The Most Evident Biological Modifications during Cellular Diferentiation

Abstract
Cellular differentiation is a complex biological process. To contribute to its understanding, two leading biological models have been used, the embryonic development and the in vitro induced pluripotent stem cells, generated from somatic cells.

The main biological elements of the cellular differentiation process are the cellular phenotype programming/reprogramming, the asymmetric cell division and the genetic/epigenetic selective regulation of the gene transcription.

Different molecular agents initiate and drive programming and reprogramming of the cellular fate through modifying genomics and epigenomics specific patterns that regulate the expression of activators and repressors genes involved in basic and specialized cellular processes. Asymmetric cell division is one of the most relevant of these basic processes, which is key for the generation of different cell types during the embryonic development , and for the maintenance of tissue homeostasis.

In recent years, the progressive understanding of the cellular differentiation process has been achieved owing to the identification of epigenetic biomarkers related to the regulation of gene expression.

Key words
cellular differentiation, programming/reprogramming cellular phenotype

Artículo completo
La diferenciación celular corresponde a un proceso fundamental para mantener la homeostasis celular. Por su elevada complejidad, sus cambios moleculares sólo han empezado a entenderse en los últimos años.

Todas las células somáticas de los organismos mamíferos contienen información genética idéntica, a pesar de que muestran características morfológicas y funcionales distintas. El cuerpo humano contiene aproximadamente 210 variedades de células, las cuales representan diferentes fenotipos o conductas biológicas. Con el advenimiento de las nuevas tecnologías que permiten precisar y caracterizar el genoma, el transcriptoma, el proteoma y el estado epigenómico de cada tipo celular, la definición de identidad celular se está moviendo progresivamente desde la descripción del fenotipo tradicional (características morfológicas y pocos biomarcadores) hacia indicadores moleculares funcionales del fenotipo celular.
Para entender la diferenciación celular, los investigadores han empleado dos modelos biológicos principales: el del desarrollo embrionario y el de la inducción in vitro de células madre pluripotenciales (iPSC, induced pluripotent stem cells). Durante el desarrollo embrionario, las células en proceso de diferenciación son expuestas a diferentes factores de transcripción y a modificaciones epigenéticas, lo cual contribuye a la iniciación y el mantenimiento de patrones específicos de expresión genética (programación del fenotipo celular). Las bases moleculares de cómo las células madre embrionarias (ESC, embrionic stem cells) inician o mantienen este programa de diferenciación no están totalmente comprendidas. Las ESC son fenotípicamente heterogéneas y muestran activación variable de genes de pluripotencialidad de acuerdo con el nivel de factores de transcripción y de reguladores epigenéticos. Mediante el modelo de iPSC se ha demostrado que los cambios que suceden durante la diferenciación son reversibles (reprogramación celular del fenotipo). Otro de los principales eventos biológicos que se requieren para que las ESC o las células madre somáticas cumplan las funciones de autorrenovación, junto con la de generación de progenitoras, es realizar una división celular asimétrica.

El progreso en la comprensión del proceso de diferenciación celular permitirá mejorar los modernos enfoques biomédicos traslacionales en múltiples áreas de la salud y la enfermedad, como el tratamiento del cáncer o la medicina regenerativa. Esta mejora sería más acentuada particularmente en esta última, con la generación de poblaciones celulares diferenciadas autólogas que serían empleadas en el tratamiento de diferentes enfermedades crónico-degenerativas.^1,2 En esta revisión analizaremos los tres eventos biológicos más sobresalientes del proceso de diferenciación celular: programación/reprogramación del fenotipo celular, división celular asimétrica y regulación genética/epigenética de la transcripción génica.


