PROTECTIVE EFFECT OF VALSARTAN IN NEURONAL INSULIN RESISTANCE AND INFLAMMATION IN AN EXPERIMENTAL MODEL OF TYPE 2 DIABETES

Abstract
Introduction: Diabetes mellitus type 2 (DBT2) is associated with alterations of counter-regulatory mechanisms exerted by insulin in the central nervous system. There is evidence that insulin receptor and AT1 angiotensin-II receptor are co-localized in the hypothalamus, suggesting an interaction of these two peptides in the central nervous system. On the periphery, angiotensin-II promotes oxidative stress, insulin resistance and the development of diabetic nephropathy; however, little is known whether the deleterious effects are manifested at central nervous system in DBT2. Therefore, we evaluated the effect of angiotensin-II on central insulin actions in control and streptozotocin-induced diabetic rats. Similarly, the possible central protective effect and systemic anti-inflammatory action of valsartan was studied. Materials and methods: The systemic inflammatory status was assessed by multiplex bead analysis. Neuronal insulin resistance was determined by quantification of glycemia in rats after intracerebroventricularly (ICV) administration of angiotensin-II and/or insulin, pretreated or not with valsartan. Results: It is shown that ICV administration of insulin exerts a hypoglycemic effect, whose magnitude is lower in diabetic conditions. Meanwhile central administration of angiotensin-II antagonized the hypoglycemic effects of insulin-ICV. Valsartan prevented neuronal insulin resistance, blocked the action of angiotensin-II-ICV and reduced circulating levels of pro-inflammatory cytokines. Conclusions: The results show that there is neuronal insulin resistance and systemic pro-inflammatory state in the experimental DBT2, which are partially prevented by chronic treatment with valsartan.

Key words
angiotensin, insulin, valsartan, diabetes, hypothalamus, neuronal resistance, inflammation

