Molecular analysis by multiplex nested PCR of herpes virus family in idiopathic peripheral facial paralysis

Abstract
Introduction: In the National Institute of Rehabilitation, idiopathic peripheral facial palsy occupies one of the top ten places in health care. Its etiology is still unknown; however, the herpes virus family has been determined as possible causative agents. Objective: Detecting DNA of HSV-1 and 2, CMV and VZV in patients with idiopathic peripheral facial palsy, and correlate its presence with clinical presentation of the disease. Methods: DNA was extracted from leukocyte fraction of 62 samples from patients with idiopathic peripheral facial palsy. DNA amplification was performed by multiplex nested PCR with specific primers for each virus. Determination of IgG and IgM was performed by ELISA. Results: PCR results showed that twenty two (35.5%) patients had a positive PCR for HSV-1, 1 (1.6%) for HSV-2, 1 (1.6%) for VZV, 3 (4.8%) for CMV. The seroprevalence showed that 55 (88.7%) cases had high levels of IgG against HSV-1 and 2, 2 (3.22%) for VZV IgG, and 5 (8.1%) for CMV IgM. Both positive and negative cases for HSV-1 did not establish significant differences in age, gender, laterality, symptoms, degree of facial paralysis and the season in which palsy was presented. Conclusion: HSV-1 was the most frequently found virus in our patients, which suggests a trend towards a possible association between the presence of HSV-1 and development of idiopathic peripheral facial palsy.

