Detection of human papilloma virus in ocular surface squamous neoplasia by histopathology and molecular methods

Abstract
Detection of human papillomavirus (HPV) type 16 and 18 and koilocytosis in ocular surface squamous neoplasia. Methods: Archival paraffin-embedded tissue from 35 ocular surface squamous neoplasias was analysed for the presence of HPV by polymerase chain reaction (PCR), and DNA sequencing. Histological sections of the 34 neoplasias were evaluated for the presence of koilocytosis. Results: No histopathological changes characteristic of HPV infection (Koilocytosis) were observed. HPV-DNA was present in 13 of 26 (50%) beta globin positive neoplasias. HPV type 18 was not found, while HPV type 16 was found in 13 of 26 investigated neoplasias. In addition, the HPV59 genotype was identified in two samples by DNA sequencing, and the HPV35 genotype was identified in one. A double infection with HPV16 and 35 was identified in a single neoplasia, and in two others with HPV16 and 59. Conclusion: There is a strong association between HPV and ocular surface squamous neoplasia, with HPV16 being the most common. Double infection by HPV35 and 59 was also identified. The sensitivity of koilocytosis as an indicator of HPV is low compared with PCR.

Key words
ocular surface squamous neoplasia, human papillomavirus, polymerase chain reaction, koilocytosis

Artículo completo
Introducción

El carcinoma de células escamosas invasor de la conjuntiva ocupa el segundo lugar en frecuencia entre los tumores oculares malignos,¹ se diferencia del carcinoma in situ porque rompe la lámina basal del epitelio, lo que ocasiona que la proliferación neoplásica invada el corion subyacente, pudiendo incluso penetrar en el globo ocular y extenderse a la cavidad orbitaria.² La edad de presentación más frecuente es en la sexta década de la vida,^3,4 pero también se ha observado en pacientes jóvenes con antecedentes de xeroderma pigmentario e inmunosupresión (infección por VIH),⁵ se presenta como una tumoración conjuntival nodular o en placa que puede estar o no pigmentada, de aspecto gelatinoso, con vasos superficiales papiliformes (apariencia papilar) localizada en la región interpalpebral.^1,3,4 Existen varias opciones terapéuticas que incluyen resección quirúrgica, crioterapia y radiación,⁶ y otras formas de tratamiento como la quimioterapia tópica, interferón, drogas antivirales y la terapia fotodinámica.^1,4,7-9
La recurrencia es variable, Murat y colaboradores señalan un 4.5% para el carcinoma in situ y un 5.3% carcinomas para invasores.¹⁰ La recurrencia general se estima en 4%.¹¹ Se ha descrito la exposición a los rayos ultravioleta como el factor de riesgo más importante de esta neoplasia.^3,12-14 Newton y colegas encontraron que la incidencia del carcinoma de células escamosas de la conjuntiva disminuía aproximadamente un 49% por cada 10° de incremento en la latitud.¹⁵ También se relaciona con la infección por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), pues es una neoplasia frecuente en estos enfermos^13,16 y con la infección por el virus del papiloma humano (VPH), principalmente los serotipos 16 y 18.
En 1956, Koss introdujo el término coilocitosis para describir una célula escamosa de tipo intermedio, con un halo claro alrededor del núcleo, núcleos irregulares, identados, vesiculosos y binucleados, actualmente se sabe que estos cambios son el resultado de la infección por el VPH; las células coilocíticas son el hallazgo histológico más importante y característico de la infección por este virus.¹⁷
El virus del papiloma humano pertenece a uno de los grupos virales más frecuentes en el mundo (Papillomaviridae) que afectan la piel y las mucosas del cuerpo; está asociado a lesiones premalignas y malignas de estos tejidos. Según su poder oncogénico los serotipos del VPH se clasifican como de alto y bajo riesgo.¹⁷ Los tipos de alto riesgo más conocido son: 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 73 y 82. En un 95% los serotipos 16 y 18 son reconocidos como agentes etiológicos del cáncer cérvico-uterino y están asociados a lesiones premalignas y malignas del tracto anogenital, boca, laringe, faringe, colon y ojos. Los VPH de bajo riesgo se encuentran asociados con lesiones benignas, como los papilomas de la conjuntiva, y los serotipos más frecuentes son el 6 y el 11.^17-20 Algunos autores han detectado la presencia de VPH en lesiones premalignas de la conjuntiva, no así en lesiones malignas;^12,21 otros investigadores han logrado detectar la presencia del VPH, serotipos 16, 18 y 33, en lesiones malignas, con una frecuencia que varía entre el 50% y 100%, y en conjuntivas normales en un 32%.²¹ Desde 1980 se ha observado un aumento en el número de casos de neoplasia escamosa de la superficie ocular (NESO) principalmente en África y en los Estados Unidos, y se han atribuido a la infección por VIH, el riesgo para esta neoplasia en individuos VIH positivos aumenta 10 veces.^22,23 Inicialmente, se propuso que el VPH que infecta mucosas estaba asociado a NESO; sin embargo, informes recientes de casos y controles en África muestran que son los serotipos que infectan la piel los que están relacionados con esta neoplasia.^20,22,24
El objetivo de este trabajo es estudiar la relación existente entre VPH y NESO, proponer el método más sensible para detectar el virus y conocer los tipos virales asociados a esta tumoración en la población mexicana.