Programación fisiológica y reprogramación del fenotipo celular

Los organismos heredan de sus progenitores una serie de ordenamientos dentro de las principales vías de señalización moleculares intracelulares, los cuales se organizan como programas armónicos de funcionamiento microcelular (hardware). Los diferentes tipos de células embrionarias, células progenitoras (en etapas de iniciación y progresión de diferenciación) y terminalmente diferenciadas, contienen programas genómicos/epigenómicos temporoespaciales específicos que les otorgan un fenotipo transitorio o definitivo (paquetes de software específicos). Todos los cambios moleculares secuenciales que ocurren en este proceso son denominados programación genómica/epigenómica fisiológica para una célula en particular, o simplemente programación del fenotipo celular. El proceso inverso es la reprogramación del fenotipo celular y puede ocurrir a partir de su inducción experimental o debido a errores graves secundarios a diferentes estados patológicos. La reprogramación in vitro de diferentes tipos de células somáticas (individuo X) logra iPSC, las cuales pueden ser redireccionadas y transformadas a células rediferenciadas, lo cual permite la generación de células somáticas diferentes (mismo individuo X) con idéntico inmunofenotipo-HLA. La generación in vitro de este tipo de iPSC ha proporcionado un modelo experimental que permite estudiar los cambios moleculares que ocurren en la programación/reprogramación celular, evitando la necesidad de usar células embrionarias.³
El ejemplo más común de un proceso de programación del fenotipo celular normal son los diferentes eventos de la diferenciación celular que suceden en el desarrollo embrionario, en el que, inicialmente, una célula totipotente (zigoto) se transforma en una célula pluripotente (por ej., células de la masa interna del blastocisto) hasta que, finalmente, se especializa en una célula somática terminalmente diferenciada. La diferenciación celular no solamente ocurre durante las diferentes etapas del desarrollo embrionario, sino durante toda la vida. En los tejidos adultos, las células madre multipotentes somáticas producen células progenitoras que progresan hasta convertirse en células terminalmente diferenciadas.^3,4
La reprogramación del fenotipo celular corresponde a la conversión de un tipo celular específico a otro diferente, uno de cuyos ejemplos más demostrativos es la transformación de un fibroblasto a una célula madre pluripotencial. El concepto de reprogramación celular está directamente relacionado con el de plasticidad celular, es decir, la factibilidad que presentan las células (tanto las células madres como las diferenciadas) para adoptar el perfil de expresión génica y el fenotipo funcional de otros tipos de células diferenciadas (pertenecientes al mismo linaje o a uno diferente).⁵ Globalmente, la susceptibilidad de las células somáticas para reprogramar su fenotipo es inversamente proporcional a su grado de diferenciación.⁶
El ejemplo más conocido de un proceso de reprogramación del fenotipo celular ha sido la inducción in vitro de iPSC a partir de células somáticas diferenciadas. Esto se ha logrado por varios métodos, pero los informados por Takahashi y Yamanaka^7,8 son, comparativamente, más reproducibles por haber identificado los factores transcripcionales reguladores del proceso para la generación de iPSC. Estos investigadores reprogramaron fibroblastos adultos in vitro empleando los factores de transcripción OCT4, SOX2, KLF4 y MYC como inductores. Estudios posteriores mostraron que este tipo de reprogramación celular se puede lograr empleando solamente NANOG y OCT4,⁹ y que la eficiencia en la generación de iPSC aumenta agregando moléculas reguladoras epigenéticas e inhibidores de proteínas supresoras tumorales. Ejemplos del primer grupo son los inhibidores de histona-desacetilasas y de ADN-metilasas, y del segundo, bloqueantes de p53 y p21 (durante la reprogramación celular, las células incrementan su tolerancia a diferentes tipos de daño del ADN). Durante la reprogramación celular se presentan cambios epigenéticos (patrones específicos de cada una de las células) que conducen a modificaciones dinámicas de la cromatina. La estructura y la dinámica de la cromatina son modificadas por los diferentes factores epigenéticos: cambios covalentes de las histonas, sustitución de histonas canónicas por variantes, metilación del ADN, ARN no codificantes, así como por complejos de remodelación de la cromatina. La reprogramación celular revierte el estado de oligopotencialidad preprogramado por medio de cambios epigenómicos.

El proceso de reprogramación del fenotipo celular no ocurre en una sola generación celular, sino en forma gradual conforme las células se dividen (en dos o más ciclos celulares). En el modelo clásico de reprogramación de fibroblastos para ser transformados en iPSC, el proceso de reprogramación tiene lugar en forma gradual, desactivando y activando genes que regulan las capacidades de unipotencialidad y pluripotencialidad, respectivamente, lo cual permite identificar diferentes etapas en el tránsito hacia la pluripotencialidad. Este proceso se produce mediante cambios en la reorganización de la cromatina por modificaciones postraduccionales de las histonas y de los patrones de metilación del ADN, de tal forma que las marcas epigenéticas de las células diferenciadas se borran y se instalan marcas epigenéticas de células pluripotenciales. La transformación fenotípica en este modelo ocurre en 2 a 4 semanas, lapso durante el cual se presentan diferentes células intermedias, algunas de ellas de vida larga y otras de vida transitoria. El análisis de los ensayos clásicos de Takahama y Yamanaka y de otros experimentos posteriores que emplearon diferentes variables relacionadas con la producción de iPSC, ha demostrado que la eficiencia y la latencia para generar iPSC dependen de las diferentes variables empleas en los ensayos in vitro: factores transcripciones de reprogramación, método de introducción a la célula, tipo de célula somática, condiciones de cultivo celular, señalizaciones adicionales en el microambiente, etcétera. Todas estas variables activan e inactivan grupos de genes específicos, provocan modificaciones epigenéticas en la cromatina y, finalmente, establecen un patrón definido de expresión génica que inician vías de señalización moleculares específicas de las funciones celulares, tanto fundamentales como especializadas.^10-12
El proceso de reprogramación del fenotipo celular a partir de células somáticas implica superar dos barreras principales que la célula emplea para preservar su identidad; la principal barrera es librarse de la respuesta de estrés que conduce a la reducción de su viabilidad, senescencia y apoptosis (la vía dep53 trabaja como barrera). Otra barrera implica superar el ambiente no permisivo de la cromatina para la expresión génica de los factores pluripotenciales endógenos.^13,14