Artículo completo
Introducción
La diabetes mellitus (DBT) es el trastorno metabólico que genera mayor discapacidad y mortalidad, especialmente en los adultos y adultos mayores; la diabetes mellitus tipo 2 (DBT2), no dependiente de la insulina, es el tipo de diabetes presente en aproximadamente el 90% de los casos informados.¹ La diabetes tipo 2 cursa con resistencia a la insulina en los tejidos blanco y disfunción de las células beta del páncreas.² La combinación de factores genéticos y el estilo de vida pueden inducir un paulatino y sostenido incremento de los niveles de glucosa en sangre, con el consecuente incremento compensatorio en la secreción de insulina, para aumentar la captación de ésta en el tejido muscular, adiposo y hepático y normalizar la glucemia.³
La inflamación subclínica crónica parece ser un importante factor fisiopatogénico en la resistencia a la insulina.⁴ Numerosos estudios demuestran que reactantes de fase aguda aumentan antes de la manifestación clínica de la diabetes, especialmente la interleuquina 6 (IL-6), la IL-1, la proteína 1 quimiotáctica de monocitos (MCP-1), el fibrinógeno, el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-a), la proteína C-reactiva (PCR), el péptido amiloide sérico A, el inhibidor del activador de plasminógeno 1 (PAI-1), y la resistina.⁵ La resistencia a la insulina está altamente relacionada con la liberación de citoquinas proinflamatorias (tanto desde el tejido adiposo, como de macrófagos activados) y adipoquinas, principalmente la IL-6 y el TNF-a, las cuales inducen cambios sobre las proteínas de señalización de la insulina, que además de interferir con el metabolismo y almacenamiento de la glucosa, incrementan la síntesis hepática de la PCR, aumentan la producción de lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL), y alteran el metabolismo de otras lipoproteínas, causando el característico estado dislipidémico.^4,6,7 El proceso inflamatorio no sólo afecta la señalización de la insulina, sino que promueve el desarrollo de las complicaciones macrovasculares y microvasculares observadas en la diabetes tipo 2.⁸
El sistema nervioso central también parece desempeñar un papel importante en la DBT2, dada su influencia en el mantenimiento del equilibrio energético del organismo. La evidencia científica indica que el hipotálamo, específicamente el núcleo arcuato, actúa como órgano receptor, integrador y transmisor de las señales relacionadas con el estado energético del organismo, desde y hacia la periferia y dentro del sistema nervioso central (SNC).^9-11 Lam y colaboradores¹² han propuesto que un rápido y sostenido incremento en la ingesta calórica activa concomitantemente señales anabólicas, a nivel periférico, y catabólicas (regulatorias), a nivel central, y encontraron que bajo condiciones de abundancia calórica prolongada se inicia un proceso de “resistencia” hipotalámica a las múltiples señales de saciedad tanto adipocíticas como nutricionales. Estas observaciones han redireccionado el interés científico hacia el estudio de la participación del SNC en la génesis o progresión de los trastornos metabólicos. En efecto, los hallazgos experimentales demuestran que la desregulación hipotalámica parece participar en la aparición de diabetes tipo 2 en roedores. Así, el uso de agentes insulinomiméticos a nivel hipotalámico disminuye la liberación de glucosa hepática, mientras que el uso de un antagonista del canal de K⁺ activado por ATP (K_ATP) administrado en el tercer ventrículo, es capaz de revertir el efecto de la hiperinsulinemia sobre la producción de glucosa.¹³ Por otra parte, el aumento de la actividad del eje hipotálamo-hipófisis-suprarrenal induce un incremento descontrolado del estrés, el cual se asocia con una desregulación del metabolismo de la glucosa a nivel periférico.¹⁴ Se ha observado que muchas proteínas presentes en el páncreas se expresan a nivel hipotalámico, tales como el canal de K_ATP, la malonil-CoA, la glucoquinasa y la AMP quinasa, generando un sistema hipotalámico integrado que permite detectar el estado nutricional sistémico e inhibir las acciones de la insulina sobre la gluconeogénesis hepática. La disrupción del gen del receptor de insulina neuronal en ratones avala esta posibilidad.¹⁵
La insulina ejerce efectos metabólicos, neurotróficos, neuromoduladores y neuroendocrinos en el tejido nervioso,¹⁶ tiene un papel crucial en la homeostasis energética. Los niveles centrales de insulina dependen de que sus niveles séricos atraviesen la barrera hematoencefálica.^17,18 Los efectos metabólicos mediados por la insulina central tienen lugar a nivel del núcleo arcuato, a través del cual modula la conducta alimentaria tanto a corto como a largo plazo,^9,19,20 el flujo autonómico²¹ y la producción de glucosa hepática.¹³
El papel de la insulina central fue demostrado en experimentos en los que la administración intracerebroventricular (ICV) de insulina inhibía la ingesta de alimentos e inducía pérdida de peso en primates.¹⁸ Posteriormente se demostró en roedores deficientes de insulina que son hiperfágicos, y esta conducta puede ser revertida luego de la administración central de insulina.^19,22 Las acciones centrales de la insulina, también incluyen cambios en la liberación de glucosa hepática. Efectivamente, se demostró que la infusión ICV de insulina, así como de Cpd1 (un insulino-mimético), en disminuyó la liberación de glucosa hepática (~40%), con niveles basales de insulina periférica relativamente constantes¹³. Mientras que la infusión de inhibidores del canal de K_ATP dentro del núcleo arcuato, bloqueó completamente la reducción de la producción de glucosa hepática, inducida tanto por la insulina central, como por la administración periférica de lípidos¹².
Si las acciones ejercidas por la insulina a nivel central son claves en el mantenimiento de la homeostasis energética, entonces las alteraciones en este sistema deben estar relacionadas con trastornos metabólicos y viceversa. En efecto, se ha demostrado una importante asociación entre los cambios en la señalización de la insulina central, la obesidad y la DBT2. En perros, la obesidad inducida por dietas altas en grasa se ha asociado con una reducción en el transporte de insulina en el cerebro.²³ Por otra parte, ratones con una disrupción neuronal específica del gen que codifica para el receptor de la insulina, presentan obesidad sensible a la dieta, acompañada de un incremento en los niveles plasmáticos de leptina y de una ligera resistencia a la insulina, hiperinsulinemia e hipertrigliceridemia.²⁴ Estos y otros hallazgos han puesto en evidencia el importante papel que juega la insulina central sobre el equilibrio energético sistémico, y bien sea en la etiología o en la progresión, participa en la fisiopatología de la diabetes tipo 2.
Existe indica que la angiotensina II (ANG II) se asocia con la aparición de DBT2. Así, estudios con células y modelos animales demuestran que la ANG II es capaz de modular negativamente las acciones periféricas mediadas por la insulina a múltiples niveles de su cascada de señalización.²⁵ Se ha observado que la infusión ICV de ANG II induce resistencia a la insulina en ratas,^26,27 y el uso de los inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina (IECA) y de los antagonistas del receptor AT₁ de angiotensina II mejoran la sensibilidad a la insulina,^28,29 por lo que la sobrerreactividad del sistema renina-angiotensina (SRA), observada en las enfermedades cardiovasculares como la hipertensión, estaría de hecho participando en el inicio de la resistencia a la insulina en estos pacientes. Aun más, se ha observado que el uso de los IECA y de los antagonistas del receptor AT₁ reducen el daño tisular que se observa en pacientes con DBT tipo 2 (hiperplasia de la neoíntima, neuropatías), tanto en modelos con animales como en seres humanos.³⁰
Aun cuando la información avala la participación del SRA en la resistencia a la insulina, e indica que en tejidos periféricos la ANG II interfiere con la señalización de la insulina, poco se sabe acerca del efecto de la ANG II sobre la señalización de la insulina en el SNC, ni se conoce si sus acciones centrales pueden alterar la sensibilidad a la insulina en el tejido nervioso. En apoyo a una posible interacción local entre ANG II e insulina, existen estudios autorradiográficos y por hibridación in situ en los que se demuestra la existencia de receptores de insulina y de ANG II colocalizados en el hipotálamo, específicamente en el núcleo arcuato.^31,32
Por lo anterior se procedió a evaluar la posible interacción entre la ANG II y la insulina en el SNC. Igualmente se estudió el posible efecto protector del tratamiento crónico con valsartán, un antagonista selectivo de los receptores AT₁ de la angiotensina II sobre la resistencia neuronal a la insulina y el estado inflamatorio sistémico en un modelo experimental de DBT2.