Key words
hsv-1, hsv-2, cmv, vzv, idiopathic peripheral facial palsy

Artículo completo
Introducción
La parálisis facial periférica idiopática (PFPI), es una enfermedad benigna de la porción infratemporal del nervio facial con aparición repentina de la disfunción unilateral del séptimo nervio craneal que resulta en la pérdida de la función contráctil de los músculos encargados de la expresión facial, lo que produce la desviación de la comisura labial hacia el lado no afectado, se caracteriza por presentar el fenómeno de Bell (signo de parálisis facial periférica que se manifiesta por el movimiento ocular hacia arriba y afuera del globo acular, cuando el enfermo intenta cerrar el párpado), ptosis (caída) y aumento de la hendidura palpebral; estos hallazgos son más evidentes al realizar gesticulaciones; además también se acompaña de signos y síntomas en la secreción lagrimal, salival y del sentido del gusto, alteraciones que son derivadas del trayecto lesionado del nervio.¹
La PFPI es un padecimiento relativamente frecuente, su incidencia anual a nivel global es de aproximadamente 20 a 30 personas por cada 100 000, la edad pico oscila entre los 15 y los 45 años, y es más frecuente en pacientes diabéticos e hipertensos que en la población normal.¹ Los hombres y las mujeres son afectados por igual, aunque la incidencia es mayor en las embarazadas (45 cada 100 000).^1,3-5 Este padecimiento se presenta en cualquiera de los lados de la cara y sólo el 1% en ambos lados simultáneamente. Una persona puede presentar PFPI en cualquier momento de su vida, sin embargo se ha documentado que las tasas de incidencia aumentan con la edad.⁵ En la mayoría de los casos, es una enfermedad benigna y la pérdida funcional es temporal y de buen pronóstico; las estadísticas muestran que alrededor del 50% de los pacientes presentan una recuperación satisfactoria; por el contrario, el pronóstico de recuperación es reservado en los individuos que sufren parálisis completa, con una tasa de recuperación más escasa.
Algunos estudios han demostrado que el pronóstico para una recuperación satisfactoria depende de un tratamiento adecuado en las primeras 72 horas de iniciada la enfermedad, y al parecer es independiente de la edad del paciente,^7,8 sin embargo, es difícil establecer un beneficio estadísticamente significativo debido a la alta tasa de recuperación espontánea en muchos pacientes que no han recibido tratamiento, lo que sugiere que existen otros factores, además del tratamiento, que pueden afectar el pronóstico de la parálisis facial.^4,9 De hecho, recientemente se ha determinado que en pacientes con lesiones en el sistema nervioso periférico tipo neuropraxia, no es necesaria la rehabilitación, y en los casos con axonotmesis la retroalimentación frente al espejo por sí sola es suficiente para tener una recuperación completa.¹⁰ En un trabajo reciente, estudiamos las características sociodemográficas, estacionales, de lateralidad, sintomáticas y terapéuticas de la parálisis de Bell en pacientes mexicanos con el fin de determinar los factores que influyen en el pronóstico de la enfermedad y que son importantes para alcanzar una recuperación satisfactoria. En ese trabajo encontramos que la edad (pacientes con más de 40 años) y la falta de terapia física fueron los únicos factores pronósticos que influyeron significativamente para una recuperación incompleta.¹¹
Se han planteado diversas teorías que tratan de explicar su etiopatogenia, sin embargo, existe información creciente acerca de que la principal causa de la PFPI es la presencia de virus de la familia herpes, como el herpes simple tipo 1 y tipo 2 (HSV-1 y HSV-2), varicela zóster (VZV), citomegalovirus (CMV), y Epstein-Barr (EBV).^13-17 El HSV-1, el HSV-2 y el VZV son virus neurotrópicos, es decir que su ADN permanece de por vida en los ganglios sensoriales periféricos del hospedero, lo cual favorece la permanencia de infecciones latentes en el sistema nervioso periférico.¹⁸ La explicación fisiopatológica más aceptada sostiene que una variedad de estímulos como la luz ultravioleta, la fiebre, el estrés, la inmunosupresión y otras infecciones pueden inducir la reactivación viral; sin embargo, el mecanismo que rige la transición de la latencia a la reactivación no está claro.¹⁹ Se piensa que las células T tienen un papel crucial en la interacción entre el sistema inmunitario y la infección latente por HSV-1.²⁰ Se han observado concentraciones elevadas de interleuquina 6 (IL-6), IL-8 y factor de necrosis tumoral alfa (TNF-a) en pacientes con parálisis facial, sin embargo, estos niveles no se han podido correlacionar con un pronóstico de recuperación.²¹
Después de la reactivación, el virus herpes inicia un ciclo vicioso de edema, inflamación e isquemia compresiva que involucra al VII nervio dentro de su canal óseo, produciéndose primero una neuropraxia reversible, seguida de una disrupción entre el soma y el axón que puede resultar en una degeneración walleriana.^22,23
El ADN de HSV-1, VZV, CMV y EBV se ha identificado por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en el líquido endoneural del nervio facial, en el músculo inervado por el nervio facial durante la fase aguda de la parálisis y en los ganglios trigémino y geniculado.^16,24-26 Ésta técnica es una herramienta de identificación específica, rápida, sensible y útil para la detección de cantidades pequeñas de ADN de agentes virales, también existen otros tipos de PCR que permiten la identificación simultánea de dichos agentes de una manera más eficiente y más barata, como la PCR múltiple anidada, sin embargo, la desventaja de esta metodología es que no distingue entre el genoma viral en estado latente y el que está en estado de reactivación.²⁷

Material y métodos
Pacientes
Este es un estudio transversal con recolección de datos prolectiva en donde se incluyeron 62 pacientes con PFPI. Cada caso se caracterizó por la época del año en que inició la parálisis facial, la cual se clasificó como “fría” (noviembre a febrero), “cálida” (marzo a mayo) y “lluviosa” (junio a octubre). Los pacientes fueron examinados por un otorrinolaringólogo. El grado de parálisis fue evaluado de acuerdo con la escala funcional de House-Brackmann, en la cual se mide la asimetría facial en estado de reposo, movimiento y hemiespasmos.²⁸ Se obtuvo el consentimiento informado de todos los pacientes y los sujetos de control. Éste protocolo fue revisado y aprobado por el comité científico y por el comité de ética del Instituto Nacional de Rehabilitación.

