilos son atribuidos en su mayoría al complejo Mycobacterium tuberculosis.²⁶ Sin embargo, micobacterias atípicas o no tuberculosas ambientales presentan una amenaza de enfermedades emergentes.²⁷

Se han realizado estudios con micobacterias acuáticas, tales como Mycobacterium marinum, para determinar aspectos patológicos utilizando amebas de vida libre como Acanthamoeba castellanii.²⁶ Se postula que las amebas de vida libre son un depósito de micobacterias y que varias especies son ameborresistentes, pero no se han establecido los mecanismos moleculares subyacentes a esta interacción.²⁶


Respecto de las caracteísticas fisicoquímicas asociadas con el aislamiento y recuperación de las amebas

Los aislamientos se obtuvieron a una temperatura media de 18°C, sin embargo, en la literatura se ha comunicado que las AVL pueden tolerar altos grados de temperatura, siendo termotolerantes y no termofílicas.⁸ Es importante destacar que en este trabajo en las zonas de muestreo se halló una tendencia hacia la alcalinidad del agua, con un pH de entre 7 y 9, lo cual puede asociarse con la supervivencia de microorganismos como bacterias y amebas de vida libre; la turbidez permitió un acercamiento cualitativo hacia el grado de contaminación por sólidos suspendidos, por lo que es importante considerar el efecto de la filtración de las muestras en el momento del aislamiento para lograr resultados reproducibles, estas características fueron tenidas en cuenta a la hora de establecer el diseño de protocolo de los medios de cultivo para garantizar la viabilidad de las AVL.

Para lograr una lisis exitosa de las AVL, estas deben permanecer en su estadio de trofozoítos, los quistes se presentan en los medios de cultivo cuando ha tenido lugar una situación adversa; se identificó que las AVL se enquistan cuando hay escasez de nutrientes, cuando la cantidad de bacterias es alta y cuando sufrieron un cambio brusco de temperatura.

Las AVL encontradas en este estudio, a través de la identificación de las características morfológicas de los trofozoítos o quistes,²⁸ permiten confirmar la presencia de AVL de los géneros Acanthamoeba, Hartmanella y Naegleria.

Si bien en Colombia son muy pocas las investigaciones y artículos publicados sobre el impacto o las enfermedades que tienen relación con las amebas de vida libre en seres humanos y animales, una investigación realizada por Henao y colaboradores,²⁹ en la ciudad de Cali, refiere la presencia de Naegleria spp. en fuentes públicas de Santiago de Cali. En el Quindio, en 2009,³⁰ se reportó el primer caso de queratitis por Acanthamoeba spp. En Santander, Serrano Calderón³¹ describe tres casos de úlcera córnea asociados con amebas de vida libre.

Estos estudios muestran la gran importancia que tienen las amebas de vida libre en la salud pública, como microorganismos capaces de albergar bacterias de manera intracelular, relacionadas con enfermedades emergentes y reemergentes y la necesidad de investigarlas en profundidad.

Finalmente, este estudio refleja un dato importante para la salud pública, si se tiene en cuenta que en Bogotá no existe un trabajo que asocie las zonas objetivo del muestreo con la presencia de amebas de vida libre de los géneros Acanthamoeba, Hartmanella y Naegleria; estas AVL pueden implicar focos de enfermedades si las personas susceptibles tienen contacto directo con estas fuentes de agua, especialmente, los sujetos en situación de calle, los niños y los ancianos.

En general, en muchos casos no se sospecha de enfermedades ocasionadas por AVL como la queratitis amebiana primaria o la meningoencefalitis, debido a esto es importante determinar la frecuencia real de infecciones y sensibilizar al cuerpo médico sobre su presencia en el hábitat urbano.

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