Factores de transcripción en el proceso de programación/reprogramación celular

Durante la clonación de la oveja Dolly, se demostró que diferentes proteínas citoplasmáticas (factores de transcripción) de ovocitos reprogramaban los genes de una célula adulta del tejido mamario (transferencia del núcleo), formando una célula totipotente capaz de generar toda la variedad de células terminalmente diferenciadas (oveja hija). Junto a estos hallazgos, la identificación de diferentes perfiles de transcriptoma (factores de transcripción) entre una célula diferenciada y su iPSC, demostraron que un grupo específico de factores de transcripción regula el proceso de diferenciación celular.^7-8 Como hemos mencionado, los factores de transcripción OCT4, SOX2, KLF4, MYC y otros como NANOG, TDGF1, UTF1 y LIN28 lograron la inducción de células madre pluripotentes a partir de células terminalmente diferenciadas. Estos factores de reprogramación génica modifican la morfología, la tasa de proliferación, los antígenos de superficie, la expresión génica, el estado epigenético de la expresión de genes específicos y la actividad de la telomerasa, lo cual conduce a la célula de un estado de diferenciación terminal a un estado de pluripotencia. Particularmente, estos factores de reprogramación génica activan genes diana relacionados con la autorrenovación celular e inactivan genes de diferenciación celular. Las células pluripotentes reprogramadas a partir de células adultas diferenciadas reciben el nombre de iPSC, las cuales son globalmente muy parecidas a las células embrionarias derivadas de la masa celular interna del blastocisto (ICM, internal celular mass). Esta pluripotencia se pone de manifiesto por la expresión de una serie de marcadores típicos de las células embrionarias, como SALL4, DAX1, ESSRB, TBX3, TCL1, RIF1, NAc1, ZFP281 y STAT3, y de genes implicados en el mantenimiento del estado indiferenciado, como KLF4, KLF2, NANOG, OCT4, SOX2, c-MYC y LIN28; sin embargo, algunas iPSC expresan algunos genes de la célula somática de origen.¹³


Factores reprogramadores o reguladores maestros implicados en la inducción y el mantenimiento del estado de diferenciación celular

Diferentes factores de transcripción han sido identificados como reguladores en la iniciación/mantenimiento de reprogramación del fenotipo celular en tipos celulares específicos.

Algunos de estos factores participan en procesos de transdiferenciación celular. Ésta corresponde a la conversión de un tipo específico de célula somática en otro, sin transitar a través del estado de pluripotencia; puede ser provocado por factores de transcripción específicos, en combinación con condiciones in vitro particulares. Ejemplos de esto son el factor miogénico MyoD (convierte fibroblastos a miocitos), el C/EBPa (convierte linfocitos B a macrófagos) y la pérdida de Pax5 (provoca desdiferenciación de linfocitos B).^4,15
Los factores de transcripción OCT4, SOX2, c-MYC y KLF4 (OSMK) fueron identificados como factores generadores o reguladores maestros para la reprogramación de diferentes tipos de células somáticas diferenciadas y la generación de iPSC.^7,8,16,17 Octamer 4 (OCT4, también conocido como OCT3/4 o POU5F1) es un factor de transcripción con homeodominio, junto con SOX2, son los únicos factores necesarios para la reprogramación de células adultas en iPSC; la actividad biológica de OCT4 depende, en gran medida, de sus niveles de expresión y de otros cofactores, como el factor inhibitorio de leucemia (LIF, leukemia inhibitory factor). SOX2 contiene un dominio de unión al ADN del tipo HMG (high mobility group); es necesario para el desarrollo embrionario y para prevenir la diferenciación de las ESC. NANOG también se une al ADN a través de homeodominio; las células embrionarias expresan niveles variables de NANOG, que actúa como regulador entre la autorrenovación y la diferenciación. El factor KLF4/KLF2 (Kruppel-like factor) es una proteína que contiene un dominio de tres dedos de zinc; participa en la reprogramación celular en colaboración con OCT4 y SOX2. Los factores KLF intervienen en la autorrenovación celular mediante la regulación se la vía de señalización de AKT, y reprimen a p53, que a su vez suprime a NANOG durante la diferenciación de las ESC. El factor c-MYC se une al ADN mediante un dominio B-HLH-LZ (región básica-hélice lazo hélice-cremallera de leucina), dimeriza con la proteína MAX y regula la expresión de más de mil genes y de varios miARN (induce algunas histona acetiltransferasas y desmetilasas y, secundariamente, produce cambios globales en la estructura de la cromatina). C-MYC promueve la proliferación mediante el remodelado de la cromatina, que facilita el acceso de los factores de reprogramación a dianas de pluripotencia. Aunque c-MYC forma parte del conjunto de factores de transcripción usados en la reprogramación de células maduras a iPSC, no es imprescindible para ello.^16-18