Muestras de sangre
Se tomaron 5 ml de sangre de pacientes y de sujetos sanos. El ADN se aisló de la fracción leucocitaria empleando un equipo comercial (Qiagen, Valencia, EE.UU.) de acuerdo con las especificaciones del fabricante. Se separó el suero y se guardó a -20°C hasta su uso para la determinación de los niveles de anticuerpos IgG e IgM antivirus.

ADNA viral
Se utilizó como control positivo el ADN de las cepas ATCC: HSV-1 cepa KOS, HSV-2 cepa G, VZV cepa OKA y CMV cepa AD169.

Estudios serológicos
La determinación de los niveles de IgG contra VZV, HSV-1 y 2 e IgM contra CMV en suero se realizó utilizando un kit de ELISA de acuerdo con las especificaciones del fabricante (DRG International, Mountainside, EE.UU.). La lectura de las placas se realizó en un espectrofotómetro Biotek ELx800.

Condiciones de amplificación de PCR
Los oligonucleótidos utilizados en la amplificación de primera y segunda ronda y sus genes diana, así como las condiciones de amplificación se describen en la literatura.²⁷ En breve, para la primera ronda de PCR, se agregaron 2 µl de ADN a 50 µl de la mezcla de reacción que contiene oligonucleótidos de la primera ronda (500 nM) (Invitrogen), 2 mM MgCl₂ (Applied Biosystems, Foster City, EE.UU.), 2 mM dNTP’s (Applied Biosystems, Foster City, EE.UU.), y 0.2 U de Taq polimerasa (Applied Biosystems, Foster City, EE.UU.). Las condiciones de amplificación fueron las siguientes: 94°C durante 3 min, seguido por 35 ciclos de 94°C por 20 s, 60°C por 20 s, y 72°C por 30 s, con una extensión final de 72°C durante 3 min. Para la segunda ronda de PCR, se añadieron 2µl del producto de amplificación de la primera ronda de PCR, a 40µl de la mezcla de reacción anteriormente mencionada, pero conteniendo los oligonucleótidos de la segunda ronda (Invitrogen). Las condiciones de amplificación fueron las mismas que para la primera ronda de PCR, pero sólo se realizaron 25 ciclos. Los productos de amplificación se visualizaron en un gel de agarosa al 2% en TAE 1X (tris-acetato de sodio 40 mm, pH 7.6, y 1 mM EDTA) el cual se corrió a 100 V durante 15 min. Los marcadores de peso molecular (Axygen) fueron incluidos en cada gel. Los geles se tiñeron con bromuro de etidio (Sigma Chemicals, Steinhem, Alemania) y fueron analizados en un fotodocumentador Gel Doc 2000 (Bio-Rad, Hercules, EE.UU.). En cada serie fueron incluidos controles positivos y negativos.

Análisis de datos
El análisis estadístico se realizó mediante SPSS versión 17.0 para Windows XP. Se emplearon las pruebas de chi al cuadrado y de la t de Student para calcular la significación de la asociación entre las variables.

Resultados
De 62 muestras de sangre examinadas, 38 (61%) correspondían a mujeres y 24 (39%) a hombres; 29 (46.7%) presentaron parálisis del lado derecho y 33 (53.2%) del lado izquierdo de la cara. En cuanto a los resultados de la PCR múltiple anidada, 22 casos (35.5%) fueron positivos para HSV-1, uno (1.6%) para HSV-2, uno (1.6%) para VZV, y tres (4.8%) para CMV. La edad varió entre 2 y 78 años, con una edad promedio de 43.2 (DE 17 años) (Tabla 1). No se encontró asociación entre la edad y la presencia del virus del herpes (p = 0.24). De todos los casos, 37 (60%) presentaron el antecedente de parálisis facial familiar. La tasa de incidencia de casos positivos para el virus herpes durante los meses fríos (38.7%) fue mayor que en la época de lluvias (33.9%) y en la época más cálida (27.4%). No se encontró asociación significativa entre la estación y la presencia del virus herpes (p = 0.46).