Materiales y métodos
Animales de experimentación
Se emplearon ratas macho de la cepa Sprague-Dawley, de 100 a 130 g de peso corporal, procedentes del Instituto Nacional de Higiene “Rafael Rangel”. Los animales fueron mantenidos en un ambiente de luz controlada, con períodos alternos de 12 horas de luz y oscuridad, permitiéndoseles libre acceso al agua y al alimento.
Los experimentos fueron realizados siguiendo las buenas prácticas para el manejo de animales de laboratorio (NIH Guide, 1996) y contaron con la aprobación del Comité de Ética y Bioterio de la Facultad de Farmacia de la Universidad Central de Venezuela (UCV).

Modelo experimental de diabetes tipo 2
El modelo de DBT2 experimental fue caracterizado y estandarizado en nuestro laboratorio previamente,³³ siguiendo el modelo propuesto por Srinivasan y colegas,³⁴ mediante la combinación de la alimentación crónica con una dieta rica en grasas saturadas y la administración de una baja dosis de estreptozotocina (35 mg/kg). Este modelo experimental cumple con las principales características fenotípicas de la DBT2: hiperglucemia, dislipidemia, poliuria, resistencia a la insulina, inflamación de bajo grado y daño parcial en las células beta pancreáticas. En la Tabla 1 se muestran los datos que avalan el modelo experimental.





Los animales fueron divididos en cuatro grupos experimentales: grupo 1, control; grupo 2, control más valsartán (60 mg/kg, p.o., 10 semanas); grupo 3, ratas con diabetes, y grupo 4, ratas con diabetes tratadas con valsartán (60 mg/kg, p.o. 10 semanas). Durante 10 semanas los animales recibieron una dieta rica en grasa (DRG) que consistía de una mezcla de Ratarina^® (Protinal) (compuesta por un 25% de proteínas, 41% de carbohidratos y 5% de lípidos) con manteca de cerdo (que contiene aproximadamente 1% de colesterol, 40% de ácidos grasos saturados, 44% de monoinsaturados y 15% de poliinsaturados) más un suplemento del 5% con manteca de cerdo administrado por vía oral. En la semana número 8, los animales fueron tratados con una baja dosis de estreptozotocina (35 mg/kg) (Sigma Chemical Co, St. Louis, EE.UU.).