Redes reguladoras de los factores de transcripción en la diferenciación celular

El establecimiento y el mantenimiento del estado celular indiferenciado o diferenciado son producto de la acción de muchos factores de transcripción que intervienen de manera coordinada en el tiempo, formando distintos complejos sobre los promotores de los genes diana, los cuales son activados o reprimidos.¹⁹ Este control activa a los genes que mantiene a la célula madre en su estado de autorrenovación e indiferenciada, o bien a las células de un linaje determinado en sus funciones especializadas. El estado celular diferenciado es el estado termodinámico más estable desde el punto de vista de las redes de señalización de regulación genómica. Sólo algunas células de la población en estado de diferenciación terminal son susceptibles de reprogramación celular fenotípica.²⁰
Las dianas genéticas de los factores de transcripción que ejecutan la reprogramación celular han sido estudiadas empleando la técnica de chip-on-chip. Por medio de ellas se ha encontrado que OCT4, SOX2 y NANOG en las ESC y las iPSC, colaboran en forma coordinada para formar un complejo que se une a los promotores génicos. Cuando se analiza la expresión del mARN de los genes que se unen a este complejo, sólo la mitad son activos de manera transcripcional. La otra mitad de estos genes son regulados por el grupo de proteínas Polycomb (PcG), que reprimen la expresión génica por modificaciones epigenéticas del tipo de metilación y acetilación de histonas. Típicamente, los complejos PcG son responsables de la trimetilación de la lisina 27 en la histona H3 (H3K27me3). Este tipo de metilación, que se encuentra ausente en los fibroblastos, reaparece en las iPSC. Todos los estudios al respecto coinciden en concluir que la reprogramación por los factores de transcripción OSMK es un proceso gradual, que requiere la expresión de dichos factores durante dos semanas. Esto indica que los genes han de ir silenciándose o activándose en un proceso que implica cambios a nivel de la cromatina (acetilación/desacetilación, metilación/desmetilación de histonas y metilación/desmetilación de citosinas del ADN).²¹


División celular asimétrica en las poblaciones de células madre y progenitoras

La capacidad de las células de dividirse asimétricamente es esencial para la generación de diversos tipos de células durante el desarrollo embrionario.²² La división celular asimétrica recientemente ha surgido como uno de los principales mecanismos que controlan el número de células madre y su diferenciación.²³ Una división celular asimétrica produce dos células hijas con diferente destino, en contraste con la división celular simétrica que da origen a dos células similares. Las divisiones asimétricas ocurren por segregación diferente de los componentes del citoplasma (orgánulos, suborgánulos, biomoléculas) y, de manera concomitante, de las vías de señalización intracelulares. Las dos células diferentes separadas durante la citocinesis, resultan con distintos patrones de diferenciación. Generalmente, una célula madre se divide asimétricamente en una nueva célula madre de autorrenovación y en una célula progenitora comprometida en el proceso de diferenciación. Mientras que las diferencias de las células madre son evidentes en los organismos eucariontes simples, las células madre de los mamíferos adultos muestran escasas diferencias, particularmente en su tasa de proliferación.^9,24
Las células madre adultas están encargadas de mantener los diferentes tipos de células especializadas que componen el organismo. La mayoría de ellas realiza esta tarea durante toda la vida del organismo, gracias a su capacidad de autorrenovación y de división celular asimétrica. La división celular asimétrica en las células madre ha surgido como uno de los principales mecanismos fisiológicos que regulan el número de células y su diversidad para mantener la homeostasis tisular.¹⁸ Una gran cantidad de moléculas, denominadas genéricamente determinantes del destino celular, participa en la regulación de la división asimétrica; éstas han sido identificadas particularmente en C. elegans y en neuroblastos de D. melanogaster .²⁵ Entre ellas, se destacan dos grupos: aquellas que orientan el huso mitótico durante la división (proteínas G heterotriméricas, PAR, PKC-3, aPKC, Numb, BRAT, Miranda, etc.) y las proteínas codificadas por los genes supresores tumorales (Lethal, Disc).^22,26 Estas proteínas participan en la interfase, la profase y la anafase/telofase polarizando el eje celular y el posicionamiento de los centrosomas y del anillo contráctil durante la citocinesis. Cuando la célula madre realiza la citocinesis se produce asimetría intrínseca de componentes citoplasmáticos en las células hijas, como de diferentes moléculas que modulan la dinámica del citoesqueleto, el tráfico vesicular, etc. La regulación de la formación y la función del huso mitótico ha sido considerada como el control de la división celular asimétrica, la cual se encuentra en relación directa con componentes fundamentales para determinar la estructura y el soporte celulares, el transporte y la organización intracelular y la morfogénesis tisular por medio de contractilidad y movilidad (adhesión celular y polaridad).^27,28 Estas funciones se relacionan con las propiedades dinámicas de los distintos tipos de filamentos que constituyen el citoesqueleto, como su ensamble/desensamble, polimerización/despolimerización, y con proteínas vinculadas con su funcionamiento.^29,30
La división asimétrica de las células madre somáticas produce tanto una célula madre como una progenitora. Las células progenitoras iniciales, por medio de nuevos ciclos de división celular asimétrica, alcanzan finalmente su estado terminal de diferenciación celular, debido a cambios en las señalizaciones intracelulares y extracelulares (ambientales). Después que las células dejan su estado de madre y empiezan a diferenciarse, realizan selecciones excluyentes de rutas fenotípicas por medio de modificaciones genómicas/epigenómicas secundarias, principalmente a diferentes tipos y gradientes de factores de transcripción (programación fisiológica de diferenciación celular). Esto conduce, por ejemplo, a la activación de vías biosintéticas especializadas, a la remodelación del citoesqueleto y a la represión de las señalizaciones de proliferación celular. Uno de los modelos que sustentan este mecanismo corresponde a la diferenciación de células en el sistema hematopoyético, en el cual los factores de transcripción GATA-1 y PU.1, inhiben recíprocamente a otras moléculas en las células progenitoras mieloides para crear una situación de decisión binaria y seleccionar entre los destinos de rutas eritroide/megacariocito o mieloide/monocito.¹⁸