En cuanto a los síntomas concomitantes, el 63% de los pacientes presentó disgeusia, el 55% algiacusia, el 66% del dolor posauricular, y el 66% hiperlagrimeo. No se encontró asociación significativa entre los síntomas y la presencia de los virus herpes (p = 0.18, p = 0.38, p = 0.12 y p = 0.55, respectivamente). En cuanto al lado afectado, el 53% (n = 33) de los pacientes presentaron parálisis facial izquierda (primaria y recurrente) y el 47% (n = 59) tenía parálisis facial derecha (primaria y recurrente), y no hubo asociación entre el lado de la parálisis y la presencia de virus (p = 0.45). De los 62 pacientes, el 6.5% (n = 4) presentó grado V según la escala de HB; el 38.7% (n = 24) grado IV; el 22.6% (n = 14) presentó grado III, el 17.7% (n = 11) tenía grado II, y el 14.5%, (n = 9) grado I. No se encontró asociación entre el grado de parálisis facial y la presencia de los virus (p= 0.63) (Tabla 1). La seroprevalencia de HSV-1 y HSV-2, VZV y CMV en nuestra población se muestra en la Tabla 2.






Discusión
La PFPI es un problema de salud pública relativamente frecuente y de impacto psicosocial importante, y debido al desconocimiento de su causa, existe cierta incapacidad para su prevención. Su etiología es aún controversial, sin embargo, estudios recientes muestran que los virus de la familia herpes tienen un papel importante en su etiopatogenia. Estos virus tienen la habilidad de establecer infecciones latentes en sus hospederos y causar enfermedad de manera recurrente por reactivación desde los ganglios geniculados, donde residen de por vida. Estudios previos han documentado por PCR la presencia del HSV-1 en el 18% al 50% de los casos de PFPI en adultos.^13,29 Los resultados moleculares de nuestro estudio muestran una tendencia hacia una posible relación entre la infección por los virus herpes y la PFPI, ya que el virus más frecuente identificado en nuestros pacientes fue el HSV-1, presente en el 35.5% de los casos.
Estudios serológicos indican que los pacientes que presentan un resultado positivo para HSV-1 por PCR, muestran de manera simultánea niveles altos de IgG contra HSV-1, dato que concuerda con una reactivación viral.³⁰ En nuestros casos, no todos los pacientes presentaron un resultado concordante entre lo encontrado por PCR y la serología, sólo 22 casos presentaron reactivación viral, por lo que es posible que el agente viral no sea el único factor determinante para la presentación clínica de la parálisis, como se ha propuesto. Durante el evento de parálisis, el nervio puede todavía estar dañado por el edema, la inflamación, la presión dentro del canal óseo y por la isquemia debida a congestión vascular, o incluso por una infección viral activa.²⁹ Más aun, la reactivación viral puede inducir una respuesta inmunitaria en el nervio facial que provoca una parálisis facial tardía.³¹
Por otro lado, el síndrome de Ramsay-Hunt, que es causado por la reactivación del VZV, se caracteriza por la presencia de lesiones vesiculares alrededor de la oreja, parálisis facial periférica y síntomas que involucran el octavo nervio craneal. Este síndrome es muy grave y es difícil que los pacientes que lo presentan alcancen una recuperación completa.^32,33 Se ha informado que el VZV es uno de los agentes etiológicos más importantes en la PFPI,³⁴ sin embargo, en nuestra serie de casos sólo dos pacientes presentaron anticuerpos IgG contra VZV, aunque sólo en uno se corroboró la presencia del ADN viral por PCR múltiple, por lo que estaríamos hablando de dos casos de reactivación viral atribuida a VZV y no a una primoinfección por dicho virus.
Es importante resaltar también que, en nuestro estudio, el mayor número de casos positivos se registraron durante la temporada de frío, seguida por la temporada de lluvias. Al respecto, sabemos que la incidencia de la parálisis facial varía ampliamente en diferentes partes del mundo, lo que podría reflejar los cambios en el inicio de la enfermedad a lo largo de los años y en diversas áreas geográficas. Por lo anterior, se ha sugerido que los cambios en la temperatura, la radiación ultravioleta y la exposición al aire frío, seco o húmedo durante el invierno y el verano, así como las coinfecciones de las vías respiratorias superiores pueden ejercer un efecto traumático en las membranas de la mucosa nasofaríngea, lo que podría inducir la reactivación de infecciones debidas a herpes.³⁵