Material y métodos
Muestra

Se estudiaron 35 muestras histopatológicas de NESO incluidas en parafina, obtenidas entre 2002 y 2010, de los archivos de Patología del Hospital General de México. El criterio de inclusión fue la confirmación histopatológica de NESO. Los bloques de parafina se manejaron estrictamente para evitar contaminación, de cada bloque se cortaron cuatro secciones para la confirmación histopatológica de la infección por VPH y para la extracción del ADN.

Extracción de ADN

Para desparafinar, se colocaron las secciones de parafina en tubos de 1.5 ml con 200 µl de xilol por 20 minutos a 55°C, se hicieron lavados con etanol al 100% y al 75% durante 5 minutos a 55°C, y dos lavados con agua por 5 minutos a 55°C.
Se continuó con la extracción del ADN con el kit Healthcare Illustra blood genomic Prep Mini Spin Kit (GE), con las condiciones recomendadas, que consisten en resuspender el pellet en 180 µl de buffer de digestión y 20 µl de proteinasa K e incubar durante toda la noche a 55°C, centrifugar por tres minutos a 11 000 rpm (centrifuga 5415D, Eppendorf) y transferir el sobrenadante a un tubo nuevo, agregar 400 µl de buffer de lisis e incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente, el lisado se coloca en una columna y se centrifuga por un minuto a 11 000 rpm, se agregan a la columna 500 µl de buffer de lisis y se centrifuga, 500 µl de buffer de lavado y se centrifuga, la columna se transfiere a un tubo nuevo y se agregan 150 µl de buffer de elución, se centrifuga y la muestra de ADN se corre en un gel de agarosa al 1%. El ADN se cuantificó por espectrofotometría a 260 y 280 nm y se preservó a -20°C.

Amplificación del ADN por PCR

Cada reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se efectuó en un termociclador Applied Biosystems 2720, en un volumen total de 25 µl, conteniendo 500 ng en 13 µl de ADN.
El ADN obtenido fue amplificado con primers para betaglobina, un fragmento de 268 pb, con el objeto de asegurar su integridad, las muestras que no amplificaron fueron eliminadas del estudio.
Las reacciones de PCR con los primers universalmente aceptados GP5/GP6, L1C1/L2C2 y MY9/MY11, que amplifican fragmentos de 150, 240-250 y 450 pb, respectivamente, de la región L1 del VPH, se llevaron a cabo con un ciclo inicial de desnaturalización a 94°C por 3 minutos para los oligos MY y L1, y por 5 minutos para GP, un ciclo de extensión final a 72°C por 5 minutos para los tres, y 40 ciclos intermedios con desnaturalización a 94°C por 1 minuto para GP y por 30 segundos para MY y L1, “annealing” a 55°C por 30 segundos para MY, 45°C por 30 segundos para L1 y 40°C por 2 minutos para GP, extensión a 72°C por 30 segundos para MY y L1 y 90 segundos para GP. Las muestras que amplificaron con estos primers fueron sometidas a otra PCR con primers específicos para VPH 16 y 18, con fragmentos de 96 y 98 pb, respectivamente, de la región E6, un ciclo inicial de desnaturalización a 94°C por 2 minutos, un ciclo de extensión final a 72°C por 7 minutos y los 40 ciclos intermedios con desnaturalización a 94°C por 30 segundos, “annealing” a 60°C por 30 segundos, extensión a 72°C por 20 segundos. La interpretación positiva o negativa del resultado de las PCR fue comparada con controles positivos (ADN-HeLa) y negativos (agua destilada). Las muestras que amplificaron con primers universales fueron secuenciadas, para tal propósito los productos de la PCR fueron purificados con ExoSAP-IT (USB Corporation, Ohio, EE.UU.) y sujetos al ciclaje de secuenciación señalado por ABIPRISM Big Dye Terminator Cycle Sequencing kit (Applera, Foster City, CA, EE.UU.), las reacciones de secuenciación se corrieron en el Applied Biosystems 3130 Genetic Analyser Systems. El servidor BLAST se usó para comparar todas las secuencias disponibles en el GenBank.