Modificaciones de la expresión génica en la diferenciación celular
La expresión de los genes está regulada principalmente a nivel de su transcripción. La activación de los genes en las células eucariotas requiere un estrecho control temporal de factores activadores que se unen a diferentes secuencias génicas. El mecanismo prevalente de regulación se lleva a cabo a nivel de su transcripción, particularmente por los denominados factores de transcripción, los cuales se unen a elementos reguladores cercanos al sitio 5’ de iniciación de la transcripción. Los factores de transcripción corresponden a proteínas con capacidad de interactuar con secuencias específicas de ADN y disparar su actividad transcripcional. La mayoría de los factores transcripcionales contienen diferentes dominios que participan en aspectos distintos de la función de la proteína; en general contienen dos dominios: un dominio que se enlaza a secuencias específicas del ADN y un dominio de activación que regula la transcripción al interactuar con otras proteínas. Los dominios de unión al surco mayor del ADN corresponden a segmentos de tipo hélice alfa y presentan tres estructuras relacionadas (motifs): estructura de dedos de cinc (por ej., TFIIIA), de hélice-asa-hélice (por ej., MyoD) y de cremallera de leucina (por ej., bZIP). Los factores transcripcionales pueden dividirse en dos clases funcionales: factores transcripcionales generales, que se unen a los sitios promotores, y factores transcripcionales específicos de secuencia, que se unen a varios sitios reguladores de genes específicos. En la regulación de la transcripción génica, además de los factores de transcripción, participan moléculas coactivadoras y correpresoras, las cuales se unen a ellos, modificando su actividad en un sentido positivo o negativo. Cada tipo de célula tiene un patrón característico de transcripción de genes, que está determinado por la unión de combinaciones de factores de transcripción a las regiones reguladoras de un gen. Las células expuestas a diferentes estímulos responden intrínsecamente mediante la síntesis de diferentes factores de transcripción. Del 5% al 10% del genoma humano codifica factores transcripcionales.³¹
La diferenciación celular implica un cambio profundo de la expresión génica. Así, por ejemplo, el proceso que convierte un cigoto fecundado en más de 210 tipos celulares en un recién nacido, corresponde a una programación genética ordenada en el espacio/tiempo y en los tejidos de miles de genes que se activan o se inactivan. Este proceso de desarrollo y diferenciación celular es controlado por un numeroso conjunto de genes que codifican diferentes factores de transcripción, los cuales responden a señales extracelulares o de contacto célula-célula.

Todos los genes que codifican proteínas y ARN no codificantes, son transcritos por la ARN polimerasa II (ARNPII). La transcripción depende, sobre todo, de la tasa de su inicio, es decir, la tasa de unión de la ARNPII con los factores transcripcionales generales y específicos al sitio de iniciación de la transcripción en el gen (región promotora y primer exón). Las proteínas que activan o reprimen la transcripción provocan cambios en la topología del ADN, modificaciones postraduccionales de las histonas, remodelación de la cromatina y metilación de citosinas del ADN.