Prueba de tolerancia oral a la glucosa
La prueba de tolerancia oral a la glucosa (PTOG) ha sido ampliamente utilizada en la práctica médica para la evaluación de la tolerancia a la glucosa, la resistencia a la insulina y el diagnóstico de DBT2, esta prueba mimetiza la dinámica natural de la homeostasis de la glucosa y la insulina, por lo cual refleja la eficiencia con la que el organismo asimila la glucosa después de una carga oral. Se realizó esta prueba al finalizar del período de inducción de la diabetes en todos los grupos experimentales. A los animales les fue restringido el acceso al alimento la noche anterior a la recolección de la muestra (12-14 h de ayuno). El día del experimento, los animales recibieron una dosis oral de 1.5 g/kg de peso corporal de glucosa mediante gavage. La muestra de sangre fue recolectada de la parte terminal de la cola, antes de la administración de la glucosa, a los 30, 60, 90 y 120 minutos después. La sangre fue centrifugada a 10 000 rpm durante diez minutos, y el plasma obtenido en fresco se utilizó para los diferentes ensayos. La glucosa sanguínea se determinó por el método de glucosa oxidasa, empleando un kit comercial (Stanbio Laboratory^®). Los resultados fueron expresados en mg/dl. La insulina sérica fue determinada a través de un inmunoensayo utilizando kit de ELISA (Rat Insulin ELISA Kit, Shibayagi®), y los resultados se expresaron en µUI/ml.
Adicionalmente, con el fin de evaluar el estado de resistencia sistémica a la insulina, se determinó el índice de sensibilidad a la insulina (ISI) en los animales de estudio, utilizando la ecuación matemática desarrollada por Matsuda y DeFronzo³⁵ a partir de la PTOG, definida como:





Donde G e I, representan la concentración de glucosa (mg/dl) e insulina (µUI/ml), respectivamente, y el subíndice 0, en ayunas, y media, la concentración promedio obtenida de todas las mediciones realizadas. A menor índice, menor sensibilidad, y por ende, mayor resistencia a la insulina.

Canulación intracerebroventricular
A los animales de experimentación se les implantó una cánula en el ventrículo lateral izquierdo bajo anestesia con pentobarbital sódico (40 mg/kg, i.p.), 1 mm caudal a la sutura coronal y a 1.5 mm lateral de la sutura sagital del cráneo, mediante la ayuda de un aparato estereotáxico (David Kopf Instruments). La cánula se fijó al cráneo con cemento acrílico de secado rápido. Pasadas 72 horas de período de recuperación posoperatorio, los animales se mantuvieron en ayunas durante 12 a 16 horas antes de recibir el tratamiento ICV con ANG II, insulina o ANG II más insulina. La inyección ICV se realizó con una inyectadora Hamilton acondicionada con un tope para asegurar la penetración de la aguja a la misma profundidad de la cánula. La validez de la canulación ICV se confirmó post mortem, con la inyección, previo a la decapitación, de una solución de colorante (fastgreen, 5µl), considerándose válidos, aquellos cuya distribución del colorante se observó en los ventrículos laterales, tercero y cuarto.

Determinación de citoquinas proinflamatorias circulantes
Los niveles plasmáticos de diferentes citoquinas en los animales de estudio se evaluaron mediante el análisis multiplex de microesferas (Bio-Plex Pro Assays Cytokine, Chemokine and Growth Factors, BIORAD). Este ensayo emplea el método inmunoenzimático de sándwich estándar, usando placas de 96 pozos para la captura de anticuerpos que están acoplados a esferas fluorescentes marcadas individualmente, lo que permite la detección y cuantificación simultánea de 27 diferentes proteínas en una misma muestra. Así, se determinaron las concentraciones circulantes de IL-1alfa/beta, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, IL13, IL-15, IL-17, eotaxina, factor de crecimiento básico de fibroblastos (FGFb), FGF-g; G-CSF, GM-CSF; interferón gamma (INF-?), IP-10/CXCL10, proteína quimioatractante de monocitos-1 (MCP-1), proteína inflamatoria de macrófagos-1 alfa/beta (MIP-1a/b), el factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF), RANTES, el factor de necrosis tumoral alfa (TNFa) y VEGF. La concentración de los analitos se expresó como pg/ml.

Análisis estadístico
Los resultados fueron expresados como la media ± EEM. La significación de los resultados fue analizada mediante el análisis de varianza de una vía (ANOVA) y la prueba de Bonferroni. Un valor de p < 0.05 fue considerado significativo. El análisis de los resultados y la elaboración de los gráficos se realizaron empleando el programa Graph Pad Prism versión 5.1.