Análisis estadístico

Todas las comparaciones para significación se hicieron con la prueba no paramétrica de chi al cuadrado y fueron consideradas significativas al 5% (p = 0.05).

Resultados

De las 35 muestras incluidas en parafina, una fue eliminada por ausencia de tejido, y 8 porque no amplificaron betaglobina, de las 26 muestras restantes que amplificaron betaglobina (Figura 2), 10 muestras correspondieron a carcinoma invasor y 16 a carcinoma in situ (Figura 1), estas muestras fueron de pacientes con edad entre 60 y 81 años, edad promedio de 70 años y sin antecedentes de infección por VIH.














De las 26 muestras, 10 amplificaron GP5/GP6, 7 de carcinoma in situ (1, 2, 4, 8, 19, 31, 35), y 3 de carcinoma invasor (12, 13, 24), 7 amplificaron L1C1/L2C2, 7 de carcinoma in situ (1, 2, 14, 18, 28, 31, 35). Ninguna muestra amplificó MY, esto fue atribuido a la mala calidad del ADN obtenido de los bloques de parafina, que permitió amplificar fragmentos hasta de 300 pb pero no el fragmento de MY, que es más grande (Figura 3).








Cuatro muestras amplificaron tanto GP5/GP6 como L1C1/L2C2 (1, 2, 31, 35). La secuenciación solo pudo realizarse en las muestras que fueron positivas para L1, se identificó VPH59 en dos muestras (18, 35) (7.5%) con una similitud del 95% y del 82%, respectivamente, y VPH35 en una (1) (3.8%) con una similitud del 89%, y las tres muestras correspondieron a carcinoma in situ, se identificó VPH16 con homologías menores del 95% en las cuatro muestras restantes, pero no se identificó VPH18. Las 13 (50%) muestras que amplificaron ADN del VPH con primers universales fueron examinadas por PCR con primers específicos para VPH16 y VPH18, las 13 muestras fueron positivas para VPH16 (Figura 4) y negativas para VPH18. Las 13 muestras positivas para VPH16 fueron examinadas por curvas de fusión, obteniendo en cada una de las muestras un pico único con temperaturas de 79.0°C+.02-.05°C.








Tres de las 26 muestras (1, 18, 35) presentaron una doble infección, la muestra 1, con VPH16 y 35, y las muestras 18 y 35 con VPH16 y 59.
El estudio histopatológico no demostró la presencia de coilocitosis en ninguna de las 34 muestras.
En la Tabla 1 se resumen los resultados del estudio.