Se han identificado cuatro secuencias reguladoras diferentes dentro del gen, que se unen a los factores de la transcripción en dicho proceso: el promotor básico, el promotor proximal, el promotor distal y otras regiones modificadoras de la transcripción, como potenciadores (enhancers), silenciadores (silencers) y aisladores (insulators). Estas regiones se localizan cerca del primer exón; en general, el promotor básico se ubica a 30 pb de distancia, los promotores proximal y distal, a 0.1-10 kb, respectivamente, y las regiones modificadoras lo hacen a 10-100 kb; el complejo de la ARNPII se une a la región del promotor básico.³¹
El proceso de transcripción se inicia por la unión de factores de transcripción a secuencias de los promotores proximal y distal, lo que provoca una apertura de la cromatina y el reclutamiento de otros factores de transcripción llamados, genéricamente, coactivadores (por ej., TFIID y el complejo modificador de histonas). Este último actúa acetilando/metilando la cola N-terminal de las histonas y desmetilando citosinas del ADN, con lo cual modifican el estado de compactación de la cromatina. A continuación, un complejo proteico llamado mediador, enlaza los factores generales de transcripción (TFIID, TFIIA, TFIIB, etc.) con la ARNPII y la ubican en el sitio de inicio de la transcripción del gen.³²
Mientras más genes se examinan, se encuentra una mayor variabilidad en la localización y la constitución de los elementos promotores y reguladores. Casi un 50% de los genes de las células de los mamíferos tienen más de un promotor (promotores alternativos), lo que permite que la iniciación de la transcripción de un gen ocurra en más de un sitio en el genoma.

Una vez generado el transcrito, el corte y empalme alternativo de los distintos segmentos del ARN codificados de los distintos exones del gen, regulan la expresión génica y proveen el mecanismo por el cual un solo gen puede codificar dos o más proteínas relacionadas. Un ejemplo de este tipo de corte y empalme alternativo tiene lugar durante la síntesis de la fibronectina, una proteína que se encuentra tanto en el plasma como en la matriz extracelular; es sintetizada por hepatocitos y por fibroblastos, respectivamente, y difieren en la cantidad de péptidos. Más del 70% de los genes humanos están sujetos a corte y empalme alternativos; el corte y empalme alternativo tiene el potencial de generar un gran número de polipéptidos relacionados a partir de un solo gen.

El control de la expresión génica a nivel traduccional comprende tres mecanismos principales: ubicación del ARNm en ciertos sitios de la célula, su traducción o no (y su frecuencia) y la vida media/estabilidad del transcrito. La información que regula la localización citoplasmática de un ARNm reside en su segmento no codificante (UTR)3, la cual está mediada por proteínas específicas que reconocen esas secuencias. Diferentes mecanismos afectan la traducción del ARNm, como diferentes señalizaciones intracelulares y extracelulares. La vida media de los ARNm eucariotas es muy variable y depende de la constitución propia del ARN (colas de poliA); por ejemplo, la degradación del ARNm comienza en su extremo 5’, seguida por la remoción de la cola de poliA en el extremo 3’ y de un programa celular de requerimiento de la proteína correspondiente.
Los ARN no codificantes, principalmente los microARN (miARN), modulan la transcripción génica y los estados epigenéticos. Los miARN suprimen la expresión genética al degradar al ARNm a nivel postranscripcional, modulando la estabilización de la degradación del ARNm blanco. Diferentes genes en las células pluripotentes y diferenciadas se encuentran bajo el control de los miARN. Los factores OCT4, SOX2 y NANOG regulan los promotores de muchos miARN en las células pluripotentes; uno de ellos, el mir290, regula la expresión de las metiltransferasas DNMT3a y DNMT3b.³²


Control transcripcional en la diferenciación celular

La complejidad inherente en el control de la transcripción de genes puede ilustrarse en el examen del ADN en un solo gen. Cada proceso celular fundamental o especializado representa la activación de cientos a miles de genes de diferenciación o de represión (genes de desdiferenciación). La clave para entender la regulación génica y su expresión reside en identificar las funciones de numerosas secuencias de ADN reguladoras, los factores transcripcionales que se unen a esas secuencias y dilucidar la organización de las señalizaciones que se encargan de la activación de la maquinaria de expresión selectiva de dichos genes.³¹
El mantenimiento del proceso de diferenciación celular, como el de otros procesos celulares fundamentales, es producto de la acción de muchos factores de transcripción que intervienen de manera coordinada en el tiempo, formando distintos complejos sobre los promotores de los genes diana (de la diferenciación celular particular de acuerdo con el linaje celular), que son así activados secuencialmente. Como hemos mencionado, las interrelaciones funcionales entre los factores de transcripción y los diferentes genes pueden estudiarse mediante técnicas moleculares de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP), seguidas de hibridación de las secuencias de promotores génicos mediante microarrays (chips).^31,33
El proceso de diferenciación celular implica una programación del fenotipo celular diferente al de los patrones de expresión de las células madre. Al comparar los transcriptomas de las células embrionarias con los de los fibroblastos, se han encontrado diferencias de más de 4 veces en la expresión de 5 000 genes.⁸ Globalmente, el balance de la expresión génica de una célula diferenciada en forma terminal es menor que el correspondiente a la célula madre somática del mismo tejido. Durante la diferenciación celular, los genes encargados de mantener la célula indiferenciada (procesos de proliferación y autorrenovación) son desactivados, mientras que los genes que codifican para proteínas específicas del estado de diferenciación terminal son inducidos.