Resultados
Tolerancia a la glucosa
Para evaluar el estado de tolerancia a la glucosa, se comparó el área bajo la curva de los resultados obtenidos a través de la PTOG realizada a los animales en estudio. Los resultados muestran claramente el establecimiento de la diabetes en el grupo de animales tratados con DRG+ estreptozotocina (en ayunas: 275 ± 16 mg/dl; a los 60 minutos poscarga: 590 mg/dl ± 31, y a los 120 minutos poscarga: 455 ± 29 mg/dl), los cuales sólo después de tres horas de recibir la carga oral de glucosa lograron alcanzar valores de glucemia cercanos a los niveles basales, mientras que en los animales del grupo control se observó una normalización de la glucemia a las dos horas posteriores de la carga de glucosa. El tratamiento con valsartán en los animales de control no alteró la curva de la prueba de tolerancia a la glucosa, mientras que la redujo significativamente en el grupo de diabetes (Figura 1 y Tabla 2). En la Figura 2 se muestran los niveles de insulina plasmática en ratas alimentadas con dieta estándar (control) y diabéticas (DRG+ estreptozotocina) obtenidos durante la PTOG, y en los que se observa que los valores de insulina a los a 0 y 120 minutos son significativamente menores en las ratas diabéticas en comparación con los controles, mientras que los valores se igualan en ambos grupos a los 60 minutos. El cálculo del ISI demuestra que el índice de sensibilidad a la insulina en el grupo control fue mayor que en los animales diabéticos (C = 0.875 vs. Diab = 0.34).













Evaluación del estado inflamatorio sistémico
La determinación fluorométrica de los niveles de las citoquinas inflamatorias en el plasma de los animales en estudio permitió cuantificar niveles basales de 27 citoquinas y factores de crecimiento plasmático de los cuales sólo se observó un incremento significativo en los niveles de IL-1ß, IL-6, TNF-a y MIP-1a en las ratas diabéticas. El tratamiento crónico con valsartán no alteró el incremento de los de TNFa y MIP-1a pero previno parcialmente el incremento de los niveles de IL-6 e IL-1ß en los animales diabéticos (Figura 3).





Efecto de la insulina y la angiotensina II - ICV sobre la glucemia en ratas diabéticas, tratadas o no con valsartán crónicamente
Se determinó la concentración de glucosa en sangre de todos los animales en estudio antes de la administración ICV de insulina, angiotensina II o angiotensina II más insulina y dos horas después. En los animales de control, la administración ICV de insulina redujo significativamente los niveles de glucosa sanguínea en un 21.26% ± 4.2%, mientras que la angiotensina II los incrementó en un 13.6% ± 3.6%. El pretratamiento con angiotensina II no sólo abolió completamente el efecto hipoglucemiante de la insulina, sino que indujo un incremento del 10.5 ± 2.3% de la glucemia a las dos horas (Figuras 4 y 5, primer panel). En los animales de control tratados crónicamente con valsartán, se mantuvo el efecto hipoglucemiante de la insulina similar al control (14.8% ± 5.3%), sin embargo se bloqueó el incremento de la glucemia inducido por la angiotensina II en un 51.98% (6.53% ± 2.8%) y se revirtió el efecto hiperglucemiante observado en los animales controles que recibieron angiotensina II e insulina (Figuras 4 y 5, segundo panel). En las ratas diabéticas la administración central de insulina no fue capaz de inducir una disminución significativa de los niveles de glucosa sanguínea, e igualmente se observó una reducción significativa en el efecto hiperglucemiante inducido por la angiotensina II (Figuras 4 y 5, tercer panel). Finalmente, en los animales diabéticos que recibieron valsartán crónicamente, se recuperó el efecto hipoglucemiante de la insulina en un 44%, y se bloqueó el incremento de la glucemia inducido por el tratamiento combinado con angiotensina II e insulina (Figuras 3 y 4, cuarto panel).