Conclusión
Los hallazgos de nuestro estudio por PCR múltiple anidada muestran que el ADN de los virus herpes se puede detectar en la sangre de un número significativo de pacientes con PFPI, y aunque nuestros datos actuales no son suficientes como para indicar o reafirmar el papel de estos virus en la etiopatogenia de la PFPI, y que los casos positivos y negativos de HSV-1 no establecieron diferencias significativas con la edad, sexo, lateralidad, síntomas, grado de parálisis facial y la temporada en la que se presentó la parálisis, aun así podemos sugerir una tendencia hacia una posible asociación entre la presencia de HSV-1, su reactivación y el desarrollo de PFPI.

Bibliografía del artículo
1. Holland NJ, Weiner GM. Recent developments in Bell's palsy. Br Med J 329:553-557, 2004.
2. Gillman GS, Schaitkin BM, May M, Klein SR. Bell's palsy in pregnancy: a study of recovery outcomes. Otolaryngol Head Neck Surg 126:26-30, 2002.
3. Morales DR, Donnan PT, Daly F, Van Staa T, Sullivan FM. Impact of clinical trial findings on Bell's palsy management in general practice in the UK 2001-2012: interrupted time series regression analysis. BMJ Open 16(3):7, 2013. doi:10.1136/bmjopen-2013-003121.
4. Peitersen E. Bell's palsy: The spontaneous course of 2500 peripheral facial nerve palsies of different etiologies. Acta Otolaryngol Suppl 549:4-30, 2002.
5. Jackson CG, Von Doersten PG. The facial nerve: Current trends in diagnosis, treatment and rehabilitation. Med Clin North Am 83:179-95, 1999.
6. Morgan M, Nathwant D. Facial palsy and infection: The unfolding story. Clin Infect Dis 14:263-271, 1992.
7. Hato N, Matsumoto S, Kisaki H, Wakisaka H, Honda N, Gyo K, Murakami S, Yanagihara N. Efficacy of early treatment of Bell's palsy with oral acyclovir and prednisolone. Otol Neurotol 24:948-951, 2003.
8. Lee HY, Byun JY, Park MS, Yeo SG. Effect of aging on the prognosis of Bell's palsy. Otol Neurotol 34:766-70, 2013.
9. Tiemstra JF, Khatkhate N. Bell's palsy: Diagnosis and management. Am Fam Phys 76:997-1002, 2007.
10.-Dalla Toffola E, Tinelli C, Lozza A, Bejor M, Pavese C, Degli Agosti I y cols. Choosing the best rehabilitation treatment for Bell's palsy. Eur J Phys Rehabil Med 48:635-42, 2012.
11. Sánchez Chapul L, Reyes Cadena S, Andrade Cabrera JL, Carrillo Soto A, León Hernández SR, Paniagua Pérez R, y col. Bells palsy: a prospective, longitudinal, descriptive and observational analysis of prognosis factors for recovery in mexican patients. Rev Invest Clin 63:361-369, 2011.
13. Furuta Y, Fukuda S, Chida E, Takasu T, Ohtani F, Inuyama Y, y cols. Reactivation of herpes simplex virus type 1 in patients with Bell's palsy. J Med Virol 54:162-166, 1998.
14. Linder T, Bossart W, Bodmer D. Bell's palsy and Herpes simplex virus: Fact or mystery? Otology and Neurology 26:109-113, 2005.
15. Morrow MJ. Bell's palsy and Herpes Zoster oticus. Curr Treat Options Neurol 2:407-416, 2000.
16. Murakami S, Mizobuchi M, Nakashiro Y, Doi T, Hato N, Yanagihara N. Bell palsy and herpes simplex virus: identification of viral DNA in endoneural fluid and muscle. Ann Intern Med 124:27-30, 1996.