Discusión

A diferencia del cáncer cervico-uterino, donde el papel etiológico del VPH está bien establecido,^25-27 en las NESO los informes en la literatura son contradictorios, lo que estimuló el interés para investigar que ocurre en la población mexicana.
En los casos estudiados no había antecedente de infección por VIH, es importante señalarlo pues actualmente se informa que la tumoración conjuntival ha aumentado en frecuencia y se presenta a más temprana edad porque han aumentado los casos de infección por VIH,^{16,22,23,28,29} dato que no se observó en esta población.
En el estudio histopatológico de esta serie de muestras no se encontró la presencia de coilocitosis, lo que está en relación con lo informado por Nakamura y colaboradores,¹⁸ quienes señalan que la coilocitosis puede ser de difícil detección. En un estudio previo realizado en este mismo hospital, con 39 pacientes con diagnóstico de NESO tratados quirúrgicamente, sólo en un caso con carcinoma in situ el estudio histopatológico señaló la presencia de coilocitosis (infección por papilomavirus).⁶
En los casos estudiados, el ADN del VPH fue detectado por PCR con iniciadores universales en 13 muestras de las 26 que amplificaron betaglobina (50%), y las 13 muestras fueron positivas para VPH16, se identificó que la temperatura de fusión para este virus es de 79.0 a 79.05°C. Además, en una muestra se identificó VPH35 y en dos muestras el tipo VPH59, estos dos últimos tipos virales no han sido mencionados con anterioridad en las lesiones tumorales de la conjuntiva. A diferencia de los resultados de este estudio, algunos autores, como Hock-Liew y colaboradores,¹⁹ no encontraron asociación entre la infección por VPH y lesiones neoplásicas de la conjuntiva en 20 casos analizados por PCR; estos autores plantean que el virus no desempeña un papel determinante en la aparición del cáncer de la conjuntiva y que es la exposición a la luz ultravioleta el factor etiológico más importante. Del mismo modo, Tuppurainen y colegas³⁰ no demostraron esta relación en neoplasias de la conjuntiva usando PCR e hibridación in situ; Tulvatana y colaboradores¹⁴ tampoco encontraron esta asociación en su estudio de 30 casos de NESO y 30 controles. En el trabajo de Guthoff y col.³¹ las 31 muestras de NESO analizadas fueron negativas para VPH, y 21 muestras presentaron elastosis solar. Manderwad y cols,³² en un estudio de 57 neoplasias de la superficie ocular de pacientes de la India, no demostraron la presencia de VPH16 y VPH18. Por el contrario, otros investigadores, como Scott y colaboradores,³³ y Ríos Hernández y colegas,³⁴ señalan la relación del VPH tipo 16 y 18 con la NESO; estos últimos autores también encontraron estos tipos virales en lesiones premalignas, como pterigion y leucoplaca, y sugieren que el virus puede tener un papel determinante en la transformación maligna de estas lesiones.
En la literatura revisada, los genotipos de VPH comunicados en las NESO son 16, 18 y 33, con una frecuencia del 50% y del 100%.^14,17,21 No se han mencionado los genotipos 59 y 35 que se identificaron en este estudio, tampoco se ha señalado que la infección por VPH en esta neoplasia sea producida por dos tipos virales, como sucedió en tres de las muestras de este estudio. Peralta y colaboradoress³⁵ encontraron ADN del VPH en ocho de 36 muestras de carcinoma de células escamosas de la conjuntiva en la población mexicana; el genotipo detectado fue el 16, este resultado coincide con el nuestro, pero nuestro porcentaje de detección de ADN del VPH fue mayor. Mc Donnell y col.³⁶ demostraron la presencia de VPH16 en 88.1% de displasias y carcinoma de la conjuntiva, aunque sugieren que un factor determinante es la luz ultravioleta. Zeynel y Tawfik²¹ encontraron la presencia de VPH16 y 18 en el 29% de carcinomas in situ de la conjuntiva y en 23% de carcinomas invasores, pero también fue identificado en un 32% de conjuntivas normales. Otros autores han encontrado VPH en lesiones premalignas de la conjuntiva y su ausencia en lesiones malignas.¹² Reszec y col.³⁷ demostraron ADN del VPH por inmunohistoquímica y por PCR-RFLP en lesiones benignas y malignas de párpados y conjuntiva, y concluyen que la infección por VPH no es un factor etiológico significante, como lo es la mutación de p53. Por otra parte, Asadi-Amoli y col.³⁸ encontraron ADN del VPH en 46 de 50 muestras de carcinoma de células escamosas de la conjuntiva, pero no fueron detectados los tipos 16, 18, 31 y 33, lo q ue pone en duda la participación de los tipos genitales del VPH en el carcinoma de la conjuntiva.
Legrand³⁹ señala que la detección del VPH es mejor en biopsias congeladas que en bloques de parafina pues la parafina contiene inhibidores de la PCR y la formalina induce degradación del ADN; sin embargo, en la mayoría de los trabajos consultados, los estudios se efectuaron en bloques de parafina, al igual que en el nuestro, y se obtuvieron resultados confiables. El ADN obtenido de bloques de parafina para este trabajo estaba degradado, pero confirmamos su utilidad amplificando un gen constitutivo, que fue la betaglobina, en las muestras que no amplificaron betaglobina y que fueron eliminadas para el estudio la cantidad de ADN fue menor de 15 ng/µl.
La sensibilidad y especificidad de los procedimientos de PCR en este estudio muestran una variación que puede depender principalmente de los iniciadores utilizados y del tamaño del producto obtenido. Sabemos que para alcanzar el éxito en los ensayos moleculares es necesaria la obtención de una muestra adecuada de ADN procedente del material biológico, en este estudio procedía de bloques de parafina y la calidad del ADN era escasa, pero fue validada con la amplificación del gen de betaglobina.


Conclusión

En el 38% de las muestras estudiadas, obtenidas de la población mexicana, se encontró la asociación de NESO con infección por VPH. El genotipo 16 del VPH fue confirmado en el 50% de las muestras que amplificaron betaglobina; además, se encontraron los genotipos 59 y 35, no mencionados en la literatura, y tres muestras con doble infección. Sugerimos que la PCR es una técnica de gran sensibilidad en la detección del VPH, en comparación con el estudio histopatológico.

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