Discusión
La diabetes mellitus tipo 2 es una enfermedad compleja y multifactorial, en la que a pesar de la intensa investigación que se ha realizado, aún persisten numerosas incógnitas acerca de los mecanismos patogénicos que participan en su desarrollo. Entre los ámbitos de la diabetes menos abordados, se encuentra la posible interacción entre la insulina y el sistema renina-angiotensina cerebral en la génesis y progresión de la enfermedad. Por ello, en el presente estudio se evaluó el efecto del tratamiento crónico con valsartán sobre la resistencia periférica y neuronal a la insulina, así como el estado inflamatorio sistémico de los animales diabéticos.
La prueba de tolerancia oral a la glucosa podría ser considerada como la prueba más cercana al manejo fisiológico de la glucosa, mimetizando la ruta natural de entrada al organismo (vía oral) de los carbohidratos. La glucosa administrada es absorbida a través del intestino delgado, ingresa en la circulación esplácnica y luego en la circulación sistémica. Este proceso, además de estimular directamente la liberación de insulina, también estimula la liberación de incretinas, las cuales a su vez incrementan la sensibilidad del páncreas a la glucosa, facilitando la liberación de insulina. Si bien muchos factores neuroendocrinos afectan el manejo de la glucosa por el organismo, la PTOG refleja indirectamente la eficiencia con la que el organismo asimila este nutriente después de su carga oral. Mediante esta prueba pudimos observar un rápido incremento en los niveles plasmáticos de glucosa en los animales de control, los cuales regresaron a sus niveles basales aproximadamente dos horas después de la carga oral de glucosa, mientras que en los animales diabéticos experimentales esta segunda fase fue de lenta normalización, alcanzando así sus niveles basales (precarga de glucosa) tres horas después. Estos resultados se correlacionan con una disminución en la sensibilidad a la insulina general observada en las ratas diabéticas, que fue determinada matemáticamente a través de la ecuación propuesta por Matsuda y colaboradores,³⁵ que permite establecer un índice de sensibilidad periférica a la insulina, y que demostró estar altamente correlacionado con el pinzamiento euglicémico-hiperinsulinémico, empleado con éxito tanto en humanos^36,37 como en animales.^38,39 Ahora bien, en las ratas diabéticas el tratamiento crónico con valsartán produjo una disminución significativa del área bajo la curva de la PTOG, la cual resultó ser un 15% menor a la obtenida para las ratas diabéticas no tratada, sugiriendo un efecto protector del valsartán.
El efecto protector del valsartán, así como de otros antagonistas AT_1, han sido ampliamente estudiados. Numerosos estudios epidemiológicos han puesto en evidencia la disminución de la incidencia de diabetes tipo 2 en pacientes hipertensos tratados con IECA y antagonistas del receptor AT₁.^28,29,40,41 Varios mecanismos subyacen al efecto de la angiotensina II sobre la resistencia periférica a la insulina: primero, disminuye el flujo sanguíneo hacia el músculo esquelético;⁴² segundo, interfiere con la señalización de la insulina en el músculo esquelético y músculo liso vascular, disminuyendo la captación de glucosa por parte de estos,^26,43 y tercero, incrementa el número de adipocitos hipertróficos resistentes a la insulina;⁴⁴ de modo tal que el bloqueo del receptor AT₁ incrementa el flujo sanguíneo y la utilización de glucosa por parte del músculo, favorece la señalización de la insulina y permite la diferenciación de los adipocitos sensibles a la insulina. Adicionalmente, Van der Zijl y colaboradores⁴⁵ demostraron que el tratamiento crónico con valsartán incrementa la secreción de insulina estimulada por glucosa y la sensibilidad a la insulina en pacientes con intolerancia a la glucosa, encontrando que la hiperglucemia produce un incremento en la actividad del SRA pancreático, induciendo la producción de especies reactivas de oxígeno, inflamación y apoptosis, con la consecuente reducción de la secreción de insulina.