17. Diaz GA, Rakita RM, Koelle DM. A case of Ramsay Hunt-like syndrome caused by Herpes simplex virus type 2. Clin Infect Dis 40:1545-1547, 2005.
18. Steiner I. Human herpes viruses latent infection in the nervous system. Immunol Rev 152:157-73, 1996.
19. Axelsson S, Lindberg S, Stjernquist-Desatnik A. Outcome of treatment with valacyclovir and prednisone in patients with Bell's palsy. Ann Otol Rhinol Laryngol 112:197-201, 2003.
20. Simmons A, Tscharke D, Speck P. The role of immune mechanisms in control of herpes simplex virus infection of the peripheral nervous system. Curr Top Microbiol Immunol 179:31-565, 1992.
21. Yilmaz M, Tarakcioglu M, Bayazit N, Bayazit YA, Namiduru M, Kanlikama M. Serum cytokine levels in Bell's palsy. J. Neurol Sci 197:69-72, 2002.
22. Holland NJ, Weiner GM. Recent developments in Bell's palsy. Br Med J 329:553-557, 2004.
23. De Ru JA, Van Benthem PP, Hordijk GJ. Arguments favouring the pharmacotherapy of Bells' palsy. Ned Tijdschr Geneeskd 149:1454, 2005.
24. Furuta Y, Takasu T, Sato KC, Fukuda S, Inuyama Y, Nagashima K. Latent herpes simplex virus type 1 in human geniculate ganglia. Acta Neuropathol 84:39-44, 1991.
25. Takasu T, Furuta Y, Sato KC, Fukuda S, Inuyama Y, Nagashima K. Detection of latent herpes simplex virus DNA and RNA in human geniculate ganglia by the polymerase chain reaction. Acta Otolaryngol 112:1004-11, 1992.
26. Burgess RC, Michaels L, Bale JF Jr, Smith RJ. Polymerase chain reaction amplification of herpes simplex viral DNA from the geniculate ganglion of a patient with Bell's palsy. Ann Otol Rhinol Laryngol 103:775-9, 1994.
27. Druce J, Catton M, Chibo D, Minerds K, Tyssen D, Kostecki R, et al. Utility of a multiplex PCR assay for detecting herpesvirus DNA in clinical samples. J Clin Microbiol 40:1728-1732, 2002.
28. House JW, Brackmann DE. Facial nerve grading system. Otolaryngol Head Neck Surg 93:146-147, 1985.
29. Abiko Y, Ikeda M, Hondo R. Secretion and dynamics of herpes simplex virus in tears and saliva of patients with Bell's palsy. Otol Neurotol 23:779-783, 2002.
30. Furuta Y, Ohtani F, Chida E, Mesuda Y, Fukuda S, Inuyama Y. Herpes simplex virus type 1 reactivation and antiviral therapy in patients with acute peripheral facial palsy. Aurix Nasus Larynx 28(Suppl):S13-S17, 2001.
31. Murakami S, Hato N, Mizobuchi M, Doi T, Tanagihara N. Role of herpes simplex virus infection in the pathogenesis of facial paralysis in mice. Ann Otol Rhinol Laryngo l05:49-53, 1996.
32. Mori T, Nagai K, Asanuma H. Reactivation of varicella- zoster virus in facial palsy associated with infectious mononucleosis. Pediatr Infect Dis 21:709-710, 2002.
33. Furuta Y, Ohtani F, Mesuda Y, Fukuda S, Inuyama Y. Early diagnosis of zoster sine herpete and antiviral therapy for the treatment of facial palsy. Neurology 55:708-710, 2000.
34. Furuta Y, Ohtani F, Kawabata H, Fukuda S, Bergström T. High prevalence of varicella-zoster virus reactivation in herpes simplex virus-seronegative patients with acute peripheral facial palsy. Clin Infect Dis 30:529-533, 2000.
35. Campbell KE, Brundage JF. Effects of climate, latitude, and season on the incidence of Bell´s palsy in the US armed forces, October 1997 to September 1999. Am J Epidemiol 156:32-39, 2002.