La regulación epigenética de la transcripción

Para la homeostasis tisular se requiere un equilibrio cuidadoso de regulación epigenómica entre las células madre, su progenie y el microambiente tisular. El término epigenética se define como los cambios heredados en la expresión génica que no son debidos a alteraciones en la secuencia del ADN. Los mecanismos epigenéticos incluyen las modificaciones de las histonas, el remodelado de la cromatina y la metilación del ADN, y son importantes para el establecimiento de patrones fisiológicos de expresión génica. El empaquetamiento del genoma eucariota en la cromatina tiene gran influencia en la transcripción génica. Las modificaciones covalentes de las colas N-terminales de las histonas ejercen efectos importantes en la estructura y la función de la cromatina, lo que facilita o impide la asociación de proteínas reguladoras y de factores de transcripción al ADN.^21,33
En función del grado de condensación, la cromatina puede dividirse en heterocromatina (regiones densamente empaquetadas, que no permiten la expresión génica) y eucromatina (regiones relativamente poco condensadas, que permiten la expresión génica). La heterocromatina es abundante en los telómeros y los centrómeros. El estado de heterocromatina silente se asocia con niveles bajos de acetilación y con niveles elevados de metilación en algunas histonas, como H3K9, H3K27 y H4K20. En las regiones de eucromatina, el ADN presenta mayor flexibilidad funcional y los genes pueden ser activos (histonas con niveles elevados de acetilación) o inactivos (niveles bajos de acetilación, metilación y fosforilación). La acetilación de las histonas H3 y H4, la dimetilación o trimetilacion de H3K4 y la presencia de la variante H2AZ son modificaciones típicas de la eucromatina.³⁴
Durante la activación de la transcripción, los factores de transcripción se unen con promotores e inducen el reclutamiento de factores transcripcionales generales, complejos modificadores de cromatina y ARNPII, lo cual inicia la transcripción del gen. La cromatina representa un nivel adicional de regulación de la expresión génica. La modulación entre cromatina activa e inactiva se encuentra relacionada con la actividad de las enzimas modificadoras de histonas y los complejos de remodelado de la cromatina.²¹
Además de las histonas canónicas (H3, H4, H2A y H2B) que conforman el nucleosoma, existen formas variantes de histonas implicadas en la regulación de la transcripción, que se incorporan a la cromatina de forma independiente a la replicación del ADN, como la H2AZ (flanquea la heterocromatina silente). Las modificaciones en las histonas son dinámicas y cambian rápidamente en respuesta a estímulos celulares.
La acetilación de las histonas es llevada a cabo por las enzimas acetiltransferasas (HAT), lo cual favorece un efecto activador de la transcripción ya que reduce fuertemente la afinidad de las histonas por el ADN, al neutralizar la carga positiva de las lisinas. La mayoría de las HAT forman parte de grandes complejos multiproteicos y su acción tiene lugar en múltiples residuos de lisina. La desacetilacion de histonas se correlaciona con la compactación de la cromatina y la represión transcripcional. Los niveles relativos de acetilación de histonas están determinados por las actividades antagonistas de las HAT y de varias familias de desacetilasas (HDAC).
Las modificaciones postraduccionales por metilación de las histonas en los residuos de lisina son más estables, y se realizan por histona metiltransferasas específicas; de acuerdo con la colocación de los grupos metilo en las H3 (residuos K4, K9, K27, K36) o H4 (K20), pueden agregar uno, dos o tres grupos metilos. La metilación de las histonas puede tener un efecto activador o represor de la expresión. La adición de grupos metilo en H3K9 promueve la compactación de la cromatina y la desactivación transcripcional.
Diferentes coactivadores de la transcripción génica tienen actividad de HAT. Esta asociación demostró la relación crucial entre la acetilación de histonas, la estructura de la cromatina y la activación génica. Tras ubicarse en la región blanco, el coactivador acetila las histonas de los nucleosomas cercanos, lo cual modifica el remodelado de la cromatina. Las acciones combinadas de estos diferentes complejos incrementan/disminuyen la accesibilidad del promotor a los componentes de la maquinaria de transcripción.

En la diferenciación celular, es evidente que las células eucariotas utilizan mecanismos de regulación negativa de la transcripción (para genes de pluripotencia). El estado de activación transcripcional se relaciona con cambios en el estado y la posición de los nucleosomas; la desacetilación por las enzimas HDAC se relacionan con la represión transcripcional. Las HDAC actúan como correpresores y son reclutadas por factores transcripcionales represores. La eliminación de grupos acetilo de las colas de histonas se acompañan de otras modificaciones, como la metilación del residuo 9 de lisina en H3; este cambio se asocia con la formación de heterocromatina junto con represión transcripcional.³³
Además de estos cambios postraduccionales en las histonas, otro mecanismo epigenético que participa en la regulación transcripcional es la metilación/desmetilación del ADN, principalmente en las regiones promotoras de los genes, por medio de las enzimas ADN-metiltransferasas (ADNMT), particularmente en la citosina de los dinucleótidos 5’-CpG-3’. Los dinucleótidos CpG se concentran en las regiones reguladoras 5’ de los genes, y alrededor del 90% de estas islas CpG se encuentran no metiladas en las células somáticas normales. La metilación del ADN es un mecanismo normal de silenciamiento génico. Durante la fase S, las ADNMT copian el patrón de metilación de la hebra parental a la hebra hija de ADN.