Nuestros resultados ponen en evidencia el estado proinflamatorio que acompaña las alteraciones metabólicas presentes en el modelo experimental de diabetes, tal como ocurre en los pacientes diabéticos,^46-49 y demuestra además el efecto antiinflamatorio, y por ende protector, ejercido por el valsartán. Efectivamente, aunado a los cambios metabólicos encontrados, el incremento en los niveles plasmáticos de IL-6, TNF-a, IL-1ß, MCP-1 hizo evidente el estado proinflamatorio que acompaña a estos trastornos. Estos hallazgos coinciden con los informados tanto en seres humanos como en animales, donde se ha demostrado una fuerte asociación entre la resistencia a la insulina y el incremento de adipoquinas y citoquinas proinflamatorias como la IL-6, TNF-a, IL-1 ß, MCP-1, MIP-1a, IFN?, resistina, entre otras.^5,6,46-49 Se ha demostrado que el incremento en los niveles de IL-6 y TNF-a induce resistencia a la insulina, por un mecanismo dependiente de la activación de la kinasa c-Jun N-terminal (JNK), conocida como serina/treonina kinasa sensible al estrés, capaz de inactivar las proteínas de señalización de la insulina.⁵⁰ Estos efectos son potenciados por la IL-1ß, cuya activación además de inhibir la fosforilación de las proteínas de señalización de la insulina, disminuye la expresión del transportador GLUT-4 y del receptor-? activado por el proliferador de peroxisomas (PPAR-?).⁵¹ Adicionalmente, la activación de la IL-1ß ha sido asociada con la pérdida de masa pancreática en diabetes tipo 2, debido a su capacidad de activar la caspasa-1 e iniciar el proceso de apoptosis.^52,53 La MIP-1a es una quimioquina, secretada por macrófagos activados, y actúa como agente propagador y multiplicador de la respuesta inmunitaria,⁵⁰ y su actividad ha sido asociada con la potenciación de la liberación de IL-6 y TNF-a.⁴⁶
El tratamiento crónico con valsartán produjo un efecto protector en las ratas diabéticas, ya que previno el incremento de la IL-6 e IL-1ß. La activación del receptor AT₁ se asocia con un incremento en la síntesis de citoquinas proinflamatorias, activación del factor nuclear potenciador de las cadenas ligeras kappa de las células B activadas (NF?B), disminución de la síntesis de óxido nítrico e incremento del estrés oxidativo,⁵⁵ razón por la cual el bloqueo de este receptor estaría mediando el efecto antiinflamatorio.
El equilibrio energético del organismo depende de la acción conjunta de señales periféricas y centrales que transmiten información sobre el estado nutricional. Los trastornos metabólicos que aparecen con la diabetes alteran estas señales.^13,54 En condiciones fisiológicas, la insulina, además de sus conocidos efectos periféricos, actúa como señal de saciedad una vez que llega al cerebro, disminuyendo el apetito,^11,19,20 e induce inhibición de la descarga del nervio vago hacia el hígado, reduciendo paulatinamente la liberación de glucosa desde el hígado hacia el torrente sanguíneo.^12,13,56 Adicionalmente, se ha demostrado que la insulina central participa en la modulación a largo plazo del equilibrio energético, ya que una disrupción específica del gen del receptor de insulina neuronal induce un incremento de la grasa corporal y de los niveles plasmáticos de insulina y leptina.²⁴ La evidencia permite inferir que en la DBT2 no sólo existe resistencia a las acciones de la insulina en la periferia, sino también a las que ésta ejerce centralmente, específicamente a nivel hipotalámico. Sin embargo, muy pocos son los estudios que han sido dirigidos con el fin de dilucidar las alteraciones que tienen lugar en la señalización de la insulina a nivel central bajo la condición diabética.
A nivel periférico, son diversos los mediadores químicos que participan en la resistencia a la insulina, entre ellos, la angiotensina II. Este péptido, a través del receptor AT₁, incrementa la producción de especies reactivas de oxígeno a nivel intracelular, las cuales inhiben, de forma directa e indirecta, la señalización de la insulina.^26,57 Por otro lado, la síntesis de este péptido es sensible a los niveles de glucemia, así como la glucemia es sensible a los cambios en la concentración plasmática de la angiotensina II.⁵⁸ De forma tal que el sistema renina-angiotensina está íntimamente imbricado con el control de la glucemia, y esa interrelación podría también producirse a nivel del sistema nervioso central.
En efecto, la evidencia neuroanatómica de la colocalización del receptor de insulina y del receptor AT₁ de la angiotensina, en las neuronas del núcleo arcuato del hipotálamo, sugieren la posibilidad de una interacción funcional entre estos dos péptidos en el SNC. La existencia de defectos en la señalización de la insulina a nivel hipotalámico traería como consecuencia alteraciones en los mecanismos de retroalimentación ejercidos por el SNC sobre el control energético. Nuestros resultados apuntan a esa posibilidad ya que demuestran, por primera vez, la participación de la angiotensina II central en el control de la glucemia, tanto en condiciones fisiológicas como diabéticas. Así, la administración intracerebroventricular de ANG II produjo hiperglucemia en los animales controles. Este resultado podría deberse al incremento del flujo simpático inducido por la angiotensina II a nivel central. El incremento en el flujo simpático central incrementa, a su vez, la liberación de epinefrina y norepinefrina desde la médula de la glándula suprarrenal. La epinefrina liberada disminuiría la secreción de insulina desde el páncreas e induciría un incremento de la glucogenólisis y la gluconeogénesis, acciones que de forma sinérgica permitirían el aumento de la concentración de glucosa en la sangre.