Existe una relación de cooperación funcional entre la metilación del ADN con las modificaciones de las histonas, ya que algunas proteínas de unión al ADNA metilado, como las proteínas de unión a dominios metil-CpG (MBD), atraen a complejos de HDAC e histona metiltransferasas y modifican el remodelado de la cromatina. Aunque la metilación del ADN es una marca epigenética relativamente estable, la transmisión de estas marcas de una célula progenitora a sus descendientes está sujeta a regulación, pero, en general, se mantiene durante las divisiones celulares subsiguientes. La metilación del ADN es el mecanismo fisiológico de inactivación del cromosoma X y del proceso denominado impronta génica.³⁴
Las modificaciones estructurales y funcionales de la cromatina representan un nivel adicional de regulación para interacciones biológicas del ADN, como en la transcripción, la recombinación, la formación del centrómero, etc. Además de los cambios postraduccionales de las histonas mencionados, la cromatina es remodelada por complejos multiproteicos dependientes de ATP para alterar la estructura y la localización del nucleosoma, exponiendo u ocultando el ADN a las interacciones con factores de transcripción. Los mecanismos de remodelado incluyen el desenrollamiento transitorio del ADN del octámero de histonas, la formación de lazos de ADN o el deslizamiento de los nucleosomas a diferentes posiciones. Existen más de cinco familias de complejos de remodelado de la cromatina; los más estudiados corresponden a las familias SWI/SNF y ISW1.³⁵
Otro mecanismo epigenético de silenciamiento de la expresión génica es llevado a cabo por el complejo de proteínas PcG, el cual puede actuar en cooperación con otros complejos o de forma individual e interactuar sobre las histonas. Se han identificado dos complejos PcG represores: el PRC1 y el PCR2. Como represor epigenético, el complejo PcG participa principalmente en el silenciamiento de los genes en el desarrollo embrionario al compactar la cromatina y catalizar la monoubiquitinación de la histona H2A y la metilación de la histona H3 en la lisina27.^34,36 La represión de la expresión génica mediada por PcG es antagonizada por un complejo de proteínas Trithorax; sin embargo, las bases moleculares de esta actividad antagónica es sólo conocida parcialmente.³⁷
En el sistema de memoria epigenético celular participan dos grupos reguladores de la condensación de la cromatina, las proteínas Trithorax y PcG; ambas se encargan de mantener niveles permisivos o no de la transcripción. Ambos complejos proteicos modifican la cromatina en estados bivalentes para la activación y la represión génica y conducen a la célula a la pluripotencia o la diferenciación. Si se produce la diferenciación, se presentan cambios en la condensación de la cromatina, en la organización subnuclear de algunas regiones genómicas y en patrones de la metilación del ADN. Las proteínas PcG son expresadas en la epidermis y sus niveles se modifican durante la diferenciación de los queratinocitos y ante diferentes enfermedades, lo que indica que dicho complejo no sólo regula el proceso de diferenciación celular, sino también participa en la regulación de su proliferación, senescencia y apoptosis.³⁸
Las modificaciones epigenéticas son condiciones intrínsecas esenciales en el contexto de la programación y la reprogramación del fenotipo celular, por medio de la activación o la represión específica de genes que son regulados por los factores de transcripción. La eficiencia de la reprogramación de las iPSC a partir de células somáticas aumenta notablemente en presencia de diferentes agentes que modifican el estado epigenético, como los inhibidores de las ADN-metiltransferasas o de histona-desacetilasas.^4,39


Conclusiones

La diferenciación celular es uno de los procesos celulares fundamentales. Debido a su elevada complejidad, el entendimiento subcelular y molecular de la diferenciación celular se encuentra actualmente en progreso. El análisis de los principales componentes biológicos que participan en su proceso mejora su entendimiento.

Los principales eventos subcelulares y moleculares biológicos que ocurren en el proceso de diferenciación celular corresponden a programas fisiológicos de expresión de los diferentes genes participantes. Cada fenotipo celular requiere de patrones genómicos/epigenómicos específicos que establecen vías /redes de señalización intracelulares específicas. Cuando dichos patrones son modificados, por inducción experimental o por diversas señales patológicas, conducen a la reprogramación celular del fenotipo. Uno de los cambios subfenotípicos en la estructuración, la organización y el funcionamiento celular en estos procesos es la división celular asimétrica.
En los últimos años, el progreso tecnológico-científico en la identificación de las biomarcas epigenéticas relacionadas con la regulación de la expresión génica ha permitido iniciar la comprensión del proceso de diferenciación celular.

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