^59,60 Este efecto hiperglucemiante estuvo significativamente disminuido en las ratas tratadas crónicamente con valsartán. Se sabe que los antagonistas AT₁ disminuyen la liberación de epinefrina y glucocorticoides en ratas espontáneamente hipertensas y en modelos de estrés crónico⁶¹, de manera similar, el tratamiento crónico con valsartán inhibiría la liberación de epinefrina inducida por la activación simpática inducida por la ANG II-ICV, y prevendría el incremento de la glucemia.
En los animales diabéticos, se observó que el efecto hiperglucemiante inducido por la ANG II central fue potenciado. Este efecto podría estar relacionado con una disfunción del sistema nervioso parasimpático, el cual frecuentemente se asocia con DBT2.⁶² Por ende, con un mecanismo contrarregulatorio parcialmente inhibido, la estimulación simpática inducida por la ANG II central, responsable de la hiperglucemia, se potenciaría. El tratamiento crónico con valsartán bloqueó significativamente el incremento de la glucemia inducido por la ANG II en ratas diabéticas, lo que sugiere que el valsartán previene el incremento de la actividad simpática inducida por la ANG II central, aun en la diabetes.
Al evaluar el papel de la insulina central sobre la regulación de la glucemia encontramos que la administración ICV de insulina produjo una lenta pero importante reducción de los niveles de glucemia en los animales controles. Estos hallazgos están en concordancia con la evidencia de que la insulina central induce hiperpolarización de las neuronas del núcleo arcuato, responsable del efecto inhibitorio sobre la descarga simpática hacia la periferia y potencia la descarga vagal al hígado, con la consecuente reducción de la glucogenólisis.^12,13 La acción de la insulina estuvo significativamente atenuada en los animales diabéticos, lo que sugiriere que las alteraciones en la señalización de la insulina en el hipotálamo de ratas diabéticas podrían atenuar el efecto inhibitorio de las neuronas hipotalámicas que proyectan al núcleo del tracto solitario, permitiendo la descarga simpática y disminuyendo la descarga parasimpática hacia el hígado, lo que incapacitaría la completa supresión de la liberación de glucosa hepática, aun en presencia de hiperglucemia. Estos hallazgos demuestran, por primera vez, la existencia de resistencia neuronal hipotalámica a la insulina en un modelo de DBT2. Finalmente, el tratamiento con valsartán recuperó parcialmente el efecto hipoglucemiante inducido por la insulina en las ratas diabéticas, lo que indica que, tal y como ocurre en los tejidos periféricos,^29,63,64 el tratamiento crónico con antagonistas AT₁ incrementa la sensibilidad a la insulina central.
El efecto inhibitorio ejercido por la estimulación conjunta de ANG II e insulina sobre las proteínas de señalización de la insulina observados in vitro, se refleja en la actividad biológica de ambos péptidos. La ANG II a nivel hipotalámico puede inducir cambios en la regulación central de la glucemia mediada por la insulina. Nuestros hallazgos apoyan la existencia de un antagonismo fisiológico entre ambos péptidos a nivel del SNC, ya que la administración ICV de ANG II inhibió el efecto hipoglucemiante inducido por la insulina central, y a su vez la insulina redujo significativamente la actividad hiperglucemiante de la ANG II, efecto que aún persiste en las ratas diabéticas. El tratamiento crónico con el antagonista AT₁ bloqueó significativamente el efecto inhibitorio de la ANG II sobre la insulina, probablemente por prevenir la sobreactivación simpática inducida por la ANG II responsable del aumento de la liberación de catecolaminas.
En conclusión, la evidencia sugiere que la diabetes tipo 2 no sólo es un trastorno metabólico con consecuencias en el sistema nervioso, sino también un trastorno del sistema nervioso con consecuencias metabólicas e inflamatorias. El uso de agentes que inhiben las acciones de la angiotensina II, como el valsartán, parecen ejercer un importante efecto protector en el mantenimiento de la comunicación entre los circuitos hipotalámicos relacionados con el mantenimiento del equilibrio energético y la periferia.

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